Genetické testování pro včasnou predikci kardiovaskulárních onemocnění: celogenomové asociační studie a polygenní skóre

Súhrn

Přes zásadní posuny jak ve znalostech, tak v technologických možnostech v oblasti molekulární genetiky jsou stále značné rezervy v jejich aplikaci v klinické praxi. Celogenomové asociační studie detekovaly několik set do té doby neznámých variant spojených s kardiovaskulárním onemocněním (KVO) a jeho rizikovými faktory. Některé z nich ukázaly na nové důležité body v metabolických cestách. Nejsilnější rizikové varianty zvyšují výskyt kardiovaskulárních onemocnění přibližně o 40 % (většina ale „pouze“ o 5–25 %) a podobný efekt je pozorovatelný v případě genetických variant spjatých s rizikovými faktory KVO. Maximální zvýšení hladin cholesterolu je asi o 0,3 mmol/l , u triglyceridů asi o 0,25 mmol/l, u obezity obvykle 300–500 gramů tělesné hmotnosti na jednu rizikovou alelu a v případě kouření se riziko, že se dotyčný stane kuřákem, zvyšuje přibližně o 30 %. V poslední době se směr vývoje ubírá k analýzám řady genetických variant současně a k vytváření polygenních genetických rizikových skóre, která by měla být přesnější pro časnou (ve věku ideálně 18–25 let) predikci onemocnění. Tato skóre využívají buď prostý součet přítomných rizikových alel (nevážené skóre), nebo berou v potaz i sílu vlivu (vážené skóre), vyjadřovanou obvykle pomocí OR (Odds Ratio – poměr šancí), HR (Hazard Ratio – poměr rizik) nebo beta-koeficientu.

Klíčová slova:

celogenomový screening – genetika – kardiovaskulární onemocnění – predikce

Úvod

Aterosklerózou podmíněné kardiovaskulární onemocnění (KVO) patří mezi multifaktoriální civilizační onemocnění s rizikovými faktory jak environmentálními, tak genetickými [1,2]. Environmentální faktory (jako např. nevhodná dieta a nedostatečný pohyb či kouření) vedou k rizikovým faktorům KVO (obezita, diabetes), ale jsou obecně ovlivnitelné, korigovatelné a potenciálně eliminovatelné změnou životního stylu či farmakologickou léčbou.

Genetické faktory (podobně jako je tomu s věkem a pohlavím) oproti tomu korigovat či eliminovat nelze (tedy, teoreticky lze provést genovou terapii, nicméně tento způsob léčby má v oblasti KVO k praktickému využití prozatím daleko). Na druhou stranu, tento fakt nám dává (bohužel do značné míry nevyužívané) možnosti k opravdu včasné detekci rizikových jedinců ohrožených KVO. Přítomnost rizikových alel predikujících KVO (a ideálně i další civilizační onemocnění) lze detekovat v raném věku a cílenou intervencí životního stylu by se dalo onemocnění u části jedinců zcela eliminovat a u části by se dala manifestace posunout do vyššího věku. Jistě by se tak daly ušetřit nemalé prostředky využívané na zdravotní péči.

V současné době známe již asi 15 let kompletní sekvenci lidského genomu [3] (projekty HUGO a Cellera) a teoreticky nám nic nebrání analyzovat veškeré zásadnější genetické varianty a odhadnout individuální rozdíly v genetických predispozicích k onemocněním či k úspěšnosti léčby nebo odhalovat zvýšená rizika nežádoucích vedlejších účinků léků.

Celogenomové screeningy

Celogenomové screenování, a tedy celogenomové asociační studie (GWAs – Genome Wide Association study) s využitím čipových technologií umožňujících současnou analýzu až stovek tisíc jednonukleotidových polymorfizmů (SNPs – Single Nucleotide Polymorphisms) [4–6] zásadním způsobem ovlivnilo naše poznání variant spojených s KVO.

Patrně největší výhodou celogenomového screenování je možnost objevit zcela nové genetické varianty spjaté s onemocněním. To je dáno tím, že na rozdíl od asociačních studií, do nichž byly analyzované varianty vybírány dle znalostí patofyziologie daného onemocnění, jsou všechny GWAs „hypo­thesis free“ [4,5] – analyzované markery jsou rozložené v různé denzitě (dle typu čipu) po celém genomu, bez ohledu na (ne)známou funkčnost analyzovaných variant/úseků.

Několik příkladů zcela nových genů a variant spojených s rizikem KVO a zvýšeným rizikem výskytu rizikových faktorů jsou uvedeny v tab. 1. Patrně nejznámější je gen ovlivňující množství tukové hmoty a obezitu (FTO – FaT mass and Obesity associated gene) [7]. Genem kódovaný protein hraje důležitou roli v epigenetice – ovlivňuje primárně metylaci nukleových kyselin [8]. Zásadní pro rozvoj KVO jsou varianty FTO v prvním intronu genu (které jsou v téměř kompletní vazebné nerovnováze). Přítomnost jedné alely zvýší riziko KVO přibližně o 25 % (a to nezávisle na tradičních rizikových faktorech). Polymorfizmy v FTO jsou navíc spojovány se zvýšeným výskytem řady dalších civilizačních onemocnění, jako je např. obezita, diabetes mellitus 2. typu (DM2T), renální selhání či Alzheimerova choroba.

Dalším „novým“ genem ovlivňujícím riziko KVO je gen pro ANRIL, známější jako „varianty v 9p21 lokusu“ [9]. V době prvních popisů lokusu nebylo jasné, zda v dané oblasti leží vůbec nějaké geny. ANRIL je dlouhá nekódující regulační RNA a podobně jako FTO, má tak primárně regulační úlohu. Varianty v tomto lokusu ovlivňují riziko nejen KVO (jedna riziková alela zvyšuje riziko KVO u bělošské populace až o 35 %), ale i některých typů nádorových onemocnění.

Dalším genem, objeveným v rámci GWAs, je gen pro sortilin, jehož varianty byly opakovaně popsány jako jedny z nej­silnějších determinant plazmatických lipidů. Sortilin se nic­méně podílí i na zánětlivých procesech a vaskulární kalcifikaci [10] a ovlivňuje tak kardiovaskulární riziko několika mechanizmy.

Studie GWAs detekovaly řadu nových, potentnějších variant i v genech dříve analyzovaných v rámci asociačních studií, např. v genech pro APOE, LDL-receptor, lipoproteinovou lipázu nebo HMGCoA reduktázu [2,11–13], tab. 2. Celkem bylo pomocí GWAs detekováno odhadem až několik set variant v mnoha desítkách genů spjatých více či méně signifikantně s rizikem KVO a/nebo se zvýšenými hodnotami rizikových faktorů KVO. Varianty jsou spojeny především s lipidovým metabolizmem, krevním tlakem, zánětem, transkripční regulací genů, vaskulární remodelací či NO-signalizací, nicméně funkce většiny genů objevených prostřednictvím GWAs nebyla v době svého popsání známá [12,13].

Studie GWAs popsaly i několik variant potenciálně spjatých se zvýšeným výskytem nežádoucích vedlejších účinků léčiv, hlavně statinů. Nejznámějším genem je patrně SLCO1B1 transportér [14]. Jeho varianty byly popsány ve spojitosti s rozvojem myopatií při léčbě statiny, nicméně tento vztah zřejmě platí pouze v případě vyšších dávek statinů.

Je popsána i strategie možného využití genů asociovaných s KVO pro zlepšení farmakologických intervencí [15]. Předpokládá se jak využití stávajících medikamentů, používaných v jiných oblastech medicíny, tak i cílené zaměření na určité metabolické cesty usnadňující hledání zcela nových léčiv (a to především mimo oblast lipidového metabolizmu).

Využití genového/genetického skórování

Civilizační onemocnění, KVO nevyjímaje, jsou ze své podstaty polygenní, tj. na jejich vzniku se podílejí varianty celé řady genů, každá s relativně malým účinkem (obvyklé zvýšení rizika je mezi 5–25 %) [6,16,17]. Analýza jediné varianty v jediném genu je tak jistě důležitá, nicméně pro komplexní odhad genetického rizika není dostatečná. Proto se v poslední době (s různým úspěchem) řada skupin věnuje sestavování genetických rizikových skóre (GRS – Genetic Risk Score) [1,6,16,18,19]. Tato skóre využívají současné analýzy a porovnání řady variant v různých genech (obvykle jsou jich jednotky až stovky), jejich výsledky jsou vyjádřeny jako jedna číselná hodnota. Pro charakterizaci se používá buď nevážené, nebo vážené genetické skóre.

Nevážené genetické skóre je ze své podstaty výpočtu jednodušší – jedná se o prostý součet rizikových alel pro daný fenotyp, přítomný u každého jedince (příklad výsledku graf). Nositelé dvou protektivních/neutrálních alel obdrží za každý gen pro výpočet skóre „0“, heterozygoti „1“ a konečně nositelé dvou rizikových alel hodnotu „2“. Výhodou tohoto přístupu je jeho jednoduchost. Nevýhodou pak skutečnost, že hodnoty „0“ „1“ a „2“ jsou pro všechny geny/polymorfizmy identické, bez ohledu na to, že některý polymorfizmus zvyšuje riziko přítomnosti daného onemocnění o 5 % a jiný pak třeba o 30 %. Je třeba mít na paměti, že stejnou hodnotu skóre mohou mít jedinci se zcela odlišnými rizikovými alelami.

Vážené genetické skóre bere v potaz skutečnou rizikovou hodnotu každé analyzované alely. Ta je obvykle počítána jako logaritmus poměru šancí (Odds Ratio – OR), relativního rizika (Relative Risk – RR) nebo poměru rizik (Hazard Ratio – HR) pokud počítáme s kategorickými proměnnými (např. „zdraví“ vs „nemocní“); nebo pomocí beta-koeficientů, pokud počítáme s kontinuálními proměnnými (cholesterol, krevní tlak, hmotnost atd). Takto získané hodnoty se opět sečtou do finálního výsledku. Použití váženého skóre je tak (zdánlivě?) správnější a mělo by mít vyšší výpovědní hodnotu. Nevíme ale, zda přítomnost jedné opravdu nevýhodné alely je opravdu tak riziková jako současná přítomnost sice individuálně slabších alel, ale zasahujících do několika oblastí metabolizmu.

Nicméně – i výpočet váženého rizikového skóre má svá úskalí a riziko zkreslení a nepřesností. Pro výpočet OR či RR jsou obvykle použity skupiny starších pacientů a kontrol. Dané hodnoty tak budou částečně zkresleny věkem vyšetřených jedinců a doprovázejícími rizikovými faktory vnějšího prostředí. V klinické praxi bychom ale měli využívat analýzy genetických skóre pro odhad rizika onemocnění již v raném věku (18–25 let?) tak, aby bylo možné detekované jedince se zvýšeným genetickým rizikem cíleně, včas a intenzivněji intervenovat ať již doporučeními ke změně životního stylu či farmakologicky, zařadit do programu časných a četnějších preventivních prohlídek apod. Pro tyto účely se prostý součet rizikových alel zdá být dostatečný.

Oba přístupy však mají svou slabinu – počítají s prostou sumací rizik jednotlivých variant. Je ale velice pravděpodobné, že ve skutečnosti nebude model GRS aditivní, ale že mezi polymorfizmy bude docházet k interakcím [19]. Tedy zjednodušeně se vliv určitých alel může násobit, a efekty jiných se naopak mohou vzájemně vyrušit. Tyto interakce mohou pochopitelně probíhat i v souvislosti se životním stylem a mohou se lišit mezi muži a ženami.

V současnosti existuje celá řada studií analyzujících genové skóre v souvislosti s predikcí KVO, s různými a kontroverzními výsledky [17,20–22]. Bohužel valná většina těchto studií se snaží zjistit, co může genetická predisposice přinést v odhadu rizika nad rámec odhadů vycházejících z tradičních rizikových faktorů. Jak je ale již zmíněno výše, predikce GRS by ideálně měla pomoci najít opravdu mladé jedince ohrožené KVO dříve, než se u nich tradiční rizikové faktory vůbec objeví.

Analýza genetického skóre se intenzivně diskutuje např. v souvislosti s familiární hypercholestrolemií (FH; onemocnění způsobené mutacemi primárně v LDL-receptoru, APOB či PCSK9). Ukázalo se, že kumulace běžných „cholesterol zvyšujících“ alel vede k fenotypu zvanému polygenní FH, který je klinicky nerozlišitelný od monogenní FH [16]. Analýzy UK Biobank ukázaly, že GRS je užitečný nástroj k detekci jedinců ohrožených KVO ve věku pod 40 (muži) nebo 45 (ženy) let [23]. Téměř 3násobné zlepšení predikce vzniku DM2T bylo dosaženo využitím GRS složeného z více než 60 běžných variant [24].

Zásadní fenotypové rozdíly by teoreticky mohly být pozorovatelné i v případě obezity. Kumulace výhradně negativních alel 32 genů (v čistě aditivním modelu) by mohla znamenat o 25 kg vyšší tělesnou hmotnost v porovnání s jedinci nesoucími naopak pouze protektivní alely [25].

Přenos populačních dat do individualizované predikce

Přenos výsledků populačních studií do individualizované predikce bohužel není tak snadný, jak by se mohlo zdát. Což ale platí nejen pro genetické rizikové faktory, ale i pro všechny biochemické parametry, které ve vztahu ke KVO analyzujeme a léčíme. Pro správné využití výsledků genetických analýz je tedy třeba replikovat výsledky screeningů na každé dané populaci, je řada variant, které mají např. výrazně etnicky specifický výskyt a vliv [26], ale význam variant a velikost jejich vlivu se může lišit i mezi populacemi stejného etnika. I zde platí, že zvýšené riziko KVO např. o 70 % může ve výsledku stále znamenat, že značná část jedinců s tímto rizikovým genetickým faktorem vůbec neonemocní schéma.

Nelze ani opomenout výše zmíněné interakce mezi geny a prostředím. Především nutriční intervence by měly profitovat z implementací výsledků GWAs do individualizovaných doporučení [27–29].

Závěr

V současné době máme dostatečné znalosti o genetické determinaci KVO a jejich rizikových faktorů, založené na prosté sekvenci DNA. Využití v klinické praxi je však mizivé. Spíše než další GWAs lze v současnosti očekávat objevení relativně málo četných, ale důležitých variant metodami celogenomového nebo exomového sekvenování.

Autor je podporován projektem MZ ČR – RVO („Institut klinické a experimentální medicíny – IKEM, IČ 00023001“) a grantem programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. NV18–01–00046. Veškerá práva podle předpisů na ochranu duševního vlastnictví jsou vyhrazena.

 Ing. Jaroslav A. Hubáček, CSc., DSc. 

jahb@ikem.cz 

www.ikem.cz

Doručeno do redakce | Doručené do redakcie | Received 16. 3. 2020

Přijato po recenzi | Prijaté po recenzii | Accepted 8. 4. 2020