Heat shock protein 70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody

Amniotic fluid heat shock protein 70 concentration in preterm premature rupture of membranes

Objective:
The purpose of this study was to determinate the changes of amniotic fluid HSP 70 concentrations in patiens with preterm premature rupture of the membranes, and in the presence of intraamniotic infection and histological changes of inflammations.

Design:
Prospective study.

Setting:
Department of Obstetrics and Gynecology Medical Faculty Charles University Hradec Králové.

Methods:
We studied 30 women between 24 and 36 weeks of gestation with preterm premature rupture of the membranes. Samples of amniotic fluid were collected by transabdominal amniocentesis. These patients were divided into 2 groups. In group 1 were patiens with intraamniotic infection. In group 2 were patiens without intraamniotic infection. Among 76% (35/30) patients placenta were collected and assessed for presence or absence acute inflammatory lesions. HSP70 concentration in amniotic fluid were determined using a sensitive and specific diagnostic kit Hsp 70- ELISA kit manufactered Assay Desings, USA.

Results:
There was no significant difference in the median amniotic fluid HSP70 concentration between patients with preterm rupture of the membranes with IAI and without IAI (patients with IAI: median 5.12 ng/ml, range 3.01-90.37 ng/ml vs. patients without IAI: median 4.68 ng/ml, range 0.58-84.28 ng/ml; p=0.56). There was no significant difference in the median amniotic fluid HSP70 concentration between patients with preterm rupture of the membranes with presence and absence histological of acute inflammatory lesions in the placenta and membranes(patients with presence: median 6.97 ng/ml, range 2.61-90.37 ng/ml vs. patients with absence: median 4.63 ng/ml, range 0.58-84.28 ng/ml; p=0.68).

Conclusion:
Intraamniotic levels HSP70 were not associated with intraamniotic infection and acute inflammatory lessions in the placenta and membranes.

Key words:
HSP70, intraamniotic infection, chorioamnionitis, preterm premature rupture of the membranes.

Autori: M. Kacerovský ¹; J. Tošner ¹; C. Andrýs ² ; M. Drahošová ²; L. Plíšková ³; M. Főrstl ⁴; H. Hornychová ⁵
Pôsobisko autorov: Lékařská fakulta Hradec Králové, Univerzita Karlova, Praha Porodnická a gynekologická klinika FN, Hradec Králové, přednosta doc. MUDr. J. Tošner, CSc. ¹; Ústav klinické imunologie a alergologie FN, Hradec Králové, přednosta prof. RNDr. J. Krejsek, CSc. ²; Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN, Hradec Králové, přednosta prof. MUDr. V. Palička, CSc. ³; Ústav klinické mikrobiologie FN, Hradec Králové, přednosta doc. RNDr. V. Buchta, CSc. ⁴; Fingerlandův ústav patologie FN, Hradec Králové, přednosta prof. MUDr. A. Ryška, Ph. D. ⁵
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2009; 74(2): 85-91
Kategória: Původní práce

Súhrn

Cíl studie:
Cílem práce bylo zjistit změny HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody s a bez přítomnosti intraamniální infekce. A také, lze-li využít HSP 70 jako potencionální biomarker intraamniální infekce z plodové vody.

Typ studie:
Prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Lékařská fakulta Hradec Králové, Univerzita Karlova Praha. Porodnická a gynekologická klinika FN Hradec Králové.

Metodika:
U 30 pacientek s předčasným odtokem plodové vody mezi 24. až 36. týdnem gravidity byl odebrán vzorek plodové vody transabdominální amniocentézou. Pacientky byly rozděleny do dvou skupin: bez a s přítomností intraamniální infekce. U 76 % (23/30) pacientek byla histologicky vyšetřena placenta a plodové obaly na přítomnost akutních zánětlivých změn. HSP70 v plodové vodě byl stanoven ELISA technikou pomocí komerční soupravy Hsp70- ELISA kit firmy Assay Designs, USA.

Výsledky:
Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek s IAI a bez IAI (pacientky s IAI: medián 5,12 ng/ml, rozsah 3,01-90,37 ng/ml vs. pacientky bez IAI: medián 4,68 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,56). Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek se histopatologickými zánětlivými změnami a bez nich (pacientky se zánětem: medián 6,97 ng/ml, rozsah 2,61-90,37 ng/ml vs. pacientky bez zánětu: medián 4,63 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,68).

Závěr:
Hladina HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody a intraamniální infekcí není signifikantně vyšší než u pacientek bez intraamniální infekce.

Klíčová slova:
HSP70, intraamniální infekce, chorioamnionitida, předčasný odtok plodové vody.

ÚVOD

Předčasný porod je stále závažným problémem, který má dopad nejen medicínský, ale i rodinný, sociální a ekonomický. Jeho frekvence se v posledních letech příliš nemění a stále se pohybuje kolem 6 %. Předčasný odtok plodové vody (PROM), definovaný jako porušení integrity plodových obalů s odtokem plodové vody předcházejícím minimálně 2 hodiny nástup děložní činnosti, komplikuje zhruba 4–7 % všech porodů. Je přímo spojen s nižším gestačním stářím plodů, vzestupem perinatální a maternální morbidity. Přestože existuje vztah mezi PROM, infekcí, cervikální inkompetencí a nízkým socioekonomickým statusem rodičky, je jeho přesná etiologie nejasná [15]. V případě infekcí podmíněné PROM jsou spouštěcím mechanismem porodu proinflamatorní cytokiny [25].

Heat shock proteiny (HSPs) se vyskytují téměř v každé subcelulární struktuře (jádro, mitochondrie, endoplasmatické retikulum a cytoplazma) všech buněčných typů od prokaryotických k eukaryotickým buňkám [24]. HSPs regulují intracelulární procesy udržující homeostázu v průběhu procesu buněčné proliferace a diferenciace. Fungují jako tzv. chaperony, tedy speciální proteiny, jež v buňce pomáhají k dosažení optimální terciální struktury proteinů, které po translaci opouštějí velkou podjednotku ribozomu [12]. Ke zvýšení jejich intracelulární exprese dochází při expozici stresovým stimulům, jako jsou hypoxie, ischémie a vysoká teplota [35]. Podle molekulárních hmotností je dělíme do několika skupin. Mezi nejlépe definované patří heat shock protein 70 (HSP70) [27]. HSPs se podílejí na specifické i nespecifické (přirozené) imunitní odpovědi. Jejich výskyt v extracelulárním kompartmentu odráží tkáňové poškození nebo tzv. nebezpečné „danger“ signály [32]. HSPs uvolněné z nekrotických buněk umožňují aktivaci monocytů pomocí různých receptorů lokalizovaných na povrchu buněk (CD 14, CD 40, Toll-like receptor a jiné) [21], stimulujících produkci proinflamatorních cytokinů [34]. Také se podílejí na zpracování antigenu v antigen prezentujících buňkách, a tím významně ovlivňují specifickou imunitní odpověď zprostředkovanou T lymfocyty [42]. HSPs se mohou také uvolnit z buněk bez nekrotických změn [8]. Například mononukleární buňky v periferní krvi mohou exocytózou uvolňovat HSPs i bez přítomnosti detekovatelné buněčné smrti [14]. HSP60 [20] a HSP70 [22] jsou přítomny i v séru zdravých lidí. Zvýšená hladina HSP70 v periferní krvi byla zjištěna u pacientek s preeklampsií [9]. Hladina HSP70 byla vyšší u těhotných porodivších předčasně, v porovnání s těmi, které porodily v termínu [9]. Vzestup exprese mRNA HSP70 byl nalezen v buněčných kulturách plodových obalů vystavených endotoxinové stimulaci [17]. Komplexy HSP70 antigen-protilátka byly detekovány v placentách předčasně narozených plodů [41]. Zatím jen dvě recentní práce se věnují HSP 70 a protilátkám HSP 70 v plodové vodě [10, 13].

Cílem práce bylo zjistit změny hladin HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody s a bez přítomnosti intraamniální infekce. A také je-li možné využít HSP 70 jako potenciální biomarker intraamniální infekce z plodové vody.

SOUBOR A METODIKA

Do studie bylo zařazeno 30 těhotných žen v gestačním týdnu 23+1 až 36+6 přijatých v období od března 2004 do ledna 2008 na porodní sál Porodnické a gynekologické kliniky Fakultní nemocnice Hradec Králové s předčasným odtokem plodové vody (PROM). Vyloučeny byly pacientky s vícečetným těhotenstvím. Předčasný odtok plodové vody byl potvrzen klinickým vyšetřením, Temešváryho zkouškou a/nebo PROM testem. Vzorek plodové vody byl odebrán za sterilních kautel transabdominální amniocentézou pod ultrazvukovou kontrolou. Vzorek plodové vody byl ihned transportován do laboratoře k provedení aerobní, anaerobní kultivace a stanovení genitálních mykoplazmat. Vzorek určený ke stanovení HSP70 byl centrifugován, supernatant byl až do analýzy uchován při –80 °C. U 23 z těchto pacientek byla po porodu odeslána placenta a plodové obaly k histologickému vyšetření. Všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas před odběrem vzorku. Studie byla schválena lokální etickou komisí.

Statistika

Statistické analýza výsledků byla provedena pomocí Fischerova exaktního testu při použití 5% hladiny významnosti. Analýza byla provedena pomocí programu Statistica Cz 8.0 (StatSoft CR, s.r.o., Praha, Česká Republika).

Stanovení HSP 70 v plodové vodě

HSP70 v plodové vodě byl stanoven ELISA technikou pomocí komerční soupravy Hsp70- ELISA kit firmy Assay Designs, USA.

Stanovení genitálních mykoplazmat v plodové vodě

Z plodové vody byla provedena izolace DNA pomocí komerčního kitu firmy QIAGEN (QIAamp DNA Mini Kit-Tissue Protocol). Přímá detekce DNA Ureaplasma spp. a Mycoplasma hominis byla provedena komerční multiplex real-time polymerázovou řetezovou reakcí, umožňující stanovení obou mikroorganismů v jedné zkumavce.

Klinické definice

Intraamniální infekce (IAI) byla definována jako přítomnost mikroorganismů v plodové vodě, s výjimkou nálezu Staphylococcus koaguláza negativní, považovaného za kožního saprofyta. Chorioamnionitida byla definována jako přítomnost akutních zánětlivých změn v choriové plotně placenty. Funisitidou byla označena přítomnost neutrofilní infiltrace ve stěně pupečníkových cév, nebo whartonském rosolu. Amnionitida jako přítomnost akutních zánětlivých změn v plodových obalech.

VÝSLEDKY

Demografické charakteristiky

Průměrný věk pacientek byl 30 let (rozsah 17–40 let). Průměrné gestační stáří bylo 32 týdnů. Medián gestačního stáří pacientek s PROM a intraamniální infekcí byl nižší než pacientek s PROM bez intraamniální infekce (viz graf 1) Rozdíl však nebyl signifikantně významný (32 versus 35, p=0,07). Taktéž medián gestačního stáří pacientek s PROM a histopatologickými známkami zánětu na placentě či plodových obalech byl také nižší ve srovnání s pacientkami bez zánětlivých změn (viz graf 2). Rozdíl také nebyl statisticky významný (32 versus 35, p=0,234).

Změny hladin HSP70 v plodové vodě a intraamniální infekce

Intraamniální infekce byla verifikována u 30 % pacientek s PROM (9/30). V 7 případech byl nález genitálních mykoplazmat v plodové vodě (6krát Ureaplasma urealyticum, jednou Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis) a u tří pacientek byla pozitivní aerobní a anaerobní kultivace plodové vody (jednou Enterococcus species, jednou GBS a jednou Fusobacterium species se současným nálezem Ureaplasma urealyticum). Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek s IAI a bez IAI (pacientky s IAI: medián 5,12 ng/ml, rozsah 3,01-90,37 ng/ml vs. pacientky bez IAI: medián 4,68 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,56). Viz graf 3. Nejvyšší hladina HSP70 (90,37 ng/ml) byla v případě nálezu Mycoplasma hominis a Ureaplasma urealyticum v plodové vodě.

Změny hladin HSP70 v plodové vodě a histopatologické zánětlivé změny na placentě a plodových obalech

U 23 pacientek byly dostupné výsledky histopatologického vyšetření placenty a plodových obalů. V 11 případech jsme zde nalezli zánětlivé změny (6krát amnionitidu, 4krát chorioamnionitidu a jednou funisitidu). Nebyl nalezen signifikantní rozdíl v hladinách HSP70 mezi skupinami pacientek s histopatologickými zánětlivými změnami a bez nich (pacientky se zánětem: medián 6,97ng/ml, rozsah 2,61-90,37 ng/ml vs. pacientky bez zánětu: medián 4,63 ng/ml, rozsah 0,58-84,28 ng/ml; p=0,68), viz graf 4.

DISKUSE

HSPs byly objeveny více než před 30 lety a dostaly jméno podle toho, že exprese této skupiny proteinů může být indukována vysokou teplotou [31]. Protein HSP70 kóduje minimálně 17 genů, které jsou lokalizované na různých chromozomech [27]. HSP exprese je zvýšena působením rozličných faktorů jako např. environmentální vlivy (teplo, ultrafialové záření [36]), aminokyseliny [3], těžké kovy [19], fyziologické stavy (růstové faktory, buněčná diferenciace, hormonální stimulace) [30], patologické stavy (virové, bakteriální, parazitární infekce) [28], horečka [11], zánět [23], ischémie [16] a autoimunitní stavy [4]. HSPs fungují jako intracelulární molekulární chaperony regulující správnou prostorovou strukturu proteinů, transport, translokaci a translaci proteinů. Podporují též nápravu buněčné aktivy po působení stresového stimulu [6]. Navíc HSPs mají anti-apoptotickou aktivitu díky inhibici caspáz (caspase – cysteine aspartic acid protease), které patří do skupiny cysteinových proteáz hrajících esenciální roli v indukci programované buněčné smrti [29]. Vzestup exprese intracelulárního HSP70 v monocytech a makrofázích po endotoxinové stimulaci inhibuje produkci TNFα [6]. Tepelný šok z okolního prostředí, jež vede k vzestupu exprese HSP70 snižuje na zvířecích modelech sepsí indukovanou orgánovou dysfunkci a mortalitu [26]. Polymorfismus HSP70 genu byl popsán u pacientů s Parkinsonovou nemocí, což podporuje teorii protektivní úlohy HSP70 v případě rizika neuronálního poškození u degenerativních onemocnění [33].

Rodina HSP70 genů patří mezi kandidátní geny spojené s lidskou dlouhověkostí [6]. HSPs jsou uvolňovány extracelulárně jak pasivními (nekrotické buňky), tak aktivními mechanismy (viabilní buňky) [1]. Extracelulární HSPs mohou stimulovat komponenty nespecifického imunitního systému nezávisle na jejich chaperonové funkci. Pro jejich dvojí roli se někdy používá termín „chaperokin“ [18]. Některé studie potvrzují, že HSP70 utilizuje TLR-2 (receptor pro gram pozitivní bakterie) a TLR-4 (receptor pro gramnegativní bakterie) k indukci transkripčního faktoru NFκB a vyvolává proinflamatorní odpověď za pomoci CD14 [34]. HSP70 byl nalezen v plodové vodě u 57 % těhotných žen během druhého trimestru a u 91% žen s porodem v termínu [13]. To podporuje domněnku, že je do plodové vody uvolňován i za fyziologických podmínek. Hladiny HSP70 jsou, zřejmě díky své funkci „chaperokinu“, uvnitř amniální dutiny během růstu a vývoje plodu [13], vyšší v termínu porodu, oproti druhému trimestru. HSP70 v mateřském séru během gravidity byl cílem několika prací s rozdílnými výsledky. Zatímco Molvarec a kol. udává vzestup koncentrace v průběhu těhotenství [35], Fukushima a kol. nenalezl signifikatní změny v sérových koncentracích mezi jednotlivými trimestry gravidity [15]. Medián sérových koncentrací HSP70 je v graviditě vyšší než mimo graviditu. Chaiworapongsa a kol. ve své recentní práci uvádí, že vzestup mediánu HSP70 v plodové vodě žen v termínu porodu je jen o něco nižší než u předčasného porodu s intraamniální infekcí (IAI) ( 60,7 ng/ml a 82,9 ng/ml) [19].

Vzestup koncentrace v termínu porodu je zřejmě způsoben zvýšením exprese HSP70 mRNA v myometriu a tento intracelulární HSP70 se váže na progesteronový receptor. Funguje tedy jako korepresor tohoto receptoru a blokuje vazbu progesteronu [36, 37, 38]. I tak přesná příčina tohoto zvýšení zůstává nejasná. Je také možné, že extracelulární HSP70 (plodová voda je extracelulární kompartment) přímo stimuluje produkci prostaglandinů vedoucí k porodu, neboť HSP70 indukuje expresi proteinu enzymu cyklooxygenázy a prostaglandinu E₂ v endoteliálních buňkách umbilikální žíly [39]. Nejvyšší hodnotu HSP70 (90,37 ng/ml) v našem souboru měla pacientka s nálezem Mycoplasma hominis v plodové vodě. Tato spojitost již byla v minulosti publikována [13]. Chaiworapongsa nalezl u pacientek s intraamniální infekcí signifikantně vyšší medián než u pacientek bez infekce. V našem souboru jsme však nenalezli signifikantní rozdíl mezi mediány HSP70 u pacientek s IAI, či bez ní. Také jsme nenalezli rozdíl mezi hladinami HSP70 u pacientek s histopatologickým průkazem zánětu a pacientkami bez zánětlivých změn v placentě, pupečníku a plodových obalech. Naše výsledky jsou podpořeny závěry několika prací. Divers a kol. nenalezl žádné změny proteinové exprese HSP70, HSP60 a HSP90 v trofoblastu bazální plotny a decidui žen porodivších předčasně, ve srovnání s těhotnými porodivšími v termínu porodu [7]. Ziegert a kol.u pacientek s předčasným porodem detekoval v placentární tkáni komplexy HSP70 antigen-protilátka, ale ne samotné HSP70 [41]. Komplexy HSP70 antigen-protilátka jsou potentními induktory produkce TNFα [39]. K podobným závěrům dospěl ve své recentní práci Gelber. V plodové vodě hladiny autoprotilátek proti HSP70 ve třídě IgG, ale ne koncentrace HSP70, pozitivně korelovaly s hladinami TNFα a interferonu γ [18]. HSP70 antigen je přítomen v amniální dutině i za fyziologického stavu. V reakci na patologický stav dojde k produkci autoprotilátek proti HSP70 ve třídě IgG těhotnou ženou. Ty se následně transportují skrze placentu a zde mohou reagovat s HSP70 antigenem. Vzniklý komplex poskytuje senzitivní mechanismus velmi rychlé aktivace intraamniální imunity v reakci na potencionální ohrožení. Je otázkou, zdali tato odpověď je přínosná, či destruktivní [37]. Pravděpodobně závisí na rozsahu aktivace imunitního systému [18].

Hladinám HSP70 v plodové vodě u pacientek s PROM se zatím věnuje jen jedna zcela recentní práce [13]. Naše výsledky jsou v rozporu se závěrem této práce. Domníváme se, že vypovídací hodnotu o přítomnosti intraamniální infekce má zřejmě jen koncentrace komplexu HSP70 antigen-protilátka a ne jen samotná hladina HSP70.

ZÁVĚR

Koncentrace HSP70 v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody a intraamniální infekcí není signifikantně vyšší než u pacientek bez intraamniální infekce. Změny koncentrací HSP70 v plodové vodě nelze u pacientek s PROM využít jako biomarker intraamniální infekce

Vznik této práce byl podpořen grantem GAČR 304/09/0494

MUDr. Marian Kacerovský

Porodnická a gynekologická klinika

FN a LF Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

E-mail: kacermar@fnhk.cz

Zdroje

1. Area, A. Initiation of the immune response by extracellular HSP72. Curr Immunol Rev, 2006, 2, p. 209-215.

2. Bagchi, MK., Tsai, SY., Tsai, MJ., et al. Progesterone enhanced target gene transcription by receptor free of heat shock proteins hsp90, hsp56 and hsp70. Mol Cell Biol, 1991, 11, p. 4998-5004.

3. Beckmann, RP., Mizzen, LE., Welch, WJ. Interaction of Hsp 70 with newly synthesized proteins: Implications for protein folding and assembly. Science, 1990, 248, p. 850-854.

4. Cohen, IR. Autoimmunity to chaperonins in the pathogenesis of arthritis and diabetes. Ann Rev Immunol, 1991, 9, p. 567-589.

5. DeMarko, AM., Beck, CA., Onate, SA., et al. Dimerization of mammalian progesterone receptors occurs in the absence of DNA and is related to the release of the 90-kDA heat shock protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88, p. 72-76.

6. Ding, XZ., Fernandez-Prada, CM., Bhattacharjee, AK., Hoover, DL. Over-expression of hsp-70 inhibits bacterial lipopolysaccharide-induced production of cytokines in human monocyte derived macrophages. Cytokine, 2001, 16, p. 210-219.

7. Divers, MJ., Bulmer, JN., Miller, D., Lilford, RJ. Placental heat shock proteins: No immunohistochemical evidence for a differential stress response in preterm labour. Gynecol Obstet Invest, 1995, 40, p. 236-243.

8. Fleshner, M., Johnson, JD. Endogenous extracellular heat shock protein 72. Int J Hypertermia, 2005, 21, p. 457-471.

9. Fukushima, A., Kahawara, H., Isurugi, C., et al. Changes in serum levels of heat shock protein 70 in preterm delivery and pre-eclampsia. J Obstet Gynaecol Res, 2005, 31, p. 72-77.

10. Gelber, SE., Bongiovanni, AM., Jean-Pierre, C., et al. Antibodies to the 70 kDa heat shock protein in midtrimester amniotic fluid and intraamniotic imunity. Am J Obstet Gynecol, 2007, 197, p. 278e1-278e4. .

11. Gosgrove, JW., Brown, IR. Heat shock protein in mammalian brain and other organs after a physiologically relevant increase in body temperature induced by D-lysergic acid diethylamide. Proc Natl Acad Sci USA, 1983, 80, p. 569-573.

12. Haslbeck, M. Hsps and their role in the chaperone network. Cell Moll Life Sci, 2002, 59, p. 1649-1657.

13. Chaiworapongsa, T., Erez, O., Kusanovic, JP., et al. Amniotic fluid heat shock protein 70 concentration in histologic chorioamnionitis, term and preterm parturition. J Maternal-Fetal Neonatal Med, 21, 7, p. 449-461.

14. Johnson, JD., Fleshner, M. Releasing sinals, secretory pathways, and imunne function of endogenous extracellular heat shock protein 72. J Leukoc Biol, 2006, 79, p. 425-434.

15. Kacerovský, M., Boudyš, L. Předčasný odtok plodové vody a Ureaplasma urealyticum. Čes Gynek, 2008, 78, p. 154-159.

16. Lee, WC., Wen, HC., Chang, CP., et al. Heat shock protein 72 overexpression proteins against hyperthermia, circulatory shock, and cerebral ischemia during heatstroke. J Appl Physiol, 2006, 100, p. 2073-2082.

17. Menon, R., Gerber, S., Fortunato, SJ., Witkinn, SS. Lipopolysacharide stimulation of 70 kiloDalton heat shock protein messenger ribonucleic acid production in cultured human fetal membranes. J Perinat Med, 2001, 29, p. 133-136.

18. Molvarec, A., Rigo, J. jr., Nagy, B., et al. Serum heat shock protein 70 levels are decreased in normal human pregnancy. J Reprod Immunol, 2007, 74, p. 163-169.

19. Ovelgonne, JH., Souren, JE., Wiegant, FA., et al. Relationship between kadmium-induced expression of heat shock genes, inhibition of protein synthesis and cell death. Toxicology, 1995, 99, p. 19-30.

20. Pockley, AG., Bulmer, J., Hanks, BM., Wright, BH. Identification of human heat shock protein 60 and anti-HSP60 antibodies in the peripheral circulation of normal individuals. Cell Stress Chaperones, 1999, 4, p. 29-35.

21. Pockley, AG. Heat shock proteins as regulator of the immunne response. Lancet, 2003, 362, p. 469-476.

22. Pockley, AG., Sheperd, J., Corton, JM. Detection of heat shock protein 70 and anti-Hsp 70 antibodies in the serum of normal individuals. Immunol Invest, 1998, 27, p. 367-377.

23. Polla, BS. A role for heat shock protein in inflammation? Immunol Today, 1988, 9, p. 134-137.

24. Robert, J. Evolution of heat shock protein and imunity. Dev Comp Immunol, 2003, 27, p. 449-464.

25. Romero, R., Gomez, R., Chaiworapongsa, T., et al. The role of infection in preterm labour and delivery. Paediatr Perinatal Epidemiol, 2001, 15, p. 41-56.

26. Ryan, AJ., Flanagan, SW., Moseley, PL. Gisolfi, CV. Acute heat stress protects rats against endotoxin shock. J Appl Physiol, 1992, 73, p. 1517-1522.

27. Singh, R., Kolvraa, S., Rattan, SI. Genetics of human longevity with emphasis on the relevance HSP70 as candidate genes. Front Biosci, 2007, 12, p. 4504-4513.

28. Stewart, GR., Young, DB. Heat shock proteins and the host patogen interaction during bacterial infection. Curr Opin Immunol, 2004, 16, p. 506-510.

29. Thornberry, N., Caspases, A. Key mediators of apoptosis. Chem Biol, 1998, 5, p. 97-103.

30. Ting, LP., Tu, CL., Chou, CK. Insulin induced expression of human heat shock protein gene hsp 70. J Biol Chem, 1989, 264, p. 3404-3408.

31. Tissieres, A., Mitchell, HK., Tracy, UM. Protein synthesis in solivary gland of Drosophila melanogaster. Relation to chromosome puffs. J Mol Biol, 1974, 84, p. 389-398.

32. Todryk, SM., Gough, MJ., Pockley, AG. Facets of heat shock protein 70 shows immunotherapeutic potential. Immunology, 2003, 110, p. 1-9.

33. Tuohimaa, P., Pekki, A., Blauer, M., et al. Nuclear progesterone receptor is mainly heat shock protein 90- free in vivo. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90, p. 5848-5852.

34. Vabulas, RM., Ahmad-Nejad, P., Ghose, S., et al. HSP70 as endogenous stimulus of the Toll/interleukin 1 receptor signal pathway. J Biol Chem, 2002, 277, p. 107-115.

35. Welch, WJ. Mammalian stress response: Cell fysiology, structure/fiction of stress proteins, and implications for medicine and disease. Physiol Rev, 1992, 72, p. 1063-1081.

36. Williams, KJ. Landgraf, BE., Whiting, NL., Zurlo, J. Correlation betweens the induction of heat shock protein 70 and enhanced viral reactivation in mammalian cells treated with ultraviolet light and heat shock. Cancer Res, 1998, 49, p. 2735-2742.

37. Wu, T., Tanguay, RM. Antibodies against heat shock proteins in environmental stresses and diseases: friend or foe? Cell Stress Chaperones, 2006, 11, p. 1-12.

38. Wu, YR., Wang, CK., Chen, CM., et al. Analysis of heat shock protein 70 gene polymorphisms and the risk of Parkinson@s disease. Hum Genet, 2004, 114, p. 236-241.

39. Yokota, S., Minota, S., Fuji, N. AntiHSP autoantibodies enhance HSP induced pro-inflamatory cytokine production in human monocyt cells via Toll-Like receptors. Int Immunol, 2006, 18, p. 573-580.

40. Zhang, F, Hackett, NR., Lam, G., et al. Green fluorescent protein selectively induces HSP70 up-regulation of COX2 expresion in endothelial cells. Blood, 2003, 102, p. 2115-2121.

41. Ziegert, M., Witkin, SS., Sziller, I., et al. Heat shock proteins and heat shock protein antibody complexes in placenta tissues. Infect Dis Obstet Gynecol, 1999, 7, p. 180-185.

42. Zugel, U., Kaufmann, SH. Immunne response against heat shock proteins in infectious disease. Immunobiology, 1999, 201, p. 22-35.