#PAGE_PARAMS# #ADS_HEAD_SCRIPTS# #MICRODATA#

Analytické hodnotenie mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-izo-propylamónium]fumarátu


Analytical evaluation of mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-isopropyl-ammonium]fumarate

The present paper deals with a complex spectral and physicochemical evaluation of mono[{3-[4--(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-isopropylammonium]fumarate, a potential ultra­short acting ß1-blocker. The identity of the substance under study (labelled as UPB-1) was confirmed by 1H- and 13C-NMR spectra as well as IR spectrometry. The determined fundamental physicochemical characteristics included the determination of the melting point, solubility in a spectrum of solvents, verification of purity (adsorption thin-layer chromatography), determination of surface activity (Traube’s stalagmometric method), acidobasic characteristics (pKa value by means of alkalimetric titration), determination of log ε values using spectrophotometry in UV/VIS region, as well as the evaluation of the effect of acid and basic media on the stability of the substance under the study. Other experimentally determined parameters were lipohydrophilic characteristics essayed by means of RP-HPLC (log k’), and the shake-flask method was employed to determine the values of the partition coefficients Pexp (resp. log Pexp) in different lipohydrophilic media. On the basis of log Pexp- data, the ability of the substance to penetrate the hematoencephalic barrier was predicted. To determine the UPB-1 content, RP-HPLC (reversed-phase HPLC) method of the internal standard and UV/VIS spectrophotometry at the wavelength of 260 nm (aqueous medium) and 258 nm (methanol medium) were used.

Key words:
ß1-blockers – analytic evaluation – spectral and physicochemical characte­ristic – content determinbation


Autori: Ivan Malík 1;  Fils Andriamainty 1;  Eva Sedlárová 1;  Jozef Čižmárik 1;  Jana Gališinová 1;  Petr Mokrý 2;  Jozef Csöllei 2;  Janka Karlovská 3;  Miloš Lukáč 4
Pôsobisko autorov: Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra farmaceutickej chémie 1;  Veterinární a farmaceutická univerzita v Brně, Farmaceutická fakulta, Ústav chemických léčiv 2;  Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Laboratórium NMR 3;  Univerzita Komenského v Bratislave, Farmaceutická fakulta, Katedra chemickej teórie liečiv 4
Vyšlo v časopise: Čes. slov. Farm., 2011; 60, 84-93
Kategória: Původní práce

Súhrn

Predmetom prezentovanej práce je komplexné spektrálne a fyzikálno-chemické hodnotenie mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-izopropylamónium]fumarátu, potenciálneho ultrakrátko pôsobiaceho ß1-blokátora. Totožnosť študovanej substancie (pracovne označenej ako UPB-1) bola potvrdená 1H- a 13C-NMR spektrami ako aj IR spektrometriou. Medzi stanovené základné fyzikálno-chemické charakteristiky patrilo určenie teploty topenia, rozpustnosti v spektre rozpúšťadiel, overenie čistoty (adsorpčná chromatografia na tenkej vrstve), určenie povrchovej aktivity (Traubeho stalagmometrická metóda), acidobázické charakteristiky (hodnota pKa pomocou alkalimetrickej titrácie), určenie hodnôt log ε s využitím spektrofotometrie v UV/VIS oblasti, ako aj hodnotenie vplyvu kyslého a zásaditého prostredia na stabilitu študovanej látky. Ďalšími experimentálne stanovenými parametrami boli lipohydrofilné charakteristiky pomocou RP‑HPLC (log k’), shake flask metódou stanovené hodnoty rozdeľovacích koeficientov Pexp (resp. log Pexp) v rôznych lipohydrofilných prostrediach. Na základe log Pexp- dát sa predikovala schopnosť látky prechádzať cez hematoencefalickú bariéru. Pre stanovenie obsahu UPB-1 sa použila RP‑HPLC (reversed-phase HPLC) metóda vnútorného štandardu a UV/VIS spektrofotometria pri vlnovej dĺžke 260 nm (vodné prostredie) a 258 nm (prostredie metanolu).

Kľúčové slová:
ß1-blokátory – analytické hodnotenie – spektrálna a fyzikálno-chemická charakteristika – stanovenie obsahu

Úvod

Významné postavenie a s tým súvisiaci benefit ß-blokátorov (ßB) v terapii hypertenzie, akútneho myokardiálneho infarktu ako aj chronického zlyhávania srdca je dlhodobo známe. ß1-Adrenergné antagonisty (ß1-AA), ako napríklad propranol, sú preto využívané na kontrolu tachyarytmií a hypertenzie na jednotkách intenzívnej starostlivosti. ßB sú pomerne bezpečné, relatívne lacné a účinné v monoterapii alebo aj v kombinácii s diuretikami, antagonistami vápnikových kanálov alebo s α-blokátormi. Konvenčné ßB sú však kontraindikované u pacientov s astmatickým ochorením a/alebo chronickou obštrukčnou chorobou pľúc kvôli súčasnému ß2-blokujúcemu pôsobeniu, čo spôsobuje bronchokonstrikciu 1–3). Okrem toho je ich používanie spojené aj s pomerne širokým spektrom nežiaducich účinkov – bradykardiou, hypotenziou, periférnou vazokonstrikciou, insomniou alebo aj depresiou. Preto sa projekcia nových potenciálnych ßB sústreďuje na štruktúry s „unikátnymi“ metabolickými a farmakokinetickými vlastnosťami s polčasom eliminácie menej ako 10 minút. Zámerom je teda eliminovať už spomínané nežiaduce účinky relatívne dlho pôsobiacich (rádovo v hodinách) ßB s cieľom dosiahnuť a udržať ich klinickú účinnosť 4). Prvým extenzívne študovaným a používaným ultrakrátko pôsobiacim ßB bol kardioselektívny esmolol (obr. 1) s polčasom eliminácie 9 minút 5), ktorý podlieha rýchlej hydrolýze nezávislej od renálnych alebo hepatálnych funkcií, čo je významným aspektom v prípadoch veľmi vážne chorých pacientov s multiorgánovým systémovým zlyhaním 5). Landiolol (obr. 1), ďalší ultrakrátko pôsobiaci ßB, je rýchlo metabolizovaný sérovými pseudocholínesterázami a karboxyestrázami v pečeni s polčasom eliminácie 4 min 6). Neselektívny ultrakrátko pôsobiaci ßB flestolol (pracovný názov ACC-9089 (obr. 1), ktorý je rýchlo metabolizovaný na kyselinu o-fluórbenzoovú plazmatickými esterázami, má polčas eliminácie približne 6,5 mi­nút 7).

Obr. 1. Chemická štruktúra najznámejších ultrakrátko pôsobiacich ß-blokátorov
Chemická štruktúra najznámejších ultrakrátko pôsobiacich ß-blokátorov

Predkladaná práca, analytické hodnotenie mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-izopropylamónium]fumarátu (pracovne označeného ako UPB-1), ktoré bolo doplnené aj o niektoré dôležité a potrebné experimentálne stanovené charakteristiky kyseliny p-hydroxybenzoovej (pracovne označenej ako p-OHBA) ako vstupného reaktantu pri syntéze látky UPB-1, má za cieľ rozšíriť spektrum poznatkov o (potenciálnych) ultrakrátko pôsobiacich ßB z hľadiska určenia ich spektrálnych a fyzikálno-chemických parametrov využiteľných nielen v rámci QSAR štúdií ale aj spätne v projekcii nových potenciálnych liečiv.  

POKUSNÁ ČASŤ 

SPEKTRÁLNA ČASŤ

1H- a 13C-NMR spektrometria

Použité chemikálie: Deuterovaná voda (rozpúšťadlo), ako vnútorný štandard bol použitý tetradeutero-3-trimetylsilylpropionát (Fluka AG, Buchs, Švajčiarsko; (CH3)3SiCD2 COONa, Mr = 172,27). Pripravili sa roztoky hodnotenej substancie UPB-1 s koncentráciou 2 mg/650 μl D2O.

Prístroje a zariadenia: NMR spektrometer Varian Gemini 2000 (Varian, New Jersey, USA), magnet Oxford 300 MHz (Oxford, Veľká Británia).

Parametre pri meraní 1H-NMR spektier: Rozsah = 13 – -1 ppm, aktivačný čas = 3 s, počet akvizícií = 32, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 oC.

Parametre pri meraní 13C-NMR spektier: Rozsah = 240 – - 20 ppm, aktivačný čas = 1,815 s, počet akvizí­cií = 10 000, delay = 1 s, pracovná teplota = 20 oC.

1H-NMR (300 MHz) δ (ppm): 1,24 (t, 3H, CH2CH3, J = 7,0 Hz); 1,29–1,34 (d-d, 6H, CH(CH3)2, J = 6,5 Hz); 2,96–3,06 (m, 2H, CH2NH2+CH(CH3)2); 3,24 (kvi, 1H, NH2+CH(CH3)2, J = 6,4 Hz); 3,56–3,63 (kva, 2H, CH2CH3, J = 7,0 Hz); 3,79 (t, 2H, CH2OCH2CH2, J = 4,6 Hz); 4,15 (t, 2H, CH2CH2OAr, J = 4,7 Hz); 4,22–4,39 (m, 2H, (OH)CHCH2NH2+); 4,40–4,50 (m, 1H, CH(OH)); 6,63 (s, 1/2, fumarát, 1H, CH = CH); 6,90; 6,93 (d, 2H, OArH, J = 8,8 Hz); 7,56 (broad peak, 3H, (OH), NH2+); 7,94; 7,97 (d, 2H, ArHCOO, J = 8,8 Hz).

13C-NMR (75 MHz) δ (ppm): 15,13 (CH3CH2O); 19,30; 19,72 (NH2+(CH3)2); 48,05 (CH(CH3)2); 50,47 (CH2NH2+); 65,30; 66,09; 66,90; 67,59; 68,70 ((OH)CHCH2, CH3CH2OCH2CH2O); 114,28 (2C, OCArC2); 122,08 (1C, ArCCOO); 131,72 (2C, ArC2CCOO); 136,12 (fumarát, CH = CH); 162,80 (1C, OArC); 166,06 (COO); 173,11 (fumarát, COO-).

IR spektrometria

Prístroje a zariadenia: Spektrometer FTIR IMPACT 400D (NICOLET), merané technikou kapilárneho filmu alebo v KBr-tabletách v koncentrácii 2–3 mg látky UPB‑1/800 mg KBr.

IR cm-1: υas(C–H): 2975; υs(C–H): 2875; υ(C=O): 1704; υas(C=C): 1606; δ(N–H) 1508; δ(CH2): 1462; υ(C–N)sek. N: 1353, 1280; υas(C–O–C): 1169 (1112); υ(C–O)es: 1254, 1054; γ(C–H): 765, 659; v IR spektre nebola nepozorovaná vibrácia υ(NH2+) – predpokladaná približne okolo 2700; δ(NH2+): 1600 – 1575 v prekryve; υ(C–OH): skryté v oblasti 1450–1500.

Spektrofotometria v UV/VIS oblasti

Použité chemikálie: Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR).

Príprava roztokov: Pripravili sa roztoky 8) študovanej látky UPB-1 vo vode a v metanole s c = 1 × 10-5 mol.l-1 ako aj roztok p-OHBA v metanole s c = 3 × 10-5 mol.l-1.

Prístroje a zariadenia: Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), UV/VIS spektrofotometer (8452 A, diode array spectrophotometer, typ Vectra 286/12) s kremennými kyvetami hrúbky 1 cm, osobný počítač, vyhodnocovací softvér (HP 845 × UV‑Visible System).

Pracovný postup: Absorpčné spektrum UPB-1 sa meralo v destilovanej vode ako aj v metanole, absorpčné spektrum p-OHBA bolo merané v metanole. Na základe Lambert-Beerovho zákona sa vypočítali hodnoty ε, resp. log ε pre všetky absorpčné maximá v obi­dvoch médiách.

UPB-1, vodné prostredie – UV λmax nm (absorbancia; log ε): 198 (1,17790; 5,07), 260 (0,76744; 4,89). UPB‑1, metanolové prostredie – UV λmax nm (absorbancia; log ε): 210 (0,86716; 4,94), 258 (0,90437; 4,96). p‑OHBA, metanolové prostredie – UV λmax nm (absorbancia; log ε): 214 (0,74230; 4,39), 252 (1,09170; 4,56). 

ANALYTICKÁ ČASŤ 

Stanovenie teploty topenia 

Prístroje a zariadenia:STUART SMP 11 (Lennox Laboratory Suppliers, Dublin, Írsko).

Pracovný postup: Teplota topenia UPB-1 bola stanovená po 24-h sušení v exsikátore nad P2O5 pri tlaku 10 kPa a laboratórnej teplote, jej nekorigované hodnoty sú uvedené v tabuľke 1.

Tab. 1. Základná charakteristika mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2 hydroxypropyl}-izopropylamónium]fumarátu (pracovné označenie UPB-1)
Základná charakteristika mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2 hydroxypropyl}-izopropylamónium]fumarátu (pracovné označenie UPB-1)
 

Stanovenie rozpustnosti 

Použité chemikálie: Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), lieh 96 % (Lachema, Brno, ČR), kyselina chlorovodíková s c = 0,1 mol.l-1 (CentralChem, Bratislava, SR), hydroxid sodný s c = 0,1 mol.l-1 (CentralChem, Bratislava, SR), chloroform p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), acetón p.a. (Central­Chem, Bratislava, SR), dietyléter p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), dimetylsulfoxid p.a. (Lachema, Brno, ČR).

Prístroje a zariadenia: Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko).

Pracovný postup: Rozpustnosť študovanej látky UPB‑1 a p-OHBA bola stanovená 9) podľa SL 1. Návažok látky, resp. látok predstavoval jednotlivo 0,0100 g pre všetky rozpúšťadlá. Postupne sa hodnotila ich rozpustnosť v destilovanej vode, v metanole, v liehu 96 %, v kyseline chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l-1, v hydroxide sodnom s c = 0,1 mol.l-1, v chloroforme, v acetóne, v di­etyléteri a v dimetylsulfoxide pri laboratórnej teplote. Objem pridávaných rozpúšťadiel bol adekvátne upravený vzhľadom na zvolený návažok. 

Stanovenie hodnoty Rf pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve 

Použité chemikálie: Lieh 96 % (Lachema, Brno, ČR), benzén p.a. (Lachema, Brno, ČR), dietylamín p.a. (Merck, Schudart, SRN), petroléter p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR), dietyléter p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), acetón p.a. (Spolchim, Bratislava, SR), propán-1-ol p.a. (Plichem, Darmstadt, SRN), cyklohexán p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR), chloroform p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), toluén p.a. (Lachema, Brno, ČR), etylacetát p.a. (CentralChem, Bratislava, SR).

Materiál, prístroje a zariadenia: Silufol® UV254 s vrstvou silikagélu s rozmermi 200 × 200 mm (nastrihaný na vhodne veľké časti), sklenené komory s rozmermi 190 × 180 × 80 mm, mikrokapilára (Hamilton Bonaduz, Švajčiarsko), UV-lampa (KRUSS UV 240, 230VAC, Hamburg, SRN).

Pracovný postup: Na komerčne vyrábané fólie Silufol® UV254 s vrstvou silikagélu sa na vyznačený štart mikrokapilárou naniesli 2 μl 1 % roztoku hodnotenej zlúčeniny UPB-1 a „štandardu“ p-OHBA v metanole p.a. Po ukončení vyvíjania sa chromatogramy sušili pri laboratórnej teplote a detegovali sa pod UV-lampou pri vlnovej dĺžke 254 nm 8). Výsledné hodnoty sú priemerom zo šiestich paralelných stanovení (pozri časť Výsledky a diskusia).

Skúšanými vyvíjacími sústavami boli: P1: petroléter : dietyléter (ϕ = 1 : 2 ako aj 2 : 1); S2: acetón : petroléter (ϕ = 2 : 3); S3: acetón : toluén (ϕ = 1 : 2); S4: acetón : toluén : dietylamín : chloroform (ϕ = 1 : 2 : 0,5 : 1); S5: petroléter : dietylamín (ϕ = 8 : 2 ako aj 8 : 3); S6: propán-1-ol : cyklohexán (ϕ = 1 : 1); S7: etanol : benzén (ϕ = 10 : 3); S8: chloroform : dietylamín (ϕ = 6 : 0,1); S9: propán--1-ol : cyklohexán : dietylamín (ϕ = 5 : 5 : 0,1 ako aj 5 : 5 : 1); S10: acetón : petroléter : dietylamín (ϕ = 8 : 8 : 0,1 ako aj 8 : 8 : 1); S11: etanol : benzén : dietylamín (ϕ = 10 : 3 : 0,1); S12: chloroform : cyklohexán : dietyl­amín (ϕ = 6 : 3 : 1); S13: hexán : etylacetát (ϕ = 7 : 3). Najoptimálnejšie hodnoty Rf pre UPB-1 a p-OHBA boli získané v sústave S11.

Stanovenie povrchového napätia 

Použité chemikálie: Destilovaná voda, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR).

Prístroje a zariadenia: Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), sklenený Traubeho stalagmometer (Kavalier, ČR).

Pracovný postup: Povrchové napätie UPB-1 bolo stanovené, podobne ako v práci 8), nepriamou stalagmometrickou metódou počítania kvapiek. Použitý bol sklenený Traubeho stalagmometer (Kavalier, ČR). Pripravil sa roztok UPB-1 s c = 1 × 10-3 mol.l-1. Ako referenčná kvapalina sa použila destilovaná voda, ktorej povrchové napätie je 0,07259 N.m-1 pri teplote t = 21 °C. 

Stanovenie disociačnej konštanty 

Použité chemikálie: Destilovaná voda, hydroxid sodný s c = 0,1 mol.l-1 (CentralChem, Bratislava, SR), metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR).

Prístroje a zariadenia: Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), automatická byreta OP 930, digitálny pH-meter (HANNH Instruments HI 221, SRN), mikropipeta, elektromagnetické miešadlo (Laboratorní přístroje, Praha, ČR).

Príprava roztokov: Roztok hodnotenej látky UPB-1 bol pripravený rozpustením 0,025 g substancie v destilovanej vode na objem 50,0 ml; p-OHBA bola rozpustená (0,025 g) v zmesi destilovaná voda : metanol (φ = 3 : 2) na objem 50,0 ml.

Pracovný postup: Disociačná konštanta UPB-1 (ako aj p-OHBA) bola stanovená potenciometricky alkalimetrickou titráciou pomocou automatickej byrety OP 930 spojenej s digitálnym pH-metrom. Konštantný prídavok odmerného roztoku hydroxidu sodného s c = 0,1 mol.l-1 predstavoval 0,005 ml. Titrácia pre­biehala pri teplote 21 °C. Zaznamenali sa hodnoty pH titrovaného roztoku, resp. roztokov v závislosti od pridaného množstva hydroxidu sodného. Po ukončení titrácie sa interpolačným stupňom podľa Hahna zistila presná spotreba odmerného roztoku a hodnota pri polovičnej spotrebe 8). Z priebehu potenciometrickej titrácie sa podľa vhodnej polynomickej funkcie v programe Statistica 8.0 (Stat Soft, Tulsa, USA) pomocou V1/2 vypočítala disociačná konštanta. Výsledná hodnota pKa pre UPB-1 ako aj p-OHBA v časti Výsledky a diskusia je prezentovaná ako priemer troch paralelných stanovení. 

Stanovenie logaritmu retenčného faktora k’ z RP‑HPLC 

Použité chemikálie: Dusitan sodný s c = 0,1 mol.l-1, metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), nátriumacetát (Lachema, Brno, ČR) na úpravu hodnoty pH mobilnej fázy.

Prístroje a zariadenia: Chromatograf s vysokotlakovou pumpou Delta Chrom SDS 030, (WATREX, SR), slučkový dávkovač s 20-μl slučkou (WATREX, SR), kolóna s nepolárnou chemicky viazanou fázou Separon SGX C18 7 μm, 250 × 4 mm (Lachema, Brno, ČR), prietokový UV-detektor Delta Chrom UVD 200 (WATREX, SR).

Pracovný postup: Hodnota retenčného faktora k’  (v literatúre uvádzaný aj ako kapacitný faktor k’) bola stanovená podľa práce 10) na kvapalinovom chromatografe s vysokotlakovou pumpou, so slučkovým dávkovačom, nepolárnou chemicky viazanou fázou a prietokovým UV-detektorom. Pre študovanú látku UPB-1 a „štandard“ p-OHBA boli použité dve mobilné fázy s rozdielnym percentuálnym zastúpením metanolu, t.j. 90 % a 95 % (pripravené z metanolu p. a. a destilovanej vody).

Chromatografické podmienky:

A. Mobilná fáza (pH = 6,0) – 90 % metanol upravený vodným roztokom nátriumacetátu; prietoková rýchlosť – 0,6 ml.min-1; tlak – 7,9 MPa; vlnová dĺžka – 260 nm; pracovná teplota – 21 až 22 oC.

B. Mobilná fáza (pH = 6,0) – 95 % metanol upravený vodným roztokom nátriumacetátu; prietoková rýchlosť – 0,6 ml.min-1; tlak – 5,9 MPa; vlnová dĺžka – 260 nm; pracovná teplota – 21 až 22 oC.

Mŕtvy čas kolóny (t) sa stanovil roztokom dusitanu sodného s c = 0,1 mol.l-1, ktorý mal v použitom systéme nulovú retenciu. Hodnota(-y) log k’  boli vypočítané zo vzťahu: log k’ = log [(tR – t) / t ], kde t je retenčný čas roztoku dusitanu sodného s c = 0,1 mol.l-1 a tR je retenčný čas roztoku vzorky 10).

Roztoky UPB-1 a p-OHBA boli pripravené rozpustením 0,005 g príslušnej substancie v metanole a upravené na objem 25,0 ml. Po odvzdušnení mobilnej fázy bol chromatografický systém premývaný približne 20 min. Prvé dva nástreky bol roztok dusitanu sodného, potom sa aplikovali roztoky študovaných látok (20 μl). Každá vzorka bola aplikovaná trikrát 10), pre výpočet sa použila priemerná hodnota tR. Získané hodnoty sú uvedené v tabuľkách 2 a 3.

Tab. 2. Retenčný faktor k’ študovanej substancie UPB-1 a p-OHBA získaný z RP-HPLC v prostredí 90% metanolu
Retenčný faktor k’ študovanej substancie UPB-1 a p-OHBA získaný z RP-HPLC v prostredí 90% metanolu
*číslo merania

Tab. 3. Retenčný faktor k’ študovanej substancie UPB-1 a p-OHBA získaný z RP-HPLC v prostredí 95% metanolu
Retenčný faktor k’ študovanej substancie UPB-1 a p-OHBA získaný z RP-HPLC v prostredí 95% metanolu
*číslo merania
 

Stanovenie rozdeľovacieho koeficientu a výpočet niektorých molekulových deskriptorov 

Použité chemikálie: Oktán-1-ol p.a. (Merck, Schudardt, SRN), heptán p.a. (Mikrochem, Bratislava, SR), cyklohexán p.a. (Lach-Ner, Neratovice, ČR), roztok kyseliny citrónovej s c = 0,1 mol.l-1 (Chemapol, Praha, ČR), hydrogenfosforečnan disodný p.a. s c = 0,2 mol.l-1 (Lachema, Brno, ČR).

Prístroje a zariadenia: Analytické váhy Chyo JL-180 (Chyo Balance Corporation, Japonsko), mechanická trepačka (Laboratórní přístroje, Praha, ČR), UV/VIS spek­trofotometer (pozri UV/VIS spektrofotometriu).

Príprava roztokov: Tlmivý roztok s hodnotou pH = 7,2 sa pripravil zmiešaním 20,8 ml roztoku kyseliny citrónovej a 195,2 ml roztoku hydrogenfosforečnanu disodného, a potom sa hodnota pH upravila na 7,4. Základný roztok skúšanej látky UPB-1 sa pripravil navážením 0,100 g zlúčeniny a preniesol sa do 50-ml odmernej banky. Rozpustil sa v 30–40 ml tlmivého roztoku 8, 10) a po ochladení sa doplnil týmto roztokom na objem 50 ml.

Pracovný postup: Rozdeľovací koeficient Pexp študovanej zlúčeniny UPB-1 bol stanovený experimentálne klasickou shake flask metódou jej vytrepaním medzi dve nemiešateľné fázy tak, ako sa postupovalo aj v prácach 8, 10). Lipofilnú fázu reprezentoval postupne oktán-1-ol, heptán, cyklohexán a ako vodná fáza bol použitý tlmivý fosforečnanový roztok (TFR) s hodnotou pH = 7,4. U analyzovanej substancie UPB-1 sa vykonali v každom deliacom systéme tri paralelné stanovenia.

Výpočet niektorých molekulových deskriptorov. Hodnota polárneho povrchu molekuly (PSA) a počtu akceptorov vodíkov (nacc) pre UPB-1 (forma bázy) bola generovaná programom ChemBioDraw Ultra 11 (Cam­bridgeSoft Corporation, Cambridge, USA); PSA = 77,02; nacc = 6. 

Stabilita študovanej substancie UPB-1 

Pôsobenie kyslého prostredia (kyselina chlorovodíková s c = 0,1 mol.l-1)

Použité chemikálie: Metanol p.a. (CentralChem, Bratislava, SR), lieh 96 % p.a. (Lachema, Brno, ČR), benzén p.a. (Lachema, Brno, ČR), dietylamín p.a. (Merck, Schudart, SRN).

Pracovný postup: Pripravilo sa 5 ml 1 % metanolového(-ých) roztoku(-ov) UPB-1 a „štandardu“ p-OHBA, z ktorých sa odobral 1 ml, pridal sa 1 ml kyseliny chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l-1. Po 5 min sa roztoky hodnotili chromatograficky na TLC. Na fóliu Silufol UV254 sa 1,5 cm od spodného okraja nanieslo 5 μl roztokov UPB-1 a p-OHBA. Po vyvinutí vo vyvíjacej sústave S11 sa chromatogram vysušil a detegoval pod UV-lampou pri 254 nm. Získané hodnoty Rf (priemer troch paralelných stanovení) sú uvedené v tabuľke 4.

Pôsobenie zásaditého prostredia (hydroxid sodný s c = 0,1 mol.l-1)

Pracovný postup: Rovnako ako v prípade hodnotenia stability v kyslom prostredí, ale namiesto kyseliny chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l-1 sa použil hydroxid sodný s rovnakou koncentráciou. Získané hodnoty Rf (priemer troch paralelných stanovení) sú uvedené v tabuľke 4.

Tab. 4. Hodnotenie stability UPB-1 v kyslom a zásaditom prostredí pomocou adsorpčnej TLC
Hodnotenie stability UPB-1 v kyslom a zásaditom prostredí pomocou adsorpčnej TLC
*hodnoty Rf určené v sústave S11: etanol : benzén : dietylamín (φ = 10 : 3 : 0,1)
 

Pôsobenie UV/VIS žiarenia

Pracovný postup: Pripravil sa vodný a metanolový roztok UPB-1 s c = 1 × 10-5 mol.l-1. V priebehu 1 h sa v 5‑min intervaloch sledovali (prípadné) posuny vo vlnových dĺžkach absorpčných maxím ako aj (prípadné) zmeny v absorbanciách pri jednotlivých absorpčných maximách v obidvoch zvolených prostrediach. 

Stanovenie obsahu UPB-1 

Stanovenie obsahu UPB-1 v UV/VIS oblasti spektra

Prístroje a zariadenia: Pozri UV/VIS spektrofotometriu.

Pracovný postup: Pripravil sa 0,002 % roztok, resp. roztoky UPB-1 vo vode ako aj v metanole, ktorých spektrum sa zaznamenalo v oblasti 190–400 nm proti čistému rozpúšťadlu. Zo zásobného roztoku (0,002 %) UPB-1 sa odpipetovalo postupne 2, 4, 6, 8, 10 ml do piatich 10-ml odmerných baniek. Všetky odmerné banky sa doplnili po značku vodou, resp. metanolom a zaznamenala sa absorbancia takto pripravených roztokov 8). Z nameraných hodnôt A (log A) sa zostrojila kalibračná krivka; vo vodnom prostredí pri vlnovej dĺžke λmax = 260 nm, v metanolovom prostredí pri λmax = 258 nm. Hodnoty koncentrácií, absorbancií a log A sú uvedené v tabuľke 5.

Vyhodnotenie výsledkov: Obsah UPB-1 sa stanovil z funkcie priamky (y = a x + b). Po zostrojení kalibračnej krivky a štatistickom vyhodnotení jednotlivé symboly znamenajú: y = A (absorbancia), b = a (úsek na osi y), a = a1 (smernica priamky), x = c. Z týchto vzťahov vyplýva, že koncentrácia sa vypočíta podľa vzťahu: c = (A – a)/a1

Stanovenie obsahu UPB-1 RP-HPLC metódou vnútorného štandardu

Použité chemikálie: Metanol UV (Lachema, Brno, ČR), nátriumacetát tavený čistý (Spolana, Neratovice, ČR), vnútorný štandard – p-OHBA.

Prístroje a zariadenia: Pozri stanovenie retenčného faktora k’  pomocou RP-HPLC.

Chromatografické podmienky: Mobilná fáza (pH = 6,0) – 90 % metanol upravený roztokom nátriumacetátu; prietoková rýchlosť – 0,6 ml.min-1; tlak – 7,7 MPa; vlnová dĺžka – 248 nm; pracovná teplota – 21 °C.

Pracovný postup: Pripravil sa roztok UPB-1 navážením množstva 0,02 g substancie, ktoré sa kvantitatívne prenieslo do 25-ml odmernej banky a rozpustilo sa v metanole (zásobný roztok). Z tohto zásobného roztoku sa odpipetovalo do 25-ml odmerných baniek postupne po 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 ml, pridalo sa 5 ml vnútorného štandardu (pripraveného navážením 0,01 g p-OHBA, ktoré sa kvantitatívne prenieslo do 25-ml odmernej banky a doplnilo sa po značku metanolom) a doplnilo sa metanolom po značku 10). Pomocou dávkovacieho ventilu sa z takto pripravených roztokov na kolónu nanášal objem 20 μl.

Vyhodnotenie výsledkov: Z pamäti počítača bol vyvolaný záznam analýzy vzorky, integrovali a opísali sa plochy zodpovedajúce analyzovanej látke (P1) a jej vnútornému štandardu (P2). Výsledky analýz 10) sa vypočítali z pomeru plôch píkov P1/P2 (tab. 6).

Tab. 5. Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu UPB-1 pomocou RP-HPLC
Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu UPB-1 pomocou RP-HPLC
*objem pridaného základného roztoku UPB-1 (0,02 g/25 ml) **plocha príslušných píkov formovaných UPB-1 (P1) a p-OHBA (P2)
  

VÝSLEDKY A DISKUSIA 

Hodnotená zlúčenia s pracovným označením UPB-1, chemicky mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2--hydroxypropyl}-izopropylamónium]fumarát, bola pripravená na ústave chemických léčiv FaF VFU v Brne. Ide o bielu kryštalickú látku, ktorej chemická štruktúra, sumárny vzorec (bázická forma ako aj forma soli), Mr a interval teploty topenia (nekorigovaná hodnota) sú uvedené v tabuľke 1. Súbežne s UPB-1 bola pre porovnanie študovaná aj kyselina p-hydroxybenzoová (p-OHBA) ako vstupná reagencia použitá pri syntéze UPB-1.

Chemická štruktúra UPB-1 bola potvrdená príslušnými spektrálnymi metódami. V 1H- a 13C-NMR spektre boli identifikované signály, ktoré prislúchali alkylovým reťazcom, resp. jednotlivým atómov uhlíka v lipofilnej časti ako aj v bázickej oblasti molekuly. Taktiež bol identifikovaný a priradený signál protónu OH-skupiny (v 2‑hydroxypropán-1,3-diylovom zoskupení), signály protónov aromatického jadra ako aj signály, ktoré identifikovali aniónovú zložku – fumarát (pozri spektrálnu charakteristiku v Pokusnnej časti). Pomocou IR spektrometrie bola potvrdená prítomnosť alkylového substituenta, lipofilného aromatického jadra, karboxylovej, resp. oxoskupiny a bázického fragmentu. Pás IR spektra valenčnej vibrácie (C = O)-skupiny pri 1704 cm-1 sa môže pri UPB-1 využiť pre kvantitatívne hodnotenie.

Na základe štúdia rozpustnosti je UPB-1 relatívne hydrofilná – je veľmi ľahko rozpustná v kyseline chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l-1, ľahko rozpustná v destilovanej vode, v hydroxide sodnom s c = 0,1 mol.l-1 a v dimetylsulfoxide, mierne rozpustná v metanole, v liehu 96 % a v chloroforme a veľmi ťažko rozpustná v acetóne a v dietyléteri. Na porovnanie ako aj z pohľadu ďalšieho fyzikálno-chemického hodnotenia bola určená aj rozpustnosť p-OHBA. Tá je veľmi ľahko rozpustná v metanole, v liehu 96 %, v dimetylsulfoxide a v acetóne, ľahko rozpustná v dietyléteri a v hydroxide sodnom s c = 0,1 mol.l-1, mierne rozpustná v kyseline chlorovodíkovej s c = 0,1 mol.l-1, ťažko rozpustná v destilovanej vode a v chloroforme.

Na orientačné hodnotenie čistoty UPB-1 bola okrem RP-HPLC použitá adsorpčná chromatografia na tenkej vrstve – delenie látok na adsorpčnom princípe sa uskutočnilo na platniach Silufolul®, vyvíjanie prebiehalo do vzdialenosti 10 cm. Súčasne s UPB-1 bola chromatograficky hodnotená aj p-OHBA. Z mnohých vyskúšaných dvoj- a trojzložkových vyvíjacích sústav bola ako naj­vhodnejšia vyhodnotená sústava S11: etanol : benzén : dietylamín (ϕ = 10 : 3 : 0,1). V systéme S11 nastalo jednoznačné oddelenie ohraničených škvŕn prislúchajúcich UPB-1 (Rf = 0,29) a p-OHBA (Rf = 0,58), pričom na príslušnom „stĺpci“ UPB-1 neboli pozorované iné škvrny.

Povrchové napätie bolo študované nepriamou Traubeho stalagmometrickou metódou počítania kvapiek – UPB-1 (γ = 0,06954 N.m-1) ako aj p-OHBA (γ = 0,06969 N .m-1) boli mierne povrchovoaktívne, pričom povrchovoaktívnejšia bola substancia UPB-1.

Na štúdium acidobázických vlastností bola použitá metóda alkalimetrickej titrácie (roztok hydroxidu sodného s c = 0,1 mol.l-1) pri potenciometrickej indikácii bodu ekvivalencie. Študovaná zlúčenina UPB-1 mala mierne kyslý charakter (pKa = 5,71), pre porovnanie (resp. určitú „verifikáciu“ stanovenia pKa) bola určená aj disociačná konštanta p-OHBA, ktorej hodnota predstavovala 4,38 (tri paralelné stanovenia); literatúra 11, 12) uvádza údaj 4,48–4,54.

Pri štúdiu spektier v UV/VIS oblasti vykazovala UPB‑1 dve absorpčné maximá (viď Pokusná časť). Vo vodnom roztoku sú to maximá pri λ1max = 198 nm a λ2max = 260 nm, v prostredí metanolu nastal mierny posun – absorpčné maximá boli zistené pri λ1max = 210 nm a λ2max = 258 nm. V porovnaní s absorpčným spektrom p-OHBA (absorpčné maximá pri λ1max = 214 nm a λ2max = 252 nm v metanole) je možné pozorovať mierny posun obidvoch maxím, ktorý je spôsobený charakterom substituenta na hydroxylovej skupine v p-polohe aromatického jadra ako aj substitú­ciou v esterovej časti molekuly.

Ako experimentálne stanovené parametre lipofility látky UPB-1 a p-OHBA boli určené retenčné faktory k’, resp. log k’  v sústavách s rozdielnym percentuálnym zastúpením metanolu ako súčasťou mobilnej fázy a rozdeľovacie koeficienty v troch rozdielnych rozdeľovacích systémoch. Rozdielna miera lipofility UPB-1 a p-OHBA sa odzrkadlila v hodnotách log k’ v oboch systémoch (viď tab. 2 a 3); v 90 % metanole boli zistené takéto retenčné charakteristiky: log k’UPB-1 = -0,071; log k’p‑OHBA = -2,153; v 95% metanole boli získané tieto údaje: log k’UPB-1 = 0,015; log k’ p‑OHBA = -2,643.

Hodnoty log Pexp pre UPB-1 boli určené klasickou shake flask metódou; pre určenie koncentrácie látky vo vodnej fáze sa využila UV/VIS spektrofotometria. V rozdeľovacom systéme oktán-1-ol/TFR (oktán-1-ol je amfiprotný H-donor a H-akceptor) predstavoval log Pexp hodnotu 1,70; v sústave heptán/TFR bola hodnota log Pexp = 1,66; a v systéme cyklohexán/TFR log Pexp = 1,62 (cyklohexán je relatívne inertným médiom oproti vodnému prostrediu, resp. TFR). Kyselina p-hydroxybenzoová je látkou hydrofilnejšou s log mexp = 1,37. Tento údaj bol prevzatý z literatúry 13), keďže nebolo možné korektne p-OHBA rozpustiť v destilovanej vode, a tak stanoviť jej log Pexp spôsobom shake flask.

V rámci projekcie a komplexného štúdia potenciálneho liečiva je dôležité určiť, či kandidát na liečivo je schopný prenikať hematoencefalickou bariérou (blood-brain barrier, BBB). Relatívne vysoká miera schopnosti permeovať cez BBB je potrebná pri liečivách, ktoré majú cielene ovplyvňovať CNS. Na druhej strane nízka miera permeácie cez BBB je žiaduca pre minimalizáciu vedľajších účinkov spojených s ovplyvnením CNS. Kvantitatívne je možné tento stupeň vyjadriť ako pomer rovnovážnych koncentrácii substancie v mozgu (cmozog) a v krvi (ckrv), t.j. ako log (cmozog/(ckrv) alebo log BB 14). Rozdelenie látky do nepolárnych oblastí mozgu odzrkadľuje hodnota log Pexp v systéme cyklohexán/TFR (log Pexp c), zatiaľ čo údaj log Pexp stanovený v systéme oktán-1-ol/TFR (log Pexp o) vyjadruje väzbu na proteíny v periférnom krvnom riečišti 15). Vo všeobecnosti platí, že látka má tým hydrofilnejší charakter, čím je jej priemerná hodnota log Pexp o-c (t.j. rozdiel medzi log Pexp o a log Pexp c) pozitívnejšia; to znamená, že ochotnejšie tvorí vodíkové väzby, v menšej miere preniká do nepolárnych oblastí mozgu a je v organizme distribuovaná prednostne do krvi. Hodnota log Pexp o-c = 0,08 pre UPB-1 teda indikuje, že tá minimálne prechádza cez hematoencefalickú bariéru do nepolárnych oblastí mozgu. Implementácia stanovených hodnôt príslušných rozdeľovacích koeficientov do Youngovho modelu 16), v rámci ktorého hodnota log BB koreluje s log Pexp o-c podľa vzťahu: logBB = 0,889–0,485 × logPexp o-c však priniesla jednoznačnejšie tvrdenie – hodnota log BB pre UPB-1 predstavovala 0,850. Na druhej strane sa však pre pomerne široké spektrum zlúčenín Youngov model ukázal ako nevyhovujúci. Preto sa v predkladanej práci použili aj iné, detailnejšie schémy predikcie schopnosti UPB-1 prechádzať cez BBB.

Kaliszan 17) navrhol pre koreláciu log Pexp o-c a log BB vzťah, v ktorom bola ako aditívna veličina inplementovaná aj Mr:

log BB = -0,088 + 0,272 × logPexp o-c – 0,00112 × Mr; podľa tohto modelu je hodnota log BB látky UPB-1 ‑0,925.

Dôležitými faktormi ovplyvňujúcimi log BB sú veľkosť a povrch molekuly ako aj tvorba vodíkových väzieb. Z týchto deskriptorov sa relatívne najväčší význam prisudzuje práve polárnemu povrchu molekuly (polar surface area, PSA), ktorý sa uplatňuje aj v modeloch Keldera 18) charakterizovaného vzťahom:

logBB = 1,330 – 0,032 × PSA (log BB pre UPB-1 je –1,135) a Clarka19) definovaného nasledujúcou rovnicou:

logBB = 0,550 – 0,016 × PSA (log BB pre UPB-1 je ‑0,682).

Na báze Clarkovej metódy bol založený aj prístup Pana 20) , predstavoval relatívne jednoduchý vzťah, v ktorom však pôvodne absentovali niektoré relevantné štatistické ukazovatele:

log BB = 0,064 + 0,200 × logPexp o – 0,010 × PSA. Pre UPB-1 je podľa tohto modelu hodnota log BB -0,366.

Podľa Abrahamovho a Weathersbyho modelu predikcie 21) log BB platí nasledovný vzťah:

log BB = 0,119 + 0,350 × logPexp o – 0,00502 × Mr. Po dosadení príslušných parametrov je hodnota log BB v tomto prípade -0,920.

Niektorí autori inplementovali do QSAR modelov predikujúcich log BB aj schopnosť látky vytvárať väzby vodíkovým mostíkom. Feher 22) navrhol nasledujúci model: log BB = 0,4275 – 0,0017 × PSA + 0,1092 × logP – 0,3873 × nacc, v ktorom log P = log Pexp o a nacc bol počet akceptorov vodíkov v molekule vo vodnom prostredí (pre bázickú formu UPB-1 je to šesť akceptorov). Z tohto pohľadu bola hodnota log BB pre UPB-1 -1,842. Pri komplexnejšom pohľade na získané výsledky je možné predpokladať, že študovaná zlúčenina bude s vysokou pravdepodobnosťou preferovať väzbu na proteíny krvného riečišťa pred prechodom cez hematoencefalickú ba­riéru.

Hodnota log Pexp o-h (rozdiel medzi hodnotami log Pexp v systéme oktán-1-ol/TFR a v rozdeľovacej sústave heptán/TFR) predstavovala 0,04; to znamená, že študovaná zlúčenina je veľmi slabým donorom protónu.

Z hľadiska hodnotenia stability UPB-1 v kyslom ako aj v zásaditom prostredí – kyselina chlorovodíková, hydroxid sodný; obe médiá s c = 0,1 mol.l-1 – pomocou adsorpčnej chromatografie na tenkej vrstve možno konštatovať, že UPB-1 nie je pri laboratórnej teplote v týchto prostrediach stabilná. Na chromatograme(-och) sa na „stĺpci“ UPB-1 okrem jej „vlastnej“ škvrny objavili v oboch prostrediach aj ohraničené škvrny prislúchajúce jednak p-OHBA (ktorá bola zároveň nanášaná na chromatogram ako referenčná substancia), ako aj ďalším „štie­pnym“ produktom vznikajúcim pri rozklade UPB‑1 – zlúčeninám pracovne označeným ako „X1“ a „X2“. Pravdepodobne nastalo vplyvom príslušného prostredia parciálne štiepenie molekuly UPB-1 v jej esterovej časti alebo v alkoxylovom zoskupení v lipofilnom fragmente (viď tab. 4). Pri hodnotení vplyvu UV/VIS žiarenia na vodný a metanolový roztok UPB-1 bolo zistené, že v prie­behu 1 h nedošlo k zmene hodnôt absorbancií pri jednotlivých absorpčných maximách a v časovom intervale 1 h ani k ich posunu.

Na „metodickú prípravu“ pre (prípadné) stanovenie obsahu UPB-1 v konkrétnej liekovej forme alebo v telových tekutinách možno využiť UV/VIS spektrofotometriu alebo RP-HPLC. Látka UPB-1 bola stanovená spektrofotometricky pri vlnovej dĺžke druhého absorpčného maxima, teda pri λ2max = 260 nm (pre vodné prostredie), resp. pri λ2max = 258 nm (pre prostredie metanolu). Na základe získaných údajov bola zostrojená kalibračná krivka, výsledkom stanovenia bolo formulovanie regresnej rovnice v tvare: y = 39187x + 0,0138; R2 = 0,9991 (vodné prostredie, viď tab. 5); resp. y = 42139x + 0,0173; R2 = 0,999 (metanolové prostredie, viď tab. 5). V prezentovaných rovniciach parameter y predstavuje absorbanciu, x vyjadruje koncentráciu stanovovanej látky v mol.l‑1.

Tab. 6. Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu UPB-1 vo vodnom a metanolovom prostredí pomocou UV/VIS spektrometrie
Parametre potrebné na zostrojenie kalibračnej krivky pre stanovenie obsahu UPB-1 vo vodnom a metanolovom prostredí pomocou UV/VIS spektrometrie

Pri výbere mobilnej fázy (MF) pri stanovení obsahu UPB-1 pomocou RP-HPLC sa vychádzalo z vlastností rozpúšťadiel, ktoré sú uvedené v Rohrschneiderovom rade 23), kde sú zohľadnené nukleofilné, elektrofilné vlastnosti rozpúšťadiel a zároveň aj ich možnosti tvorby vodíkových väzieb s molekulami separovaných látok. Vhodnou MF pre delenie látky sa ukázal metanol 90 %. Regresná rovnica má nasledujúci tvar: y = 12141x + 0,1255; R2 = 0,993; parameter y predstavuje pomer plôch píkov študovanej látky UPB-1 a vnútorného štandardu (p-OHBA), x vyjadruje koncentráciu stanovovanej látky v mol.l-1. Ďalšie parametre lineárnej regresie sú uvedené v tabuľke 7.

Tab. 7. Parametre lineárnej regresie pre stanovenie obsahu UPB-1
Parametre lineárnej regresie pre stanovenie obsahu UPB-1
a – regresný koeficient, smernica priamky; b – regresný koeficient, posunutie priamky na osi y; sa, sb – smerodajná odchýlka regresného koeficienta a alebo b; F – F-test na testovanie štatistických hypotéz (štatistická indukcia); n – počet prípadov

Experimentálne získané spektrálne a fyzikálno-chemické deskriptory charakterizujúce mono[{3-[4-(2-etoxyetoxy)-benzoyloxy]-2-hydroxypropyl}-izopropylamónium]fumarát predstavujú cenný príspevok pre budúcu QSAR-analýzu v skupine ultrakrátko pôsobiacich antagonistov ß1-adrenergných receptorov. V ďalších štúdiách sa bude pozornosť venovať spektrálnym identifikačným charakteristikám a stanoveniu fyzikálno-chemických konštánt štruktúrne podobných zlúčenín, v ktorých molekule bude, v porovnaní s UPB-1, modifikovaný alkoxylový reťazec v lipofilnej časti a izopropylový fragment viazaný na atóme dusíka v bázickej časti molekuly.

Došlo 13. ledna 2011

Přijato 23. února 2011

Adresa pre korešpondenciu

PharmDr. Ivan Malík, PhD.

Katedra farmaceutickej chémie FaF UK

Odbojárov 10, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: malik@fpharm.uniba.sk


Zdroje

1. Yamakage, M., Iwasaki, S., Jeong, S.-W., Satoh, J.-I., Namiki, A.: Beta-1 selective adrenergic antagonist landiolol and esmolol can be safely used in patients with airway hyperreactivity. Heart and Lung 2009; 38, 48–55.

2. Bekker, A., Sorour, K., Miller, S.: The use of cardioselective ß-blockers in a patient with idiopathic hypertrophic subaortic stenosis and chronic obstructive pulmonary disease. J. Clin. Anesth. 2002; 14, 589–591.

3. Jindal, D., Coumar, M. S., Nandakumar, K., Bodhankar, S. L., Purohit, P. G., Mahadik, K. R., Bruni, G., Collavoli, E., Massarelli, P.: Synthesis, ß‑adrenergic blocking activity and ß-receptor binding affinities of 1-substituted-3-(2-isopropyl-5-methyl-phenoxy)-propan-2-ol oxalates. Farmaco 2003; 58, 557–562.

4. Kitamura, A., Sakamoto, A., Inoue, T., Ogawa, R.: Efficacy of an ultrashort-acting ß-adrenoceptor blocker (ONO-1101) in attenuating cardiovascular responses to endotracheal intubation. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1997; 51, 467–471.

5. Gray, R. J.: Managing critically ill patients with esmolol. An ultra short-acting beta-adrenergic blocker. Chest 1988; 93, 398–403.

6. Atarashi, H., Kuruma, A., Yashima, M., Saitoh, H., Ino, T., Endoh, Y., Hayakawa, H.: Pharmacokinetics of landiolol hydrochloride, a new ultra-short-acting beta-blo­cker, in patients with cardiac arrhythmias. Clin. Pharmacol. Ther. 2000; 68, 143–150.

7. Achari, R., Hulse, J. D., Drissel, D., Matier, W. L.: Pharmacokinetics of flestolol in man: preliminary data. Br. J. clin. Pharmac. 1985; 20, 691–694.

8. Malík, I., Sedlárová, E., Čižmárik, J., Andriamainty, F., Csöllei, J.: Štúdium fyzikálno-chemických vlastností derivátov kyseliny 4-alkoxyfenylkarbámovej s bázickou časťou tvorenou substituovaným N-fenylpiperazínom. Farm. Obzor 2005; 74, 211–215.

9. Slovenský liekopis, zväzok 1. 1. vyd. Bratislava: Herba 1997; s. 22.

10. Malík, I., Sedlárová, E., Csöllei, J.: Analytické hodnotenie 1-(dipropylamino-3-piperidino-propán-1-yl)--3-pentyloxyfenylkarbamátu (CK-3635). Čes. a Slov. Farm. 2004; 53, 256–260.

11. Databáza ZirChrom: Dissociation constants of organic acids and bases. http://www.zirchrom.com/organic.htm (29.11.2010)

12. Databáza chemicalland21.com: p-Hydroxybenzoic acid. http://www.chemicalland21.com/lifescience/phar/p-HYDROXYBENZOIC%20ACID.htm (29.11.2010)

13. UNEP Publications: 4-Hydroxybenzoic acid. CAS No: 99-96-7. http://www.inchem.org/documents/sids/sids/99967. pdf (29.11.2010)

14. Fu, X.-Ch., Chen, Ch.-X., Liang, W.-Q., Yu, Q.-S.: Predicting blood-brain barrier penetration of drugs by polar molecular surface area and molecular volume. Acta Pharmacol. Sin. 2001; 22, 663–668.

15. Tsai, R.-S., El Tayar, N., Carrupt, P.-A., Testa, B.: Physicochemical properties and transport behaviour of piribedil: Considerations on its membrane-crossing potential. Int. J. Pharm. 1992; 80, 39–49.

16. Young, R. C., Mitchell, R. C., Brown, T. H., Ganellin, C. R., Griffiths, R., Jones, M., Rana, K. K., Saunders, D., Smith, L. R., Sore, N. E., Wilks, T. J.: Development of a new physicochemical model for brain penetration and its application to the design of centrally acting H2 receptor histamine antagonists. J. Med. Chem. 1988; 31, 656–671.

17. Kaliszan, R., Markuszewski, M.: Brain/blood distri­bution described by a combination of partition coefficient and molecular mass. Int. J. Pharm. 1996; 145, 9–16.

18. Kelder, J., Grootenhuis, P. D. J., Bayada, D. M., Delbressine, L. P. C., Ploemen, J.-P.: Polar molecular surface as dominating determinant for oral absorption and brain penetration of drugs. Pharm. Res. 1999; 16, 1514–1519.

19. Clark, D. E.: Rapid calculation of polar molecular surface area and its application to the prediction of transport phenomena. 2. Prediction of blood-brain barrier penetration. J. Pharm. Sci. 1999; 88, 815–821.

20. Pan, D., Iyer, M., Liu, J.: Constructing optimum blood barrier QSAR models using a combination of 4D--molecular similarity measures and cluster analysis. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 2004; 44, 2083–2098.

21. Abraham, M. H., Weathersby, P. K.: Hydrogen bonding. 30. Solubility of gases and vapors in biological liquids and tissues. J. Pharm. Sci. 1994; 83, 1450–1456.

22. Feher, M., Sourial, E., Schmidt, J. M.: A simple model for the prediction of blood-brain partitioning. Int. J. Pharm. 2000; 201, 239–247.

23. West, S.D., Mowrey, D. H.: Characterization of reversed-phase HPLC solvent selectivity for the prediction of adjusted retention indices and resolution. J. Chromatogr. Sci. 1991; 29, 497–502.

Štítky
Farmácia Farmakológia
Prihlásenie
Zabudnuté heslo

Zadajte e-mailovú adresu, s ktorou ste vytvárali účet. Budú Vám na ňu zasielané informácie k nastaveniu nového hesla.

Prihlásenie

Nemáte účet?  Registrujte sa

#ADS_BOTTOM_SCRIPTS#