Molekulární prediktory cílené anti-EGFR terapie u metastatického kolorektálního karcinomu

Súhrn

Terapie monoklonálními anti-EGFR protilátkami cetuximab a panitumumab je účinná u zhruba 10 % pacientů s metastatickým EGFR exprimujícím kolorektálním karcinomem v monoterapii a zhruba u 20 % pacientů při kombinované léčbě s chemoterapií. Prediktivní hodnota imunohistochemického vyšetření exprese EGFR nebyla prokázána, takže se intenzivně hledají nové prediktivní biomarkery. V progresi kolorektálního karcinomu hrají ústřední roli patologické aktivace signálních drah asociovaných s EGFR, ke kterým mohou vést aktivující mutace genů KRAS, BRAF, PIK3CA či inaktivace tumor supresorového genu PTEN. V současnosti jsou jako důležitý prediktor rezistence k terapii cetuximabem a panitumumabem uznávané mutace KRAS prokazatelné u 35–45 % kolorektálních karcinomů. Detekce mutací KRAS jsou také v klinické praxi používány. U nádorů, které nemají mutovaný gen KRAS, může být rezistence k anti-EGFR cílené terapii spojena s mutacemi v genech BRAF, PIK3CA či se ztrátou exprese proteinu PTEN. Na druhou stranu pozitivním prediktorem se jeví nadměrná exprese ligandů EGFR v nádorové tkáni. Rovněž profilování genové exprese by podle prvních výsledků mohlo přispět k rozhodování o indikaci léčby cetuximabem či panitumumabem. Tato pozorování si ovšem před zavedením do klinické praxe vyžadují další validaci v podmínkách prospektivních klinických studií.

Klíčová slova:
EGFR – cílená léčba – predikce – kolorektální karcinom

Karcinom tlustého střeva a konečníku je závažným a velmi častým onemocněním. Incidence kalkulovaná na evropský věkový standard je v ČR 51,0/10⁵ u mužů a 24,1/10⁵ u žen (1). V celosvětovém měřítku jsme v incidenci i mortalitě na hrozivém druhém místě, index mortalita/incidence ale setrvale klesá (2). Nehledě na pokroky v terapii, přežití u metastatického kolorektálního karcinomu (mCRC) zůstává špatné, s mediánem celkového přežití (OS) 18–21 měsíců (3). Systémová terapie na bázi fluoropyrimidinů v kombinaci s irinotekanem či oxaliplatinou je v posledních letech kombinována s biologickou léčbou monoklonálními protilátkami proti VEGF (bevacizumab) a EGFR (cetuximab, panitumumab) (4–6).

EGFR

Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR, Egfr, Her1) je členem rodiny receptorů s tyrozinkinázovou aktivitou. Po vazbě ligandu (epidermálního růstového faktoru, epiregulinu, amphiregulinu, aj.) vytváří homo- či heterodimery a aktivuje dvě hlavní intracelulární cesty přenosu: signální dráha RAS-RAF-MAPK je zodpovědná zejména za signalizaci proliferační; zatímco dráha PI3K-PTEN-AKT zprostředkovává buněčné přežití a podílí se na motilitě a invazivitě nádorových buněk (7,8) (obr. 1). Vazba protilátek na extracelulární doménu receptoru blokuje přenos této signalizace. EGFR je overexprimován u cca 85 % případů kolorektálního karcinomu. V současnosti jsou dostupné a pro léčbu mCRC schválené dvě monoklonální protilátky (cetuximab – chimerická myší/humánní a panitumumab – plně humánní). V monoterapii u mCRC je dosaženo celkové odpovědi (overall response rate, ORR) ve smyslu kompletní remise onemocnění (complete response, CR) nebo výrazné redukce nádorových buněk (partial response, PR) u 10 % pacientů. V kombinaci s chemoterapií pak přibližně u 20 % pacientů (5,6,9). U dalších zhruba 50 % pacientů dojde ke stabilizaci onemocnění (11–14). Údaje o vlivu na přežití bez progrese onemocnění (progression free survival, PFS) a zejména celkovém přežití (overall survival, OS) jsou rovněž příznivé. Obě protilátky jsou schváleny pro použití u pacientů s mCRC již předléčených nejméně jednou linií chemoterapie s irinotekanem či oxaliplatinou, při níž došlo k progresi onemocnění. Jak vidno, významné terapeutické odezvy se dočká jen malá část nemocných, ostatní jsou vystaveni nežádoucím účinkům terapie bez očekávaného benefitu. Vzhledem k tomu a ke značné nákladnosti této biologické léčby jsou v současnosti usilovně hledány klinické i laboratorní prediktory, které by dovolily selektovat ty pacienty, u nichž je pravděpodobnost terapeutické odezvy vysoká. Prvním známým faktorem je výskyt kožních projevů (akneiformní vyrážky apod.). Nemocní se závažným stupněm těchto účinků mají významně lepší měřitelnou odpověď na terapii cílenou na EGFR, a to nejen u mCRC (4,7,10), ale i u ostatních malignit. Jde však o faktor, který nelze rozeznat před nasazením terapie, nejedná se tedy v pravém smyslu slova o prediktor. Molekulární podstata tohoto jevu není zatím objasněna.

KRAS

Retrospektivní i prospektivní studie s cetuximabem ukázaly, že velmi silným negativním prediktorem léčebné odpovědi je přítomnost aktivující mutace v genu kódujícím protein KRAS (11–17). KRAS je protein sloužící přenosu signálu, patří spolu s NRAS a HRAS do jedné rodiny. Téměř všechny (95 %) aktivující mutace se vyskytují v exonu 1, a to v kodonech 12 a 13 (18). V této oblasti se nalézá doména, která se u aktivního KRAS podílí na defosforylaci GTP a tím opětovné deaktivaci KRAS. Protein se tak sám udržuje v neaktivním stavu a je aktivován pouze dočasně a krátkodobě (19). Zmíněné mutace vedou ke ztrátě této vlastnosti a ke konstitutivní aktivaci nezávislé na vazbě ligandu na receptor. Je tedy nasnadě, že ovlivnění vazby ligandu cetuximabem či panitumumabem se bude míjet účinkem, což je nyní již považováno za bezpečně ověřené. U pacientů s tumorem s mutovaným genem KRAS nebyla zaznamenána léčebná odpověď a ani u nich nedochází k prodloužení PFS či OS (11–17,20). Výsledky studie OPUS dokonce ukazují, že podávání anti-EGFR terapie může mít u pacientů s KRAS mutací negativní efekt na OS (15,21).

Jak FDA (Food and Drug Administration) tak EMA (European Medicines Agency) limitují nasazení obou léků pro pacienty s tumorem, jehož gen KRAS není mutován (wild type – KRAS wt). Toto testování probíhá rutinně i v České republice v laboratořích prediktivní patologie, podobně jako např. testování HER2 statusu. Používají se zejména dvě metody – alelicky specifická PCR a přímé sekvenování (22).

Mutace KRAS je vysoce specifickým negativním prediktorem odpovědi (specificita 93 %), avšak senzitivita tohoto testu je nízká (43 %). Identifikuje pouze 35–45 % pacientů neodpovídajících na terapii (23). V současné době je známo několik velmi pravděpodobných mechanizmů, které, podobně jako mutace KRAS, způsobují rezistenci k léčbě cílené na EGFR. Jedná se o molekulární změny dalších prvků signálních drah aktivovaných EGFR, které rovněž vedou k jejich patologické aktivaci.

BRAF

Za nejprokázanější z těchto dalších mechanizmů je v současnosti považována přítomnost mutace genu BRAF, který kóduje stejnojmennou serin/threoninovou proteinkinázu účastnící se přenosu signálu v signální dráze MAPK (mitogen-activated protein kinase) podobně jako KRAS. Jedná se o jedinečnou mutaci v exonu 15 BRAF V6OOE, tj. záměna valinu za kyselinu glutamovou, která se vyskytuje u cca 7–10 % pacientů (24–28). Důležité je, že mutace KRAS a BRAF se nevyskytují v jednom nádoru společně, což ukazuje na to, že jejich efekt pro nádorovou transformaci buňky je podobný (20,29,30). Bylo opakovaně doloženo, že u pacientů s mutací BRAF léčba cetuximabem či panitumumabem prakticky nikdy nemá měřitelný efekt (25,28,31). Zároveň bylo prokázáno, že mutace BRAF je negativním prognostickým znakem, tedy že pacienti s detekovanou mutací BRAF mají horší prognózu bez ohledu na podávanou léčbu (26–28,32).

K inhibici BRAF lze použít řadu inhibitorů (např. sorafenib), jejichž účinek byl prokázán v buněčných modelech (31) a jsou v současnosti ve fázi klinického testování.

PI3K

Druhou signální dráhou aktivovanou EGFR je dráha AKT, jejímž prvním intracelulárním členem je PI3 kináza. Její aktivační podjednotka PIK3CA fosforyluje malou molekulu PI2P na PI3P a ta dále aktivuje skupinu AKT-kináz. PIK3CA může nést aktivující mutace v exonu 9 a 20, což se skutečně prokazuje u cca 10 % nemocných s mCRC (33–35). Tyto mutace pak vedou k trvale aktivnímu stavu PI3K a konstitutivní aktivaci uvedené dráhy, opět nezávislé na vazbě ligandu na EGFR. Studie u pacientů léčených EGFR monoklonálními protilátkami většinou potvrdily teoretický předpoklad, že tyto mutace jsou asociovány s absencí léčebné odpovědi (26,33,34). Některé práce však přinesly opačné výsledky (35), což význam mutací PIK3CA pro predikci odpovědi zpochybnilo. Recentní práce na velkém souboru nemocných (kde již bylo možné separátně hodnotit mutace v exonu 9 a exonu 20) ukazuje, že klinický význam má pravděpodobně pouze mutace v exonu 20 (36).

PTEN

Velmi podobně se jeví situace i v případě molekuly PTEN. PTEN vede k defosforylaci PI3P a udržuje tak signální dráhu neaktivní. Ztráta funkce PTEN (ať už způsobená delecí, mutací nebo hypermetylací promotoru) vede k trvalé aktivaci dráhy EGFR-PI3K-AKT. V buněčných liniích bylo prokázáno, že ztráta exprese PTEN je spojena s rezistencí k cílené anti-EGFR terapii (33,37). I zde jsou zatím publikované klinické výsledky nekoherentní, i když většina z nich silně podporuje zmiňované teoretické předpoklady (38–41). Problémem je metodika detekce ztráty funkce PTEN. Používá se nejčastěji kvantifikace imunohistochemicky prokazovaného proteinu v nádorových buňkách. Metodiky jsou však zcela nejednotné a výsledky proto obtížně porovnatelné. Studie různých autorů se liší použitou monoklonální protilátkou, metodikou semikvantitativního hodnocení i nastavením hraniční hodnoty pro ztrátu PTEN.

Overexprese EGFR

V počátcích cílené léčby monoklonálními protilátkami proti EGFR byl považován za pozitivní prediktor imunohistochemický průkaz overexprese EGFR. Ani zde kvantitativní imunohistochemie nepřinesla spolehlivé výsledky (ať již kvůli rozdílné senzitivitě používaných protilátek či kvůli nemožnosti standardizovat preanalytickou fázi, zejména délku a typ použité fixace tkáně) (42). V současné době se považuje za nezvratně prokázané, že IHC detekovaná overexprese EGFR není prediktorem odpovědi na cílenou inhibici EGFR (4–7,43).

Amplifikace EGFR

Dalším předpokládaným pozitivním prediktorem byla amplifikace genu EGFR (44,45). V publikovaných studiích je jako hraniční hodnota obvykle užíván průměrný počet kopií genu EGFR mezi 2,5–3 kopie na jádro, jde tedy o velmi nízké až hraniční zvýšení. Nicméně při takto nastavené hodnotě (jedná se o cca 30 % tumorů) je prokazatelná lepší odpověď nádorů s vyšším počtem kopií EGFR genu na anti-EGFR terapii. Je otázka, co vlastně počet necelé 3 kopie genu ukazuje. Může odrážet jen pouhou proliferační aktivitu nádoru a tedy počet buněk prošlých S fází buněčného cyklu, nebo odlišuje skupiny nádorů s různým stupněm chromozomální nestability. Při hraniční hodnotě 6 kopií genu na jádro je již zastoupení tumorů s amplifikací EGFR jen 10% (44–47). Případů s výrazně zvýšeným počtem kopií genu EGFR v buňce je mezi všemi kolorektálními karcinomy jen kolem jednoho procenta (48,49) a většina pacientů se zaznamenanou léčebnou odpovědí amplifikaci genu EGFR nemá. Jeví se proto jako neefektivní testování amplifikace provádět.

Mutace a polymorfizmy EGFR

Sporadicky se objevují práce ukazující význam germinálních polymorfizmů genu EGFR. Jejich význam je zatím nejistý (50,51).

Aktivující somatické mutace v genu EGFR, které jsou prediktorem účinnosti léčby nízkomolekulárními inhibitory tyrozinkinázové aktivity u nemalobuněčného karcinomu plic, se u kolorektálních karcinomů prakticky nevyskytují (44,52).

Genové expresní profily

Metoda genových expresních profilů ukázala na další potenciálně zajímavý faktor s prediktivní informací. Je jím exprese ligandů EGFR, zejména epiregulinu a amphiregulinu (53,54). Předpokládá se, že zvýšená exprese těchto ligandů ukazuje na aktivovanou proliferační signalizaci nádorově transformované buňky právě prostřednictvím zvýšené produkce ligandů EGFR, ať už autokrinní či parakrinní smyčkou, případně jiným způsobem. Podle zmíněného principu exkluzivity by potom nebylo pro malignizující buňku nutné vytvářet další změny pokrývající potřebu trvalé mitogenní signalizace, když už je to jedním mechanizmem zajištěno. Je tedy velmi pravděpodobné, že buňka závislá ve své proliferaci na overexpresi ligandů nebude nést mutace KRAS, BRAF, PI3K apod. Pacienti s overexpresí zmíněných molekul mají lepší klinickou odpověď na cílenou monoklonální EGFR terapii (38,53,54). Ojedinělé práce nalézají, podobně jako například u karcinomů mléčné žlázy, genové „podpisy“, jež mají predikovat senzitivitu k anti-EGFR léčbě (55,56). Je pravděpodobné, že analogicky jako u karcinomů prsu se budou takové studie opakovaně objevovat, ale že jejich výsledky budou velmi obtížně porovnatelné a klinicky málo použitelné.

SOUČASNÝ STAV PREDIKTIVNÍ DIAGNOSTIKY METASTAZUJÍCÍHO KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU V ČR

V současné době se provádí vyšetřování mutačního stavu genu KRAS v těchto zařízeních: Všeobecná fakultní nemocnice a Fakultní Thomayerova nemocnice s poliklinikou v Praze, Fakultní nemocnice v Hradci Králové, Masarykův onkologický ústav v Brně, Fakultní nemocnice v Olomouci, Bioptická laboratoř s.r.o. v Plzni, P&R LAB a.s. v Novém Jičíně a CGB laboratoř a.s. v Ostravě. Tyto laboratoře musejí být akreditovány podle normy ČSN EN ISO 15 189.

Vyšetření indikuje ošetřující onkolog podle pravidel léčby mCRC daných tzv. modrou knihou České onkologické společnosti. Indikace tedy nepřísluší patologovi, což je podstatný rozdíl oproti povinnosti zajistit vyšetření stavu Her-2 u karcinomů prsu. Vyšetřeným materiálem je typicky tkáň v parafinovém bloku, může být použit i nebarvený řez na podložním skle, zmražená tkáň či jakýkoliv jiný vzorek obsahující nádorové buňky v dostatečném množství.

S ohledem na registrační studie je plátci péče stále požadováno imunohistochemické vyšetření exprese EGFR, přestože byla již mnohokrát jednoznačně potvrzena absence jeho prediktivní hodnoty (viz výše).

Úhrada vyšetření se podle dohody s plátci zdravotní péče děje prostřednictvím nově vytvořených výkonů prediktivní diagnostiky. Tyto výkony byly nasmlouvány jako nové kapacity a hrazeny výkonově, mimo paušál (situace na pracovišti autorů). Na posledním jednání Fóra onkologů v květnu 2011 však od zástupců pojišťoven zazněl jasný signál, že úhrada celé prediktivní diagnostiky bude zahrnuta v paušálech, což může znamenat jejich zastavení vyšetřování v těch zařízeních, která jsou placena paušálem. Logickým krokem by pak byl přesun všech vyšetření do laboratoří s výkonovou úhradou, takže pojišťovny vyšetření stejně zaplatí s tím, že umožní vznik faktických monopolů, a to na podkladě nerovně nastavených podmínek.

ZÁVĚR

Recentní práce (57–61) shrnují shora uvedené poznatky a navrhují komplexní testování metastatického kolorektálního karcinomu pro predikci efektu terapie monoklonálními protilátkami proti EGFR. Nádory s KRAS(wt) by se měly testovat na přítomnost mutací BRAF, PIK3CA, ztrátu exprese PTEN a případně i overexpresi epiregulinu a amphiregulinu. Tumory, které neponesou mutaci BRAF ani PIK3CA, budou mít zachovanou expresi PTEN (případy tzv.„quadruple negative“) a případně budou i overexprimovat jeden z ligandů EGFR, by měly být nejlepšími kandidáty pro cílenou anti-EGFR terapii.

Problémem je, že shora uvedené negativní prediktory, byť biologicky dobře odůvodněné, jsou dokladovány na malých souborech (30–130 pacientů). V rámci těchto souborů je bohužel značná heterogenita zařazených pacientů (stupeň předléčenosti chemoterapií, lokalizace primárního tumoru, stav mikrosatelitní nestability aj.), dále je hodnocení zatíženo ztrátami některých parametrů (analýza vzorků se nezdařila nebo již nebyl dostatek materiálu), a tak mnohé slibně vyhlížející výsledky nedosahují statistické významnosti. Zejména však všechny uvedené práce, až na jednu výjimku (61), neprovedly multivariantní analýzu, takže často se nedá s jistotou určit, zda publikovaný znak je nezávislý prediktivní faktor, anebo spíše negativní prognostický faktor asociovaný s vyšším rizikem progrese a úmrtí bez ohledu na použitou léčebnou modalitu.

Sumárně lze říci, že za prokázaný negativní prediktor odpovědi na cílenou anti-EGFR terapii u mCRC se považují jednoznačně mutace KRAS (testování je již v klinické praxi, včetně ČR, prováděno). Velmi pravděpodobně ke klinickému použití spěje i testování mutace BRAF.

PODĚKOVÁNÍ

Podpora: MZ ČR – výzkumný záměr FUNDIN MZ0MOU2005; MŠMT ČR – BBMRI_CZ (LM2010004).

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Pavel Fabian, Ph.D.

Oddělení onkologické a experimentální patologie

Masarykův onkologický ústav, Žlutý kopec 7, 656 53 Brno

e-mail: fabian@mou.cz

tel: +420 543133400