Molekulární testování melanocytárních lézí

Súhrn

Využití molekulárně biologických a cytogenetických metod a rozvoj poznatků týkající se molekulární podstaty melanocytárních nádorů je v posledních letech na vzestupu. Okruhy zájmu zahrnují nejen diagnostiku a oblast prediktivní patologie, ale např. i genetické poradenství a molekulární klasifikaci melanocytárních lézí. V následujícím textu jsou probrány současné poznatky týkající molekulární podstaty maligního melanomu, využití molekulárně biologických a zejména cytogenetických metod v diferenciální diagnostice sporných melanocytárních lézí a problematika prediktivního testování.

Klíčová slova:
cytogenetika - diagnostika - maligní melanom - molekulární biologie - predikce

Maligní melanom (MM) patří celosvětově mezi nejčastější nádorová onemocnění. Molekulární testování MM se dostává stále více do popředí ať už v rámci diagnostiky, nebo predikování odpovědi na cílenou léčbu. S ohledem na diagnostiku je snahou využít molekulárně biologické a cytogenetické metody zejména u sporných melanocytárních lézí, jejichž biologickou povahu nelze stanovit pouze na podkladě histologických rysů. Tyto hraniční léze představují velmi problematickou a komplikovanou oblast patologie a využití pomocných metod při stanovení jejich biologické povahy je nanejvýše žádoucí. Další oblastí využívající metod molekulární biologie je oblast prediktivní patologie, která má přímý dopad na druh použité léčby. Léčebné možnosti MM kromě standardních postupů jako je chirurgická léčba, chemoterapie a radioterapie, zahrnují i moderní postupy imunoterapie a cílené léčby s využitím ATP-kompetitivního inhibitoru kinázové domény BRAF (vemurafenib) (1). Imunoterapie (ipilimumab, IL-2, nivolumab) je v současné době zřejmě jediná léčba, která má kurativní potenciál i u metastázujícího MM, byť pouze u malého procenta pacientů (2). Pro tuto léčbu však v současné době nemáme na molekulární úrovni definovaný prediktor a v dalším textu se problematikou imunoterapie nezabýváme. Celkově je využití molekulárně biologických a cytogenetických metod v problematice MM vázáno na znalosti vyplývající z molekulární podstaty tohoto onemocnění. V následujícím textu jsou probrány současné poznatky týkající se tumorigeneze MM, využití molekulárně biologických a cytogenetických metod v diferenciální diagnostice sporných melanocytárních lézí a problematika prediktivního testování MM.

TUMORIGENEZE MALIGNÍHO MELANOMU

Molekulární mechanismy související s rozvojem a progresí MM nejsou zcela jednoznačné. S ohledem na patogenezu se jedná o komplexní onemocnění související s genetickými aberacemi, ale i epigenetickými změnami (metylace DNA), nekódující RNA a změnami na úrovni proteinů (modifikace histonů, remodelace chromatinu a další) (3,4). Určité procento pacientů má pro vznik tohoto nádoru zvýšenou hereditární predispozici, která nejčastěji souvisí se zárodečnou mutací CDKN2A (obr. 1) (5). Další geny s předpokládaným vlivem na vznik MM, avšak s nízkou penetrancí, zahrnují např. BRCA2 a MCR1 (melanocortin-1-receptor) (6,7). S ohledem na další genetické aberace vyskytující se na úrovni somatických mutací se zdá být nejvýznamnější signální kaskáda MAP kinázy (mitogenem aktivované protein kinázy), která zahrnuje několikastupňovou fosforylační kaskádu produktů genů RAS-RAF-MEK-ERK (obr. 2). Výskyt somatických mutací genu NRAS a BRAF je popisován u melanocytárních névů i MM a zřejmě představuje časnou změnu v rozvoji melanocytárních nádorů. Většina MM vykazuje mutaci v některém z genů této kaskády (8,9). Somatické mutace těchto genů se zdají být u MM vzájemně vylučující alespoň na úrovni jedné buňky, vzácně jsou však popsány současně v jednom nádoru v různých buňkách v souvislosti s heterogenitou nádorové populace (10). Další signální kaskádou často aktivovanou u MM je cesta PIK3K-AKT-mTOR. Na progresi MM jsou však zřejmě zapotřebí další genetické aberace hlavně onkosupresorických genů, jako např. CDKN2 a PTEN (11).

VYUŽITÍ CYTOGENETICKÝCH METOD U BĚŽNÝCH MELANOCYTÁRNÍCH LÉZÍ

Diagnostika melanocytárních lézí je ve většině případů jednoznačná. Existují však sporné léze, které vykazují atypické rysy a stanovení jejich biologické povahy je na úrovni světelné mikroskopie obtížné. Situace je komplikována tím, že nejsou jednoznačná objektivní a reprodukovatelná kritéria, která by byla specifická pro příslušnou lézi a existuje poměrně výrazná variabilita mezi jednotlivými hodnotiteli i na úrovni specializovaných dermatohistopatologů. Snahou je proto identifikace markerů, které by mohly být při stanovení biologické povahy melanocytárních lézí nápomocné. V minulosti bylo publikováno několik prací zaměřených na tuto problematiku využívajících k nalezení chromozomálních aberací metody komparativní genomové hybridizace (CGH). Ve studii z roku 2003 analyzující 132 melanomů a 54 benigních névů byly u většiny maligních melanomů (96 %) prokázány mnohočetné chromozomální aberace, zejména zisky v oblasti 6p, 1q, 7p, 8q, 17q, 11q a 20q a ztráty v oblasti 9p, 9q, 10q, 10p a 6q (12). U benigních névů byly nalezeny chromozomální změny u 7 lézí (13 %), které odpovídaly névu Spitzové, avšak chromozomální aberace (zisk krátkého raménka chromozómu 11) byla odlišná od změn vyskytujících se u MM. Ztráty v oblasti chromozómu 9 jsou u MM obzvláště časté (až v 80 % případů) a zřejmě se vyskytují již v časných fázích tumorigeneze. Změny v chromozómu 6 (ztráta 6q, zisk 6p) se zřejmě vyskytují v souvislosti s progresí nádoru. Tyto změny se také zdají souviset s horší prognózou nádoru (13). Oproti tomu benigní névy (s výjimkou névu Spitzové) chromozomální aberace vykazují velmi vzácně.

Na podkladě těchto poznatků byl vyvinut komerčně dostupný kit sestávající ze 4 sond zaměřených na nejčastěji se vyskytující aberace: tři z nich jsou lokus specifické sondy, konkrétně 6p25 (RREB1), 6q23 (MYB) a 11q13 (CCND1) a čtvrtá je centromerická sonda chromozomu 6 (CEP6) (14-19). Recentně bylo publikováno několik studií využívajících tento kit, které se zaměřily na jeho využití v diagnostice MM. Jedna z těchto studií se zaměřila na využití sond při stagingu MM asociovaného s benigním névem (36 případů, aberace se prokázaly pouze v oblasti MM u 28 případů (78 %) a u všech 6 případů névoidního MM použitých jako kontrolní skupina) (20). Další studie analyzovala skupinu 10 névoidních MM a 10 mitoticky aktivních névů, přičemž chromozomální aberace se prokázaly u všech MM, u névů se nevyskytly (16). Jinou analyzovanou oblastí bylo rozlišení mezi intranodálním névem a metastázou MM. Chromozomální změny byly prokázány u 20/24 metastáz MM (83 %) a pouze u 1/17 nodálního névu (6 %) (14). Studie zaměřená na rozlišení mezi dezmoplastickým melanomem a sklerozujícím névem prokázala ve skupině 15 dezmoplastických melanomů chromozomální alterace u 7 lézí, zatímco všech 15 sklerozujících névů bylo bez těchto změn (19). Další studie analyzující epiteloidní modré névy a kožní metastázy MM napodobující modrý névus v souboru 10 epitelodních modrých névů neprokázala chromozomální změny u žádného případu, oproti tomu 9/10 (90 %) metastáz vykazovalo chromozomální aberace (18). Obdobně v jiné práci analyzující 12 buněčných modrých névů a 5 MM napodobujících tento névus byla prokázaná 100% senzitivita i specifita a stejně vysoká senzitivita i specifita (100 %) byla zastižena na souboru 4 névů a 8 MM spojivky (22,23). Jako pomocný marker byla metoda testována u melanocytárních lézí s prominentní pagetoidní melanocytózou (24). Studie analyzovala 24 těchto lézí se zaměřením na interpersonální variabilitu (hodnotili 3 specialisté v dermatopatologii) a výskyt chromozomálních aberací. U 17 případů (71 %) byla mezi hodnotiteli diagnostická shoda, u 7 případů (29 %) byly s ohledem na diagnózu výrazné rozpory. U 6 lézí hodnotiteli diagnostikovaných jako benigní nebyly u žádného případu zastiženy chromozomální aberace. U lézí hodnocených jako MM byly aberace nalezeny u 5/7 případů (71 %). 2/11 lézí hodnocených jako nejisté biologické povahy měly prokázané chromozomální aberace (jedna z těchto lézí v reexcizi vykazovala jednoznačné morfologické známky MM). Výsledky jedné recentní studie zaměřené na hodnocení melanocytárních lézí se spornými rysy však naopak poukazují na poměrně nízkou senzitivitu i specifitu vyšetření tímto kitem (metodou FISH) i nedostatečnou korelaci s výsledky CGH, soubor však není jednoznačně definován a zahrnuje i spitzoidní léze (u kterých se vyskytují jiné chromozomální aberace) (25). Faktem však zůstává, že popsané studie obvykle analyzují pouze malé soubory a limitace je také v některých případech dána poměrně krátkým follow-up, zejména u sporných lézí.

Vyšetření metodou FISH se zmíněnými sondami lze tedy v určitých případech použít jako pomocný marker, nicméně nejedná se o test, který by jednoznačně umožnil stanovení biologické povahy příslušné melanocytární léze. Recentní práce udává další zvýšení senzitivity i specifity při zahrnutí dalších sond, zejména 9p21 (CDKN2), a navrhuje pro diagnostiku nový algoritmus (26). Nutné je také vzít v potaz technické aspekty vyšetření včetně možnosti falešné pozitivity i falešné negativity, variability mezi jednotlivými hodnotiteli, výskytu polyploidie a stejně jako u jiných molekulárních vyšetření inadekvátnosti vzorku pro analýzu (obecně udávané mezi 3 - 5 % vzorků). Zásadně důležité je však v tomto kontextu nastavení hraničních hodnot, které mohou výrazně ovlivnit senzitivitu i specifitu. Hranice, při které je výsledek konkrétní sondy nahlížen jako abnormální, se v některých případech mezi jednotlivými studiemi poněkud liší (27,28). Stejně jako u jiných vyšetření, zvýšení hraničních hodnot zvyšuje specifitu na úkor senzitivity a obráceně. Jako pozitivní je podle původních kritérií nahlíženo vyšetření při nalezení alespoň jedné chromozomální aberace s hraničními hodnotami: >38 % hodnocených buněk s > 2 signály pro CCND1; >55 % buněk s více signály pro RREB1 než pro CEP6; > 40 % buněk s méně signály pro MYB než pro CEP6; > 29 % buněk s více než 2 signály pro RREB1 (15).

VYUŽITÍ CYTOGENETICKÝCH METOD U MELANOCYTÁRNÍCH LÉZÍ SE SPITZOIDNÍMI RYSY

Většina lézí se spitzoidními rysy je na podkladě morfologických kritérií klasifikována jako Spitzové névus, nebo spitzoidní MM. Přesto však existuje poměrně malá, nicméně důležitá skupina těchto lézí, u které nelze biologickou povahu jednoznačně stanovit. Tyto léze bývají označovány jako atypický névus Spitzové (ASN), atypický Spitzové nádor, či jako spitzoidní melanocytární proliferace nejisté biologické povahy (29,30). Častý je u nich výskyt metastáz do sentinelových lymfatických uzlin (téměř v 50 %), přesto však mají poměrně dobrou prognózu. Pokud jde o přítomnost chromozomálních změn, asi u 15 % benigních névů Spitzové se vyskytuje amplifikace 11p, zbylé léze jsou bez prokazatelných chromozomálních změn (31). Několik prací se zaměřilo na charakteristiku genetických změn vyskytujících se u spitzoidních lézí (27,28). V jedné práci byla prokázána přítomnost chromozomálních aberací u 7/16 (44 %) ASN. Tyto aberace však byly heterogenní bez možnosti stanovení jasné molekulární signatury společné pro analyzované případy. Všechny případy byly také analyzovány metodou FISH s využitím výše popsaného komerčně dostupného kitu, který však nebyl schopen detekovat chromozomální aberace u žádného případu. U 1/8 névů Spitzové byla nalezena amplifikace 11p15.5-p12 (28). Výsledky této studie však nejsou v souladu s dalšími pracemi. V jedné z těchto prací byly pomocí komerčně dostupného kitu metodou FISH prokázány u ASN aberace u 6/25 případů (24 %). V kontrolní skupině byly prokázany aberace u 2/10 névů Spitzové a u 9/10 MM se spitzoidními rysy (27). Další recentní práce analyzovala 75 ASN (64 s benigních chováním, 11 s metastázujícím nádorem) s použitím komerčně dostupného kitu ve srovnání s jinou kombinací sond zahrnující oblast 6p25, 9p21, 11q13 a 8q24 (32). Všech 11 případů metastázujícího ASN vykazovalo alespoň jednu z detekovaných chromozomálních aberací. U 9 z těchto pacientů byla detekována delece 9p21. Další časté změny představoval zisk 6p25 a 11q13. Ve skupině 64 ASN s benigním chováním byly chromozomální aberace zastiženy v 15 případech (23,4 %). Změny v 8q24 časté v névoidním či amelanotickém nodulárním melanomu se ve skupině ASN vyskytovaly pouze zcela výjimečně.

PREDIKTIVNÍ TESTOVÁNÍ U MALIGNÍHO MELANOMU

U značné části pacientů s MM se vyskytují mutace v genu BRAF (výskyt je v literatuře udáván mezi 33 - 66 % MM) (33,34). Tento gen je součástí signální dráhy MAP-kinázy (RAS-BRAF-MEK-ERK). Většina mutací je aktivačních a způsobuje proliferaci buněk nezávisle na signalizaci RAS. V současné době je k dispozici reverzibilní ATP-kompetitivní inhibitor kinázové domény BRAF (vemurafenib). Tento lék je schválen pro použití u pacientů s metastázujícím či inoperabilním MM starších 18 let, u kterých je prokázána aktivační mutace genu BRAF. Možným problémem je však řada vedlejších nežádoucích účinků léčby, z nichž nejzávažnější je možnost spinocelulárního karcinomu kůže či keratoakantomu, reaktivace dráhy MAPK a porucha ostatních signálních drah zejména PIK3/Akt a zvýšená aktivita kinázy PDGFR-β nebo IGF-1R (35). Naprostá většina mutací genu BRAF jsou aktivační mutace V600, které představují více než 95 % všech mutací. Ve většině těchto případů jde o náhradu valinu na pozici 600 v aminokyselinové sekvenci genu BRAF (V600E) za kyselinu glutamovou. Ostatní mutace (V600K, V600R, V600D a V600M) jsou poměrně vzácné, nicméně údaje o jejich počtu se v jednotlivých studiích liší a odlišné mutace než V600E jsou variabilně udávány mezi 6 - 30 % případů (34). V recentní studii bylo zastoupení mutací V600 následující: V600E 79 %, V600K 12 %, V600R 5 % a V600M 4 % (36). Terapeutický efekt je prokázán pouze v případě mutace V600E a V600K. Senzitivní na léčbu jsou pravděpodobně také pacienti s mutací V600G a V601, avšak pro určení významu těchto a jiných mutací je zapotřebí dalších studií. Vlastní testování přítomnosti mutace BRAF lze provádět více metodami, z nichž každá má své výhody i nevýhody a jejich rozbor je nad rámec tohoto článku. Současně s vemurafenibem byl však firmou Roche vyvinut i diagnostický kit (Cobas® 4800 BRAF V600 Mutation Test). Podle údajů výrobce je tento test schopný detekovat alespoň 96 % mutací V600E při 5 % mutovaných alel. Kromě toho identifikuje i mutace V600K a V600D, tyto mutace jsou však detekovány s nižší účinností a ve vzorku musí být přítomno ≥ 18 % mutovaných alel. Nevýhodou testu je, že v současné době nedokáže detekovat ostatní vzácné mutace a také neumožňuje rozlišit, o jaký typ mutace se jedná. Za zmínku stojí, že v současné době je komerčně dostupná imunohistochemická protilátka proti V600E. Výsledky však nejsou zcela přesvědčivé, někteří autoři udávají 100% shodu mezi molekulárně biologickými metodami a IHC, jiní naopak prokázali určité procento falešně pozitivních i falešně negativních výsledků, a tato protilátka kromě toho také není schopná (zřejmě s výjimkou ojedinělých případů) detekovat vzácné mutace (34,37,38).

Stejně jako při hodnocení prediktivních markerů u jiných nádorů je otázkou, kdy a které pacienty testovat, jak zajistit co nejkratší dobu testování (zahrnující samozřejmě i interval od žádosti po dodání bloku do testující laboratoře) a jakou testovací metodu použít. V současné době je v ČR testování prováděno na žádost klinika u vybraných pacientů vhodných pro léčbu vemurafenibem. Nicméně je otázkou, jestli je tento způsob optimální. Algoritmus pro testování BRAF byl recentně diskutován a publikován na úrovni panelu expertů v UK (33). Okruhy, které byly diskutovány, zahrnovaly: 1) který pacient má být testován a na čí žádost; 2) jaký test má být použit a v jaké laboratoři má být test proveden; 3) management pacientů s MM. Některé závěry z tohoto setkání, zejména týkající se bodu 1 a 2, mohou být zajímavé i pro nás.

1. S ohledem na náklady a očekávaný význam testování bylo dosaženo shody v tom, že i přes výhody vyplývající z automatického testování všech pacientů v době diagnózy je toto v současné době ekonomicky neúnosné, nicméně testování až v době založení metastáz je doprovázeno značným rizikem zpoždění dodání výsledku a tím i odkladem léčby, zejména z toho důvodu, že k metastázování může docházet až po mnoha letech a dle zkušeností expertů někdy dodání parafinového bločku do vyšetřující laboratoře od podání žádosti trvá i několik týdnů. Konsenzus je testovat všechny pacienty ve stadiu IIb a vyšším, tj. pacienty s nádorem o tloušťce > 2 mm s ulcerací, > 4 mm bez ulcerace, nebo jakékoliv tloušťky s metastázami do lymfatických uzlin či jiných lokalit.
2. S ohledem na způsob testování a laboratoř došlo ke konsenzu, že i přes to, že Cobas test je jediný test schválený FDA pro toto vyšetření, v UK není důležité jaký test a kde je proveden, ale to, aby se jednalo o akreditovanou laboratoř a validovaný postup splňující všechny požadavky s ohledem na kontrolu kvality včetně EHK.

Dalším sporným bodem může být, jakou tkáň testovat, tj. jestli je vhodnější primární nádor nebo metastáza. Problematika heterogenity na úrovni primárního nádoru i metastáz není u melanomu stejně jako u jiných nádorů doposud objasněna. Některé studie nalezly vyšší procento mutací v metastázách nežli v primárních nádorech, jiné však toto neprokázaly (39,40). Stejně tak jsou popsány případy s metastázami s různým mutačním stavem genu BRAF a to i v rámci jedné metastázy (41). Popisována je s ohledem na mutační stav BRAF vyšší konkordance mezi primárním nádorem a viscerálními metastázami a metastázami do lymfatických uzlin než mezi primárním nádorem a metastázami do kůže či mozku (39). Odlišnosti v mutačním stavu na úrovni typu i četnosti mutací jsou závislé i na lokalizaci nádoru (primárního i metastázy - např. byl popsán častější výskyt mutací v kožních metastázách ve srovnání s viscerálními), popsány jsou i geografické (rasové) rozdíly (39-42).

ZÁVĚR

Využití molekulárně biologických metod v problematice melanocytárních lézí nabývá neustále na významu. I přes značný pokrok a množství studií zabývajících se danou problematikou zůstává stále dosti nejasností nejen s ohledem na diagnostické využití v rámci odlišení sporných melanocytárních lézí, ale i v rámci prediktivní diagnostiky. Kromě problematiky zmíněné v textu je snahou využít molekulární metody i např. v rozvoji klasifikačního systému MM založeného na kombinaci morfologie a molekulárních alterací, který by umožnil stratifikovat pacienty s MM do skupin na podkladě patogeneze, prognózy a predikce odpovědi na léčbu. V neposlední řadě také probíhá výzkum v oblasti identifikace nových biomarkerů zaměřených na diagnostiku i nalezení nových terapeutických možností. Praktickým dopadem je možnost identifikace jedinců se zvýšeným rizikem vzniku MM (např. pacienti s germinální mutací CDKN2A a/nebo CDK4), kteří by mohli profitovat z aktivního sledování se snahou o zachycení časných stádií.

Poděkování

Práce byla podpořena projektem PRVOUK-P27/LF1/1

Adresa pro korespondenci:

Doc. MUDr. Pavel Dundr, Ph.D.

Ústav patologie 1. LF UK v Praze a VFN

Studničkova 2, 128 00 Praha 2

e-mail: pdundr@seznam.cz

tel.: 224968624

fax: 224911715