Porovnání stanovení katalytické koncentrace ALP rutinní metodou ALP (Roche Diagnostics) a metodou Alkalická fosfatáza (BLW Diagnostics)

Súhrn

Cíl studie:
Porovnat stanovení celkové katalytické koncentrace alkalické fosfatázy v séru nebo plazmě rutinní metodou ALP (Roche Diagnostics, dále jen ALP_Roche) s metodou Alkalická fosfatáza (BLW Diagnostics, dále jen ALP_BLW), u které je deklarován soulad s primární referenční metodou IFCC z roku 2011. Posoudit vliv standardizace stanovení ALP na hodnocení výsledků pacientských vzorků.

Název a sídlo pracoviště:
Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně (FNUSA).

Materiál a metody:
Byl zpracován soubor 135 vzorků od pacientů vyšetřených ve FNUSA. Ve všech vzorcích byla současně stanovena katalytická koncentrace ALP rutinní metodou ALP (Roche Diagnostics) na analyzátoru Modular P a metodou Alkalická fosfatáza (BLW Diagnostics) na analyzátoru Cobas c311. Byla testována nulová hypotéza, že průměrné diference mezi porovnávanými výsledky se statisticky významně neliší od nuly. Ke statistickému hodnocení dat byl použit párový t-test, Wilcoxonův test a test podílu rozptylů (F-test). Bylo provedeno hodnocení systematických odchylek mezi výsledky obou metod a rozdíl v klinickém hodnocení výsledků.

Výsledky:
V testovaném souboru byl rozdíl v hodnotách ALP stanovených metodou Roche a BLW statisticky významný. Průměrný rozdíl mezi hodnotami ALP_BLW a ALP_Roche byl ve skupině všech pacientských vzorků 0,58 µkat/l. Průměrná hodnota ALP_Roche byla 3,036 µkat/l, 95%CI (2,165 – 3,906 µkat/l). Průměrná hodnota ALP_BLW byla 3,615 µkat/l, 95%CI (2,563 – 4.666 µkat/l). Ve skupinách vytvořených podle pohlaví bylo u žen 12 % a u mužů 17 % výsledků ALP, které byly rozdílně hodnoceny z hlediska překročení horních mezí referenčních intervalů metod ALP_BLW a ALP_Roche.

Závěr:
Výsledky stanovení ALP metodami ALP_Roche a ALP_BLW byly statisticky významně odlišné. 12 % výsledků u žen a 17 % výsledků u mužů, které byly v referenčních mezích dle ALP_Roche, bylo nad horním limitem referenčního intervalu dle ALP_BLW.

Klíčová slova:
alkalická fosfatáza (ALP), referenční metoda, rutinní metoda, referenční interval.

Úvod

Stanovení katalytické koncentrace alkalické fosfatázy (ALP) v séru nebo plazmě patří mezi základní biochemická vyšetření. Kvalita výsledků z rutinních biochemických laboratoří však nedosahuje očekávané úrovně zejména s ohledem na nedostatečnou standardizaci metody [1]. Z výsledků externího hodnocení kvality [2] je možné usuzovat, že nastavení referenčních mezí stanovení ALP by mělo být přísně vázáno na použitou metodu, výrobci testovacích souprav se však ve svých dokumentech odkazují na literární zdroje.

S rutinně používanou testovací soupravou ALP výrobce Roche Diagnostics se stanovuje ALP na principu metodiky vypracované expertní skupinou IFCC v roce 1983 [3]. Tato metodika však nikdy nebyla oficiálně IFCC odsouhlasena [4]. Firma Roche v roce 2001 tuto metodu stanovení ALP nově aplikovala pro systémy Roche/Hitachi při teplotě 37 ºC [5]. V roce 2014 byla upravena kalibrace rutinní metody (firemní kalibrátor byl reasignován) s cílem snížit bias vůči nově doporučené IFCC metodě pro stanovení ALP [4]. Doporučené referenční rozmezí zůstalo beze změn [5].

V roce 2015 uvedla na trh firma BLW novou testovací soupravu Alkalická fosfatáza (IFCC), která deklaruje soulad s primární referenční metodou IFCC pro stanovení ALP při 37 ºC z roku 2011. Pro tuto metodu byly doporučeny referenční meze na základě studie provedené na souboru 266 pacientů ze tří evropských zemí, (muži ≥ 20 let, ženy 18-49 let) [4].

Soubor a metody

Soubor nemocných

K vyšetření bylo použito celkem 135 vzorků plazmy nebo séra z období prosinec 2015 a leden 2016, u nichž bylo požadováno stanovení ALP. Krev na biochemická vyšetření byla odebírána do zkumavek Sarstedt o objemu 7,5 ml a 4,9 ml s gelovým aktivátorem srážení (sérum) nebo do zkumavek Sarstedt o objemu 4,9 ml a 2,7 ml s gelem a Liheparinem (plazma). Výběr vzorků byl prováděn náhodně s cílem získat přibližně stejný počet vzorků mužů i žen a přibližně stejný počet normálních a zvýšených hodnot ALP. Všechny vzorky krve byly do 30 minut po dodání na OKB zcentrifugovány. Jedna skupina (105 vzorků) byla zpracována do čtyř hodin po dodání do laboratoře oběma metodami (ALP_Roche, ALP_BLW), druhá skupina (30 vzorků) byla zamrazena a skladována při teplotě -20 ºC po dobu 8 – 34 dnů. Zamrazené vzorky byly poté zpracovány všechny současně: po rozmražení byly zcentrifugovány (skladováním vznikají mikrosraženiny, které by mohly způsobit chybu měření) a do 30 minut v nich byla stanovena katalytická koncentrace ALP oběma metodami. V obou souborech byla posuzována shoda míry úrovně a variability výsledků ALP_Roche a ALP_BLW. Pak byly z celého souboru 135 vzorků vybrány ty, u kterých byly hodnoty ALP, měřené soupravou Roche, v referenčních mezích, a ty byly rozděleny do dvou skupin podle pohlaví. Hodnoty ALP v těchto dvou souborech se blížily normálnímu Gaussovu rozložení (obr. 2 a 3). V obou těchto podskupinách byla posuzována shoda míry úrovně výsledků ALP_Roche a ALP_BLW. Následně bylo vyhodnoceno, kolik % vzorků, které byly v referenčních mezích dle ALP_Roche, překročilo horní referenční meze, hodnoceno dle metody ALP_BLW.

Metody a výpočty

Stanovení ALP_Roche bylo provedeno rutinně prováděnou metodou s 2-amino-2-metyl-1-propanolem (testovací souprava ALP, Roche) na analyzátoru Modular P (Roche). Metoda byla nakalibrována na firemní kalibrátor C.f.a.s., který je navázán na metodu Tietz N. W. [3]. Rozšířená kombinovaná nejistota metody byla 29 % na hladině ALP 3,139 μkat/l a 30,3 % na hladině ALP 8,275 μkat/l. Nejistoty byly stanoveny s využitím materiálu SEKK 3754,3755. Stanovení ALP_BLW bylo provedeno experimentálně prováděnou metodou s 2-amino-2-metyl-1-propanolem (testovací souprava Alkalická fosfatáza (IFCC), BLW) na analyzátoru Cobas c311 (Roche). Metoda byla nakalibrována na firemní kalibrátor DG-CAL CALIBRATOR, který je navázán na metodu IFCC 2011, 37 ºC [4]. Rozšířená kombinovaná nejistota metody byla 4,307 % na hladině ALP 7,93 μkat/l a 4,743 % na hladině ALP 3,016 μkat/l. Nejistoty byly stanoveny s využitím materiálu: vzorek A, vzorek B z cyklu RfB KS6/15. V Tabulce 1 jsou shrnuty hlavní odchylky metody ALP_BLW od standardizovaného postupu, kterým byla stanovena hodnota ALP ve firemním kalibrátoru BLW. Výsledky měření materiálů SEKK/RfB Hanover metodou ALP_BLW jsou uvedeny v Tabulce 2.

Statistické zpracování dat

Pro ověření rozdílů ve variabilitě hodnot ALP_Roche a ALP_BLW byl použit test podílu rozptylů (F-test). Pokud byla p-hodnota tohoto testu menší než α = 0,05 (α - hladina významnosti), variabilita hodnot mezi porovnávanými odhady se od sebe lišila signifikantně. Rozdíl v hodnotách ALP stanovených metodami ALP_Roche a ALP_BLW byl testován pomocí párového t-testu. P-hodnota vypočteného testovacího kritéria byla použita jako míra statistické významnosti. Pokud byla hodnota p menší než α = 0,05, diference průměrů porovnávaných souborů se signifikantně lišila od nuly. Vzhledem k nenormálnímu rozložení dat ve skupinách byl také použit Wilcoxonův test, který je neparametrickým ekvivalentem párového t-testu. Pokud p-hodnota statistického kritéria byla menší než α = 0,05, pak se medián rozdílů porovnávaných dat signifikantně lišil od nuly. Statistické zpracování dat bylo provedeno pomocí programu MedCalc a Excel.

Výsledky

Četnost pacientů v jednotlivých skupinách je uvedena v Tabulce 3.

Grafické znázornění četnosti pacientů podle rozmezí katalytické koncentrace ALP_Roche v celém souboru (skupina I.) a v souborech mužů a žen s hodnotami ALP_ Roche v normálním rozmezí (skupina VI. a VII.) je na obr. 1 – 3. Podle očekávání neměl soubor všech pacientů normální rozložení hodnot katalytické koncentrace ALP_Roche (obr. 1). Ve všech skupinách I. – VII. byla dále provedena korelační analýza. Výsledky ALP_Roche a ALP_BLW významně korelovaly ve všech souborech (R² > 99,6 %, p< 0,0001).

Variabilita hodnot ALP (porovnání mezi ALP_Roche a ALP_BLW) se v hodnocených souborech statisticky významně nelišila. Výjimkou je soubor všech vzorků (skupina I.), v němž byla variabilita hodnot mezi ALP_Roche a ALP_BLW statisticky významně odlišná (p_0,05 = 0,03) – viz. Tabulka 4. V tomto souboru byla směrodatná odchylka hodnot získaných metodou ALP_BLW o 1,06 vyšší než směrodatná odchylka hodnot získaných metodou ALP_Roche. Ve všech souborech (skupina I. – VII.) byly směrodatné odchylky variabilit ALP_BLW vyšší než směrodatné odchylky variabilit ALP_Roche.

Výsledky testování shody mezi výsledky ALP_Roche a ALP_BLW ve skupinách I. – VII. jsou uvedeny v Tabulce 5. Ve všech skupinách jsou rozdíly mezi průměrnými hodnotami ALP_Roche a ALP_BLW statisticky významné na hladině významnosti p = 0,05. Průměrný rozdíl mezi hodnotami ALP_BLW a ALP_Roche ve skupině všech pacientů je 0,58 µkat/l. Na obr. 4 jsou uvedeny rozdíly mezi výsledky ALP_BLW a ALP_Roche v procentech (vztaženo na hodnoty ALP_Roche). Průměrný rozdíl je 18,9 %, ale pohybuje se v intervalu 10 až 36 %. Závislost na hodnotě katalytické koncentrace ALP nebyla prokázána. Ve všech skupinách byl proveden také Wilcoxonův test. P-hodnota testovacího kritéria pro tento test byla ve všech skupinách menší než 0,0001.

Na obr. 5 a 6 je znázorněno graficky překročení horního referenčního intervalu ALP měřeno metodami ALP_Roche a ALP_BLW ve skupinách podle pohlaví (group IV, V.). Ve skupině žen bylo 12 % výsledků v referenčních mezích při stanovení metodou ALP_Roche, ale nad horní hranicí referenčních mezí při stanovení ALP_BLW. Ve skupině mužů bylo 17 % výsledků v referenčních mezích při stanovení metodou ALP_Roche, zatímco při stanovení ALP_BLW byly nad horní hranicí referenčních mezí.

Diskuse

V minulých třech dekádách se v laboratořích klinické biochemie využívala ke stanovení ALP řada metodických postupů. Ty se lišily v používaných substrátech (4-nitrofenylfosfát,1-naftylfosfát), inkubačních a měřících časech, v reakčním pH a zejména v pufrech, které zásadním způsobem ovlivňují výsledky měření ALP. Pufry odvozené od alifatických aminů nejen udržují pH reakce, ale fungují jako akceptory fosfátové skupiny a ovlivňují tak reakční rychlost. Snaha o dosažení srovnatelných výsledků měla za následek mimo jiné i to, že mezi doporučené postupy se nedostala např. často používaná metoda s DEA pufrem a bohužel ani analyticky robustní metoda českých autorů s MEG pufrem [6].

Od roku 2011, kdy byla publikována referenční metoda IFCC pro stanovení katalytické koncentrace ALP, je proces standardizace tohoto vyšetření pomalý. Možnost využít certifikovaný referenční materiál (CRM) pro navázání firemních kalibrátorů je do určité míry omezená jeho dostupností. Mezi požadavky, které musí CRM splňovat, patří mimo jiné i vhodnost jeho použití pro stanovení ALP z hlediska komutability nativních i lyofilizovaných materiálů. CRM také musí mít hodnotu ALP přiřazenou referenčním postupem a musí být testován na stabilitu a homogenitu. Autoři článku publikovaného v roce 2015 [12] zmiňují materiál JC ERM 20327, který však podle dostupných zdrojů má hodnotu ALP stanovenou postupem, který nebyl mezinárodně akceptován [7].

Výrobci diagnostik však volí i jiné postupy. Firma Siemens (metoda ALP AMP, Bayer) dosud využívala ke kalibraci pevnou systémovou hodnotu koeficientu. Ta byla založena na pevně stanoveném molárním extinkčním koeficientu p-nitrofenolu při vlnové délce 410 nm, který byl upraven. Jednalo se o modifikovanou IFCC metodu. Další možností je vytvoření atestu v komutabilním firemním kalibrátoru referenčním postupem. Tuto cestu zvolila firma BLW [8]. V Tabulce 2 jsou uvedeny výsledky měření certifikovaných referenčních materiálů metodou ALP_BLW. Dosažený bias je srovnatelný s výsledky získanými testovací soupravou ALP Bayer [13]. Firma Siemens však v současnosti metodu ALP AMP nahrazuje novou metodou (ALP_2c, Bayer), která již má svůj vlastní firemní standard, u něhož výrobce deklaruje návaznost na IFCC metodu [9]. Úspěšná snaha výrobců o přípravu sekundárních referenčních materiálů pro své potřeby je podmíněna skutečností, že výrobce má k dispozici testovací soupravu, jejíž složení se neliší od referenčního postupu (složení reakční směsi, čistota reagencií). O reprodukci referenční metody se pokusili i čínští autoři a porovnávali v rozsáhlém experimentu rutinně používané metody pro stanovení ALP s referenčním postupem. V rámci své studie použili mimo jiné uzavřený systém firmy Roche pro stanovení ALP, jeho kalibrátor však validovali referenčním měřicím postupem [10].

Firma Roche dosud ke standardizaci stanovení ALP nepřistoupila, ale dle interních firemních informací by k ní mohla přistoupit ve druhé polovině roku 2016. Při porovnání výsledků stanovení ALP metodami ALP_BLW a ALP_Roche jsme v souboru 135 vzorků zjistili průměrný bias 18,9 %. V článku čínských autorů [10] byl rozdíl mezi výsledky ALP stanovenými referenčním postupem a výsledky ALP stanovenými na uzavřeném systému Roche v rozmezí 12 – 16 %. V našem souboru pacientů se však hodnoty bias nacházely v intervalu 10 % – 36 %. Příčina relativně velkého rozptylu bias, zejména v oblasti nižších katalytických koncentrací, není zcela zřejmá. Částečně může být způsobena nižší robustností rutinní metody ALP_Roche (stabilita reagencie na palubě přístroje, mezilehlá preciznost na hladině 1,51 μkat/l byla 5,2 %), zpracovány byly jak vzorky nativní, tak i vzorky skladované v zamrazeném stavu.

Z vyhodnocení našich výsledků ALP podle pohlaví je zřejmé, že při případném přechodu z ALP_Roche na standardizovanou IFCC metodu stanovení ALP by část výsledků byla nově hodnocena jako zvýšené hodnoty ALP. Současně by ale nebylo možné u jednotlivých pacientů deklarovat, jakou měrou by se na případné změně katalytické koncentrace ALP podílel přechod na novou metodu.

Otázkou tedy je, jaké použít referenční intervaly po zavedení metody ALP IFCC 2011 do rutinního provozu. Referenční interval pro metodu ALP IFCC 2011 není dosud uspokojivě vyřešen. Dosud existující referenční intervaly jsou buď předběžné [4], nebo získané jen na lokální bázi. Čínští autoři v rozsáhlém experimentu stanovili referenční interval sérové katalytické koncentrace ALP na skupině dobrovolníků z místní provincie [11]. Použili uzavřený systém Roche a hodnotu ALP ve firemním kalibrátoru C.f.a.s. stanovili referenční metodou v referenční laboratoři. Jejich výsledky se však zcela neshodují s výsledky publikovanými v doporučení IFCC [4]. Tento rozdíl přičítají etnickým rozdílům v testovaných souborech a různým kritériím, podle kterých byly pro studie vzorky vybírány. Podílet se na tom ale může i skutečnost, že současná metoda stanovení ALP firmy Roche není zcela v souladu s doporučeným postupem IFCC (mimo jiné vlnová délka, složení reakční směsi). Firma Siemens u nyní na trh uváděné testovací soupravy ALP_2c (Bayer) uvádí jednotný referenční rozsah (0,766 – 1,933 μkat/l) s odkazem na interní zdroje a s doporučením, aby si každá laboratoř vytvořila svoje vlastní meze. Existující předběžný referenční interval pro metodu ALP IFCC 2011 byl stanoven s využitím interního kalibračního materiálu, ve kterém byla hodnota ALP stanovena referenčním postupem [4]. Jedním z důvodů, proč dosud není otázka referenčního intervalu vyřešena, může být neexistence referenčního materiálu pro metodu ALP IFCC 2011. Pokud se však výrobci podaří uvést na trh standardizovanou metodu stanovení ALP s ověřenou návazností na referenční IFCC 2011, bylo by možné použít již publikované referenční meze 0,72 – 1,92 μkat/l pro muže a 0,55 až 1,64 μkat/l pro ženy [4].

Závěr

Výsledky stanovení ALP metodami ALP_Roche a ALP_BLW byly statisticky významně odlišné. 12 % výsledků u žen a 17 % výsledků u mužů, které byly v referenčních mezích dle ALP_Roche, bylo nad horním limitem referenčního intervalu dle ALP_BLW.

Použité zkratky

AMP 2-amino-2-metyl-1-propanol

C.f.a.s. Calibrator for automated systems

DEA dietanolamin

MEG N-metyl-D-glukamin

IFCC Mezinárodní federace klinické chemie a laboratorní medicíny

SEKK systém externí kontroly kvality

RfB Refernzinstitut für Bioanalytik

CRV certifikovaná referenční hodnota

CRM certifikovaný referenční materiál

CI 95% interval spolehlivosti

Do redakce došlo 13. 4. 2016

Adresa pro korespondenci

RNDr. Hana Dobrovolná

OKB, FN u sv. Anny v Brně

Pekařská 53

656 91 Brno

e-mail: hana.dobrovolna@fnusa.cz