Stanovení methylovaných derivátů glycinu u pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem

Súhrn

Cíl studie: Cílem studie bylo zavedení metody stanovení betainu a dimethylglycinu metodou HPLC s UV detekcí ve vzorcích lidské plazmy. Dále stanovení těchto analytů u pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem a zhodnocení naměřených výsledků vzhledem ke kontrolní skupině.

Typ studie: retrospektivní.

Název a sídlo pracoviště: Ústav klinické biochemie a hematologie Lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice, Alej Svobody 80, 304 60 Plzeň.

Materiál a metody: Metoda HPLC s UV detekcí byla zavedena na kapalinovém chromatografu Thermo Separation Products Spectra SYSTEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Podmínky separace: složení mobilní fáze 90 % acetonitrilu, 10 % redestilované vody a 22 mmol/L cholinu (isokratická eluce); průtok mobilní fáze 1,5 ml/min; teplota analýzy 33 °C; UV detekce při 254 nm; kolona SUPELCOSIL^TM LC-SCX o velikosti částic 5 μm. Pro optimalizaci metody stanovení byly využity vzorky plazmy od 30 dárců z transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Plzni. Soubor obsahoval 15 mužů a žen ve věkovém rozmezí od 39 do 61 let. Soubor pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem obsahoval 12 mužů 
a 8 žen ve věkovém rozmezí od 36 do 67 let.

Výsledky: Hodnoty preciznosti v sérii vyjádřené variačním koeficientem byly 10,6 % a 11,8 % pro betain a dimethylglycin, v případě mezilehlé preciznosti 7,1 % a 12,3 %. Výtěžnost metody byla 97,8 % pro betain a 97,7 % pro dimethylglycin. Plazmatické koncentrace betainu a dimethylglycinu u kontrolní skupiny byly 135,8 ± 47,4 µmol/L a 4,7 ± 1,3 µmol/L. U pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem byly plazmatické koncentrace 100,9 ± 40,9 µmol/L (statisticky významně nižší než u kontrol, p < 0,005) a 10,3 ± 6,2 µmol/L (statisticky významně vyšší než u kontrol, p < 0,01). Plazmatická koncentrace homocysteinu byla u pacientů s metabolickým syndromem 14,4 ± 5,0 µmol/L (p < 0,001), u kontrolní skupiny 10,0 ± 3,5 µmol/L.

Závěr: U pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem jsme zaznamenali ve shodě s jinými autory ve srovnání s kontrolní skupinou dárců krve nižší plazmatickou hladinu betainu a vyšší hladinu dimethylglycinu a homocysteinu. Tyto změny by mohly mít vztah k rozvoji nealkoholické steatózy jater i ke zvýšenému kardiovaskulárnímu riziku u osob s metabolickým syndromem.

Klíčová slova:

betain – dimethylglycin – metabolický syndrom – HPLC.

Úvod

V poslední době vzrůstá počet studií, které se zabývají stanovením methylovaných derivátů glycinu, konkrétně betainu a dimethylglycinu, u různých patologických stavů. Obě tyto látky jsou součástí metabolismu jednouhlíkatých zbytků, které se podílejí na remethylaci homocysteinu na aminokyselinu methionin a zároveň na dostupnosti S-adenosylmethioninu (SAM) nezbytného pro vznik mnoha důležitých látek našeho organismu (např. adrenalinu nebo fosfatidylcholinu). Otázkou těchto studií je, zdali může být koncentrace betainu a dimethylglycinu v plazmě markerem počínajících či probíhajících patologických stavů [1].

Remethylace homocysteinu je možná prostřednictvím dvou donorů methylových skupin, a to betainu a N⁵-methyltetrahydrofolátu (N⁵-MTHF). V našem případě se věnujeme betainu, z něhož se po odštěpení methylové skupiny prostřednictvím enzymu betainhomocysteinmethyltransferázy (BHMT) stává dimethylglycin. Vzhledem k různému příjmu betainu v potravě má jeho stanovení pouze informativní charakter, zatímco dimethylglycin odráží skutečnou míru remethylace touto cestou [2].

V případě narušení chodu metabolismu jednouhlíkatých zbytků dochází k nedostatečnému vzniku SAM a tím k hypomethylaci napříč celým organismem. Možnosti narušení jsou různé. Může jít např. o sníženou aktivitu enzymu methylentetryhydrofolátreduktázy (MTHFR) vlivem mutace v jeho genu, nedostatkem vitaminů skupiny B (B₆, B₁₂, kyselina listová) nebo stimulací aktivity BHMT se současnou inhibicí aktivity methioninsyntázy (MS) působením ethanolu [2, 3]. Nedostatečná remethylace homocysteinu se projeví jednak sníženým množstvím SAM a methylovaných produktů v organismu, ale také vznikem hyperhomocysteinémie [1].

Dříve byla nejpoužívanější metodou stanovení betai-nu a dimethylglycinu vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) s UV detekcí, kterou jsme v našem případě využili [4]. V dnešní době je však čím dál častěji využíváno hmotnostní detekce, která disponuje větší citlivostí a snazší přípravou vzorku k analýze bez nutnosti derivatizace [5, 6].

Materiál a metody

Pro stanovení betainu a dimethylglycinu v plazmě byla využita mírně upravená metoda dle Laryea [4]. Metoda stanovení betainu a dimethylglycinu byla zavedena za těchto podmínek:

• složení mobilní fáze: 90 % acetonitril, 10 % voda, 22 mmol/L cholin (isokratická eluce)
• průtok mobilní fáze 1,5 ml/min
• teplota analýzy 33 °C
• UV detekce při 254 nm
• doba analýzy 15 minut
• kolona SUPELCOSILTM LC-SCX HPLC Column, 5 µm, 4,6 mm x 25 cm (Supelco Inc., Sigma-Aldrich, Německo)
• kapalinový chromatograf Thermo Separation Products Spectra SYSTEM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)
• derivatizační činidlo: 2,4-dibromacetofenon, 18-crown-6 (Sigma-Aldrich, Německo)

Mezi upravené parametry patří změna teploty analýzy z původní pokojové teploty a také změna objemu nástřiku vzorku z původních 15 µl na 10 µl, díky čemuž jsme získali píky s lepší charakteristikou, a to bez ztráty účinnosti. Další změna se týkala derivatizace, kde jsme přidali mimo samotného KH₂PO₄ pufr KH₂PO₄/NaOH (pH = 6). Tímto zásahem se nám podařilo dosáhnout lepší preciznosti.

Pro zavedení metody stanovení betainu a dimethyl-glycinu byly využity vzorky plazmy od 30 dárců z transfuzního oddělení Fakultní nemocnice v Plzni. Soubor obsahoval 15 mužů a žen ve věkovém rozmezí od 39 do 61 let. Soubor pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem obsahoval 12 mužů a 8 žen ve věkovém rozmezí od 36 do 67 let. Všichni pacienti měli porušenou glukózovou toleranci, tedy glykémii v rozmezí ≥ 7,8 a ≤ 11,0 mmol/L dvě hodiny po vypití roztoku se 75 g glukózy. Dále museli být nositeli alespoň dvou nebo více z následujících kritérií metabolického syndromu:

• obvod pasu ≥ 102 cm u mužů a ≥ 88 cm u žen
• krevní tlak ≥130/≥80 mmHg nebo antihypertenzní léčba
• plazmatické triacylglyceridy nalačno ≥ 1,7 mmol/L nebo lipidy modifikující léčba
• HDL-cholesterol ≤ 1,0 mmol/L u mužů a ≤ 1,3 mmol/L u žen nebo lipidy modifikující léčba

U pacientů se společně navíc k porušené glukózové toleranci nejvíce vyskytovaly další tři rizikové faktory (45 %), následně dva rizikové faktory (35 %) a nejméně čtyři rizikové faktory, které se objevily v 30 % případů. Většina pacientů byla na terapii antihypertenzivy (80 %), zatímco lipidy modifikující léčba byla zastoupena v 55 %. Pouze 15 % pacientů nebylo léčeno ani jednou z uvedených terapií. Další charakteristiky pacientů jsou uvedeny v Tabulce 1.

U všech jedinců byla také stanovena plazmatická koncentrace homocysteinu (souprava HCYS:ACN 8778, Roche). Statistické zpracování dat bylo prováděno v programu R version 3.5.1 (R Core Team 2018). K porovnání koncentrací mezi dvěma skupinami jsme použili Wilcoxonův nepárový test, vztahy mezi dvěma veličinami jsme charakterizovali pomocí korelační analýzy (Spearmanův korelační koeficient). U kontrolního souboru jsme pro určení předpokládaného rozložení analytů použili neparametrickou metodu. Výsledky na hladině významnosti p = 0,05 jsme považovali za statisticky významné.

Výsledky a diskuse

Linearita metody byla ověřena pro celý koncentrační rozsah použitý v původní práci, tedy od 8 do 256 µmol/L pro betain a od 2 do 64 µmol/L pro dimethylglycin a její parametry jsou uvedeny v Tabulce 2. Jako limity kvantifikace byly využity nejnižší body kalibrační křivky, jejichž preciznost byla určena analýzou pěti nezávislých měření provedených v rámci jednoho dne. Hodnoty variačních koeficientů (CV) byly 11,80 % pro betain a 12,33 % pro dimethylglycin. Žádný z biologických vzorků neměl nižší plazmatické koncentrace, než nejnižší kalibrační standardy, a proto nebyl ověřen limit detekce. Jako pracovní rozsah byl zvolen interval mezi nejnižším a nejvyšším bodem jednotlivých kalibračních křivek. Hodnoty preciznosti v sérii byly zjištěny analýzou 10 nezávislých vzorků směsné plazmy, která byla provedena během jednoho dne. Mezilehlá preciznost byla zjištěna analýzou 10 nezávislých vzorků směsné plazmy po dobu 10 dní. Hodnoty preciznosti vyjádřené variačním koeficientem na příslušných koncentračních hladinách jsou uvedeny v Tabulkách 3 a 4. Uvedené hodnoty jsou oproti původní metodě vyšší. Vysvětlujeme si je zejména nižším počtem měření, kdy v původní metodě byla preciznost v sérii získána měřením 20 směsných plazem namísto 10; v případě dimethylglycinu zvolenou nízkou koncentrační hladinou. Průměrná výtěžnost metody stanovení získaná analýzou standardního přídavku byla 97,8 % pro betain a 97,7 % pro dimethylglycin.

Průměrné plazmatické koncentrace (průměr ± SD) betainu, dimethylglycinu a homocysteinu u kontrolní skupiny a u pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem jsou uvedeny v Tabulce 5. Grafické znázornění výsledků je na obr. 1, 2 a 3.

V případě kontrolní skupiny byly u mužů naměřeny nevýznamně nižší plazmatické koncentrace betainu 
(p = 0,8702) současně i s nižším rozptylem oproti ženám, což neodpovídá výsledkům jiných studií [7]. To si lze ale vysvětlit vysokou interindividuální variabilitou tohoto analytu, možným vlivem životosprávy (diety) a malou velikostí kontrolního souboru. Naopak je tomu u plazmatických koncentrací dimethylglycinu, kde nacházíme nevýznamně vyšší hodnoty u mužů než u žen (p = 0,2671), včetně rozptylu hodnot, což odpovídá odborným publikacím [8]. V případě plazmatické koncentrace homocysteinu nebyly u mužů a žen žádné významné změny (p = 0,1353).

Z naměřených výsledků jsme určili předpokládané rozložení obou analytů (2,5. až 97,5. percentil), a to od 42,9 do 228,6 µmol/L pro betain a od 2,0 do 7,3 µmol/L 
pro dimethylglycin. Dosáhli jsme tedy podobných hodnot jako v původní metodě, pouze v případě betainu jsme naměřili hodnoty vyšší. Vysvětlením může být menší velikost a rozdílné věkové rozmezí testovaného souboru (n = 12, od 30 do 50 let). Nelze také opomíjet možnost odlišného dietního příjmu.

Při použití jiných derivatizačních činidel (např. 2-naftacyl triflát) jsou, podobně jako s využitím hmotnostní detekce, naměřené plazmatické koncentrace nižší. Pohybují se přibližně od 20 do 70 µmol/L pro betain a od 1 do 5 µmol/L pro dimethylglycin [5, 6, 9, 10, 11]. Nižší naměřené hodnoty analytů metodou HPLC s UV detekcí a odlišným derivatizačním činidlem si vysvětlujeme právě rozdílnou derivatizací. V našem případě jsme naměřili podobné hodnoty jako autoři publikace, podle níž byla naše metoda zaváděna. V případě HPLC ve spojení s hmotnostní spektrometrií naopak absencí derivatizace a také větší citlivostí metody.

Ačkoliv je soubor jedinců s metabolickým syndromem a prediabetem poměrně malý, podařilo se nám naměřit výsledky srovnatelné s literaturou [11, 12]. Konkrétně jde o hyperhomocysteinémii doprovázenou zvýšenou hladinou dimethylglycinu a naopak sníženou hladinou betainu. Plazmatické koncentrace betainu jsou významně nižší než u kontrolní skupiny (p < 0,005, medián rozdílu 34,72, 95% konfidenční interval: 13,64 až 58,44 µmol/L) a jsou způsobeny jeho abnormálním vylučováním nebo nedostatečným příjmem beta-inu včetně cholinu. Vlivem nedostatečného množství betainu v organismu může docházet ke snížení tvorby methylovaných produktů jako např. fosfatidylcholinu (lecithinu). Ten vzniká z cholinu (prekurzoru betainu) trojitou methylací za přítomnosti enzymu fosfatidylethanolaminmethyltransferázy (PEMT) a je důležitou složkou lipoproteinových částic typu VLDL a v případě jeho snížené tvorby dochází k akumulaci lipidů v játrech. Posléze ke vzniku nealkoholické steatózy jater (NAFLD, non alcoholic fatty liver disease) a k rozvoji plazmatické dyslipidémie. Výsledkem je, že lipidové markery (plazmatická koncentrace triacylglycerolů a non-HDL cholesterolu včetně homocysteinu) negativně korelují s hladinou betainu [9,13]. Dá se tedy usuzovat, že snížená plazmatická koncentrace betainu může přispět k rozvoji NAFLD u této skupiny pacientů.

Naopak je tomu u plazmatických koncentrací dimethylglycinu, které jsou významně vyšší než u kontrolní skupiny, a to včetně rozptylu hodnot (p < 0,01, medián rozdílu 6,19, 95% konfidenční interval: 1,35 až 9,67 µmol/L). To si lze vysvětlit tím, že skrze betain určitá remethylace homocysteinu probíhá, a tím vzniká určité množství dimethylglycinu. Ten však ke své degradaci potřebuje N⁵-MTHF a při nedostatku betainu převládá remethylace právě touto cestou. Množství N⁵-MTHF potřebného pro degradaci dimethylglycinu ubývá a není dostatečné. Kumulace dimethylglycinu je také podpořena tím, že v koncentraci > 3 µmol/L inhibuje enzym BHMT, což množství N⁵-MTHF ještě snižuje [11].

Plazmatické koncentrace homocysteinu jsou u pa-cientů s metabolickým syndromem významně vyšší než u kontrolní skupiny (p < 0,001, medián rozdílu 3,31, 95% konfidenční interval: 1,56 až 5,66 µmol/L). V případě korelační analýzy byla zjištěna kladná korelace (R = 0,34, p < 0,001) mezi plazmatickou koncentrací dimethylglycinu a homocysteinu, která nás přesvědčuje o určitém vztahu těchto dvou analytů. Korelační analýza nepotvrdila žádné další významnější korelace mezi jednotlivými analyty.

Závěr

U pacientů s metabolickým syndromem a prediabetem jsme zaznamenali ve shodě s jinými autory ve srovnání s kontrolní skupinou dárců krve nižší plazmatickou hladinu betainu a vyšší hladinu dimethylglycinu a homocysteinu. Tyto změny by mohly mít vztah k rozvoji nealkoholové steatózy jater i ke zvýšenému kardiovaskulárnímu riziku u osob s metabolickým syndromem.

V budoucnu počítáme se stanovením betainu a dimethylglycinu metodou HPLC s hmotnostní spektrometrií. Oproti námi zavedené metodě disponuje větší citlivostí a snazší přípravou vzorku k analýze bez nutnosti derivatizace.

Podpořeno Programem rozvoje vědních oborů Univerzity Karlovy (Progres Q39).

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Do redakce došlo 17. 1. 2019

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Vendula Sudová

Lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Plzni

Biomedicínské centrum

Alej Svobody 1655/76

323 00 Plzeň

e-mail: vendula.sudova@lfp.cuni.cz