Biochemické analyty séra, COVID-19 a harmonizace

Súhrn

Řada analytů krevního séra vykazuje v průběhu COVID-19 změny, dovolující predikci průběhu a závažnosti choroby Jde zejména o ALT, LD, kreatinin a eGFR, prokalcitonin, albumin, kardiální markery a lipidy. Nový přístup k harmonizaci laboratorních výsledků je transformován do podoby nové Směrnice pro in vitro diagnostika IVDR 746. Teoretickými podklady jsou normy ISO 17511:2020 a ISO 21151:2020. Cílem sdělení je zhodnotit stav harmonizace u biochemických analytů, schopných monitorovat průběh a závažnost průběhu COVID-19. Je konfrontovaný reálný stav harmonizace se stavem ideálním, který má být v duchu IVDR 746 v krátké době dosažen. Problémy nedostatku úrovně harmonizace jsou nalézány v různé míře prakticky u všech jmenovaných analytů.

Klíčová slova:

harmonizace – standardizace – COVID-19 – IVDR 746 – analyty krevního séra

Změny rutinních sérových analytů u COVID-19 a jejich důsledky

Doporučené spektrum sledování změn sérových analytů bylo ustanoveno formou směrnice IFCC poměrně brzy a zůstává v podstatě v nezměněné podobě kritérií [1]. Je součástí Informační příručky IFCC o COVID-19, umístěné na webu České společnosti klinické biochemie https://www.cskb.cz. Informační příručka ČSKB je zkrácenou verzí často a pravidelně aktualizované informační směrnice IFCC o COVID-19 (Information Guide of IFCC) umístěné na často aktualizovaných stránkách https://www.ifcc.org. V těchto příručkách jsou uvedeny informace o rutinních analytech klinické biochemie a hematologie vedle informací o detekci SARS-CoV-2 RNA, o metodách hodnocení epidemiologické situace protilátkami anti-SARS-CoV-2 a řada dalších údajů o datech, statistikách, diagnostice.

Existuje již řada meta-analytických studií, shrnujících a kvantifikujících změny rutinních analytů v průběhu choroby COVID-19 a o jejich případných dlouhodobých následcích. Řada takových studií se zřejmě bude neustále rozšiřovat, jejich závěry prohlubovat a zpřesňovat. Zatím zde uvádíme jako příklad meta-analytickou studii, hodnotící výsledky 35 laboratoří z hlediska kritérií medicíny, založené na důkazech-EBM [2].

Meta-analytickou studií, hodnotící vliv závažnosti choroby a komorbidit pacientů po proběhlé chorobě ve Francii (24 zdravotnických center) je demonstrován a shledán závažným [3].

Vlastním předmětem našeho sdělení je stav harmonizace výsledků těchto stanovení. A to v kontextu celkového průběhu procesu harmonizace, daného inovací mezinárodních norem kvality ISO 17511:2020 a ISO 21151:2020 [3,4] a na jejich bázích vytvořenou Směrnicí regulace in vitro diagnostik-IVDR 746 [5, 6].

Stav harmonizace biochemických markerů, ovlivněných během COVID-19

ALT, AST

Problémem zůstává použití nebo nepoužití aktivace reakce pyridoxal-5-fosfátem (P-5-P). Ze tří zásadních programů EHK posledních let, založených na použití kontrolních materiálů s verifikovanou komutabilitou, vyplývá, že víc než polovina laboratoří používá verze bez P-5-P a že někteří výrobci stále uvádějí na trh obě verze (bez aktivace P—P i s aktivací). Například i dva producenti z největších; Roche a Abbott. Nicméně referenční měřící postup IFCC použití vP-5-P vyžaduje a diference mezi oběma metodami se přitom pohybují v intervalu cca 10 – 40 % [7-9].

Proto nejsou jasné ani hodnoty referenčních intervalů nebo hodnot rozhodovacích limitů, použitých v různých studiích. Tak například velmi zajímavé doporučení o dyslipidémii u COVID-19, vypracované ve Velké Británii, doporučuje zastavit medikaci statiny v případě doby hrozby jaterního poškození [10]. Ta je definována jako trojnásobné zvýšení horní hranice referenčních intervalů ALT (AST), tedy v kontextu s reálnou situací velmi nejasně.

Laktát dehydrogenáza-LD

Katalytická koncentrace LD v séru patří od počátku k biochemickým markerům, doporučovaným k sledování stavu pacientů s COVID-19 [1]. Silně zvýšené hodnoty LD v séru jsou pozorovány zejména při těžkém průběhu COVID-19, jmenovitě u pacientů na jednotkách intenzivní péče [2,11]. Rozdílné výsledky klinických studií, pocházející od různých autorů z různých zemí vysvětlují italští autoři nedůsledným používáním referenční metody IFCC [12]. Nahlédnutím do hodnocení některých programů EHK můžeme konstatovat, že se metody IFCC používá minimálně ve třech čtvrtinách evropských laboratoří a že v řadě programů používají účastníci metodu IFCC se 100% četností.

Údaje v Tabulce 1 pocházejí z dat účastníků šesti programů EHK (7 skupin). Svědčí o významném problému standardizace ALT (i AST), který není ani výrobci důsledně vyřešený (nabídka dvou variant metod ALT). Navíc, hodnoty v programech SEKK a RfB jsou patrně získávané z kontrolních materiálů s přídavkem P-5-P, takže mají velmi omezenou výpovědní hodnotu o jeho vlivu na výsledky. Standardizace LD vykazuje problémy výrazně nižší. Hodnoty, získané v programu RIQAS svědčí pro existenci některých i velmi obsoletních metod.

Albumin

Snížené koncentrace v séru jsou u pacientů vysoce frekventované. Podle údajů italských autorů [13] je koncentrace u 89 % pacientů nižší než 35 g/L, u 62 % dokonce pod 29 g/L. Albumin v séru byl dobrým prediktorem nutnosti hospitalizace na jednotkách intenzivní péče (s hodnotou cut-off 29 g/L a hodnotou AUC = 0,89) a rovněž prediktorem úmrtí u těžkých průběhů (s cut-off 18 g/L a hodnotou AUC=0,87) [14]. Potřeba harmonizace, plynoucí ze závislosti výsledků na třech různých používaných metodologiích (BCP, BCG, imunoanalýza) byla velmi naléhavě doložena již v práci [15], která na velkém počtu použitých metod a kitů [24] dokládá, že metoda BCG vykazuje signifikantně vyšší hodnoty bias, než dvě další. Ke stejnému závěru došla již práce Koerbina a spol. [8] s použitím kontrolních materiálů s verifikovanou komutabilitou. To se samozřejmě projeví v rozdílných počtech výsledků albuminu, ovlivněných chorobou COVID-19. Dominantní výrobci mají na trhu často obě fotometrické metody BCP i BCG, mezi jejichž výsledky bývají až 5% diference. V programu SEKK navzdory možnosti prosté aplikace jiného kitu stejného výrobce, zůstává tradičně 93% incidence (rok 2021) použití metody BCG. Stejně je tomu v mezinárodním programu RIQAS (81% BCG). Analyticky nejselektivnější imunochemické metody zůstávají používány jen velmi omezeně (3% v programu RIQAS). V programu RfB (Německo) jsou výsledky, navzdory opakovaně zdůrazňované potřebě harmonizace [8, 13, 15] hodnoceny bez ohledu na metodu v jediné skupině.

Prokalcitonin

Je nezbytný pro detekci možných sekundárních bakteriálních infekcí. Harmonizace stanovení vykazuje významné problémy: 10 systémů kitů a platforem bylo ve dvou laboratorních centrech srovnáno u velkého souboru pacientů v širokém koncentračním rozsahu. Bylo použito především metody BRAHMS v sedmi variantách pro různé výrobce a jejich různé platformy (Kryptor, Roche, DiaSorin, Abbott, Beckman), kitů Diasorin (Roche) a SNIBE (Maglumi). Korelace mezi výsledky byla dobrá, nicméně hodnoty diferencí mezi hodnotami jednotlivých systémů se pohybovaly v širokém intervalu 0 – 39 %. To samozřejmě významně ovlivňuje faktické hodnoty rozhodovacích limitů a následně charakter klinických hodnocení výsledků. Diference byly hodnoceny pro široký interval koncentrací 0,1 - 10 μg/L a závislost na nich nebyla významná [16].

Recentně následovala velká souhrnná studie pracovní skupiny IFCC WG-PCT. Předmětem vyhodnocení byly kity BRAHMS, adoptované na řadu platforem různých výrobců (Lumimpuls, Kryptor, Elecsys, Architect, Liaison, Vidas) a kity Diazyme Roche, Beckman Access a Dx, SNIBE Maglumi [17]. Interval diferencí mezi jejich středními hodnotami se pohyboval v intervalu 0-25 % při použití komutabilních testovacích materiálů, podobně jako v práci Lippiho a spol. [13]. Tyto diference mají zásadní vliv na hodnoty diagnostických rozhodovacích limitů. V práci byly retrospektivně vyhodnoceny výsledky 10 programů EHK, přičemž medián reprodukovatelnosti byl CV%=16.Testování ukázalo rovněž významné diference kontrolních materiálů v závislosti na typu jejich matricí. Příznivějších výsledků (s hodnotami preciznosti cca 5 %) bylo dosaženo u vzorků bez spikování (bez rozdílů mezi lyofilizovanými a nativními vzorky). Spikování kontrolních materiálů vedlo vždy k významnému poklesu preciznosti měření CV% na cca CV% = 25. Zásadní krok k řešení problému standardizace PCT spatřuje IFCC WG-PCT ve vytvoření a validaci referenční metody na bázi ID-LC-MS.

Kardiální markery

Zvýšené hodnoty kardiálních markerů jsou u pacientů s COVID-19 časté a mají silné predikční efekty pro posouzení závažnosti choroby, včetně přežití pacientů a souvislostí s postcovidovými stavy pacientů.

Základní edukační informace o zohlednění vlivu metody a jejího typu, o volbě cut-off, vlivu metody a pohlaví, jednotkách měření, shrnuje práce Kavsaka a spol. [18]. Vyčíslení vyhodnocení rizika těžkého průběhu hodnotami odds ratio-OR, provedené v další metaanalytické studii [19], ukazují vysoké riziko pro tři kardiální markery: cTnT (11,8), NT pro BNP (7,6) a cTnI (6,3). Pro srovnání lze uvést i hodnoty LD (4,8), D-dimer (4,1) z téže studie.

Rozsáhlá metaanalytická studie výsledků 24 laboratorních středisek ve Francii s téměř 3000 vyšetřených pacientů identifikovala hodnoty nad cut-off (podle univerzální definice srdečního infarktu jde o poškození myokardu - myocardial injury) u 32 % pacientů s těžkým průběhem COVID-19 a dokonce u 59 % nepřeživších osob. Výsledky u NT pro BNP (při použití cut-off 300 ng/L) vykázaly ještě vyšší frekvenci poškození myokardu; 53 % u přeživších a 84 % u zemřelých [3].

Ve španělské studii byly pečlivěji definovány metody měření a jejich interpretace. Pro hodnocení kardiálních troponinů byla použita metoda hs cTnT Roche a k interpretaci hodnota cut-off 14 ng/L, pro NT proBNP rovněž metoda Roche a cut-off 300 ng/L [20]. Hodnoty Kaplanových-Mayerových křivek přežití měly pro pacienty s výsledky pod cut-off 14 a 300 ng/L index cca 1,0 (tedy bez ovlivnění smrtnosti), zatímco u pacientů s kombinací obou markerů nad cut-off tento index dramaticky poklesl na cca 0,4, což znamená 2,5krát nižší pravděpodobnost přežití.

Následující studie hodnotila u souboru pacientů s diagnostikovaným COVID-19 hs cTnT již hodně sofistikovaně, tedy s použitím jedné metody (opět hs cTnT Roche) s respektováním různosti hodnot cut-off pro ženy (10 ng/L) a muže (15 ng/L) zvlášť [21]. Zde indexy Kaplanových-Mayerových křivek přežití (pro 1 měsíc) dosahovaly 95-100 % pro cTnT pod cut-off (pacienti bez „myocardial injury“), pokud však byly hodnoty cTnT nad cut-off, klesla doba předpokládaného přežití na 80 %. Autoři vyslovili na závěr predikci, že pacienty s COVID- 19 lze považovat za nerizikové až při hodnotách cTnT maximálně 6 ng/L.

Postup laboratoře k použití kardiálního troponinu u pacientů s COVID-19 lze shrnout několika jednoduchými body:

• Výsledky měření a hodnoty cut-off (99 percentilů) jsou zcela závislé na metodě a instrumentaci

• Je vhodné preferovat metody hs cTnT/I (což se v praxi českých laboratoří děje)

• Kontrolu kvality měření je třeba zaměřit v maximální možné míře na koncentrace co nejbližší hodnotám cut-off

• Vědomí o závislosti hodnot cut-off na pohlaví pacienta je nezbytné respektovat v praxi. COVID-19 k tomu dává dobrou příležitost k realizaci v praxi.

Kreatinin, eGFR

Nárůst koncentrace kreatininu a odpovídající pokles hodnot eGFR je u pacientů s těžkým průběhem COVID-19 signifikantní. Příklady můžeme nalézt v již uvedených písemných zdrojích [2, 3, 11]. Nárůst kreatininu a pokles eGFR je vyšší u závažnějších průběhů a u pacientů na jednotkách intenzivní péče. Standardizace stanovení kreatininu s metrologicky návaznou kalibrací na metodu LC-MS bylo dosaženo kolem roku 2005. Tehdy byla také doporučena i pro rutinní laboratoře enzymová fotometrická metoda k podstatně lepšímu zabezpečení této návaznosti. Jaffého metoda byla nadále zamýšlena jen jako přechodné řešení, podmíněné aplikací matematické korekce odečtem pseudokreatininu. Přesto podle dostupných dat enzymové metodě doposud konkuruje. Například v programu EHK RfB Bonn je jen 20 % účastníků používajících enzymových metod, zatímco v programu SEKK je jich (říjen 2021) 53 %. Při prohlížení výsledků komerční „EQA“ RIQAS jsme odhadli cca 30 % laboratoří s enzymovou metodou. Jde tedy vývoj k rigidnější metrologické návaznosti mnohem rychleji v pracích expertů přes standardizaci než v rutinní praxi. K informaci o skutečné recentní úrovni standardizace a metrologické návaznosti dobře informuje práce, ukazující stav měření koncentrací kreatininu enzymatickými metodami klíčových producentů s hodnotami uvnitř referenčních intervalů (cca 60- 90 μmol/L) za použití komutabilních kontrolních materiálů ve čtyřech velkých programech EHK [22]. Hodnoty bias se tam pohybují ve velké většině případů pod 5 %.

Dobrá úroveň harmonizace podmiňuje dobrou kvalitu kalkulace eGFR. Harmonizace eGFR je zase podmíněna použitím rovnocenných výpočetních postupů, což nemusí být v praxi zaručeno, protože postupů výpočtu bylo v průběhu času navrženo víc. Například starší, dříve publikovanou rovnici MDRD používalo dosud v roce 2021 ještě 44 % účastníků kontrolního programu CAP-US, přestože se již řadu let doporučuje k výpočtu rovnice CKD-EPI 2009 pro kreatinin a varianta pro kombinaci kreatinin + cystatin C. Na jejím základě byla dokonce založena diagnostická klasifikace chronické ledvinové choroby (CKD) v mezinárodním doporučení KDIGO 2012 CKD. Zcela nově se objevuje prostřednictvím AACC snaha o větší stupeň harmonizace výpočtů eGFR [23]. Nyní navrhuje AACC změněné rovnice CKD EPI Kreatinin 2021 a CKD EPI Kreatinin + cystatin C 2021. Důvodem je redukce dvou hodnot pro bílé a černé osoby na jedinou, společnou. Bias obou výpočtů vůči hodnotě změřené mGFR (například clearance inulinu) je v podstatě stejný (cca 0,07 mL/s.1,73m2). Hodnota P 30 (procento výsledků s diferencí od měřené hodnoty mGRR do 30 %) je 80-90 eGFR kreatininu a 91 pro eGFR kreatininu + cystatinu C.

Lipidy

K nalezení je poměrně málo publikovaných dat obecnějšího charakteru. K již zmíněnému doporučení expertů HEART UK, v němž je zajímavé doporučení přerušit terapii statiny při hodnotách ALT nad trojnásobek horní hranice referenčního intervalu anebo na desetinásobek téže hodnoty u CK [10], lze zde k demonstraci uvést dvě další práce na téma změny koncentrací lipidů během infekce COVID-19 a po jejím odeznění [24, 25]. Je pozorován obvykle mírný pokles LDL a HDL (zde vyšší) a nárůst triglyceridů během léčby pacientů v těžkém stavu ve srovnání s hodnotami stejných pacientů před nemocí. Změny koncentrací nejsou numericky výrazné, zdroje možných diferencí v důsledku nedostatečné harmonizace zůstávají závažné.

Harmonizace měření lipidů je zatížená řadou notorických problémů. Za zmínku stojí především:

• Kalkulace LDL cholesterolu. Existuje řada rovnic k výpočtu, které poskytují signifikantně rozdílné výsledky, závislé na tvaru rovnice, měřící platformě a na koncentraci LDL: Recentně popisuje diference mezi jedenácti rovnicemi a dvěma platformami Roche a Abbott Rossouw [26]

• Problémy jsou a již delší dobu přetrvávají i u přímých stanovení LDL a HDL, a i v komutabilitě kontrolních materiálů pro hodnocení jejich správnosti [27, 28].

Závěr

Důsledná harmonizace měření sérových analytů, založená na Směrnici IVDR 746, odvozené z požadavků nově upravených norem kvality ISO 17511:2020 a ISO 21151:2020 je v plném rozsahu nezbytná stejně jako pro měření všech analytů, i pro sérové analyty, použitelné k monitorování průběhu a závažnosti nemoci COVID-19.

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů

Do redakce došlo 15.12. 2021

Adresa pro korespondenci

RNDr. Bedřich Friedecký, Ph.D.

Praha 8

Střelničná 1680

e-mail: friedecky@sekk.cz