Srovnávací proteomická analýza krevní plazmy pacientů s mnohočetným myelomem léčených režimy s bortezomibem

Súhrn

Východiska:
Termín biomarker se v posledních letech stal, zvláště pak ve spojení s termínem klinická proteomika, jedním z nejfrekventovanějších pojmů v oblasti biomedicínského výzkumu. Předmětem této práce byl výběr vhodné metody frakcionace krevní plazmy umožňující oddělení majoritních proteinů od nízkoabundantní proteinové frakce před následnou proteomickou analýzou pomocí dvourozměrné gelové elektroforézy (2-DE) s cílem zlepšit rozlišení 2-DE mapy a identifikaci proteinů hmotnostní spektrometrií.

Materiál a metody:
Nejprve bylo provedeno paralelní srovnání dvou metod frakcionace krevní plazmy (depleční kolona MARS vs ProteoMiner) na souboru 10 vzorků. Na základě výsledků srovnávacích experimentů byla k analýze vzorků 18 pacientů nemocných mnohočetným myelomem a léčených režimy s bortezomibem použita frakcionační metoda ProteoMiner v kombinaci s 2-DE. Soubor pacientů byl rozdělen na dvě skupiny: skupina pacientů rezistentních na chemoterapii (9 pacientů – progrese onemocnění, stabilizace onemocnění) a skupina pacientů s pozitivní léčebnou odpovědí (9 pacientů – kompletní a parciální remise).

Výsledky a závěr:
Metoda ProteoMiner umožnila na 2-DE mapách signifikantně zvýšit počet proteinových spotů ve srovnání s imunodepleční metodou MARS (Multiple Affinity Removal System). Mezi skupinami pacientů chemorezistentních a pacientů citlivých na léčbu bortezomibem bylo pomocí analýzy obrazu 2-DE gelů zjištěno 15 rozdílových proteinových spotů, které byly analyzovány hmotnostní spektrometrií. V těchto spotech bylo identifikováno 10 proteinů. Sedm proteinů vykazovalo signifikantně nižší hladinu proteinu ve skupině chemosenzitivních pacientů (sérový amyloid P, fibrinogen – gama řetězec, retinol-vazebný protein 4, komplement faktor C4-A, apolipoprotein E, karboxypeptidáza N, komplement faktoru H – příbuzný protein 1) a 3 proteiny vykazovaly signifikantně vyšší hladinu proteinu nebo byly detekovány pouze ve skupině chemosenzitivních pacientů (sérová paraoxonáza 1, alfa-1-antitrypsin a komplement faktor B).

Klíčová slova:
mnohočetný myelom – proteomika – elektroforéza gelová dvourozměrná – plazma – protein – bortezomib

Úvod

Moderní medicína využívá k diagnostice nemocných stanovení hladin látek, které jsou pro dané procesy charakteristické (tzv. „biomarkery“). Mezi typické tělní tekutiny, u kterých je prováděna analýza prognostických a prediktivních biomarkerů nádorových onemocnění, patří krevní sérum, plazma, moč a mozkomíšní mok [1,2]. Méně často se provádí rozbor slin, bronchoalveolární laváže, amniotické nebo folikulární tekutiny. Lidská krevní plazma představuje komplexní tělní tekutinu, kde jsou navíc proteiny přítomny v řádově rozdílných koncentracích (až 10¹⁰) [3]. Zdrojem diverzity proteinů je např. alternativní sestřih mRNA a posttranslační modifikace [4,5]. Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE) je již klasickou metodou pro separaci proteinových směsí před jejich identifikací hmotnostní spektrometrií (MS) [6–8]. Metoda má omezenou kapacitu vzhledem k množství a velikosti analyzovaných proteinů a neumožňuje detekci proteinů s nízkou hladinou exprese [9,10]. Většina potenciálních bio­markerů se v plazmě vyskytuje právě v nízkých koncentracích a nadbytek albuminu a protilátek jejich analýzu komplikuje. Proto je odstranění abundantních proteinů z krevní plazmy (deplece) často prvním a rozhodujícím krokem celého postupu. Odstranění abundantních proteinů by mělo být v ideálním případě úplné, kvantitativní a především reprodukovatelné. Pro tyto účely se často využívají depleční kolonky, které vyvazují většinově zastoupené proteiny na bázi specifických interakcí s imobilizovanými protilátkami. Např. imunodepleční metodou Multiple Affinity Removal System (MARS) lze odstranit 6 nebo 14 nejhojněji zastoupených lidských proteinů krevní plazmy [11,14], séra [15,16] či moče [17]. Některé výsledky prací však poukazují na neúplnou depleci vysoce zastoupených proteinů [16,18,19]. Bellei et al popsali odstranění některých necílených proteinů z frakce nízkoabundantních proteinů [20]. Tu et al. také popsali, že některé proteiny lidské plazmy, jako je alfa-1-kyselý glykoprotein 1, alfa-1-kyselý glykoprotein 2 a alfa-1-antichymotrypsin, se rovněž vážou na MARS kolonu [21].

Novým přístupem prepurifikace (frakcionace) krevní plazmy je afinitní nedepleční metoda ProteoMiner^TM (Bio-Rad Laboratories, USA), která využívá rozdílů ve vazebných afinitách přítomných proteinů k hexapeptidům [22–24]. Hexa­peptidy jsou, podobně jako protilátky u deplečních kolonek, imobilizovány na vhodném nosiči uloženém v prepurifikační koloně. V koloně jsou pak přítomny ve stejném množství odlišné hexapeptidy z rozsáhlé hexapeptidové knihovny. Každý hexapeptid přitom vykazuje rozdílnou proteinovou specifitu. Výsledkem je omezená celková vazebná kapacita kolony pro konkrétní proteiny. Vysoce abundantní proteiny jsou tak na koloně zachyceny jen částečně, kdežto proteiny o nízké vstupní koncentraci jsou naopak zachyceny poměrově více. Při celém procesu je navíc zachována informace o relativní kvantitě proteinu, což umožňuje relativní srovnání více vzorků. Nutno však dodat, že existuje i práce poukazující na možný odlišný princip funkce metody ProteoMiner [25].

Cílem této práce bylo srovnání obou metod frakcionace krevní plazmy nezbytné před 2-DE proteomickou analýzou nízkoabundantní frakce proteinů s cílem zvýšit počet rozlišitelných proteinových spotů obrazu 2-DE mapy, které by umožnilo identifikovat proteinové změny charakteristické pro pacienty senzitivní a chemorezistentní na podané antimyelomové léčivo.

Materiál a metody

Zpracování odebrané krve

Vzorky krevní plazmy byly získány od 28 pacientů nemocných mnohočetným myelomem (MM) a léčených na Interní hematoonkologické klinice LF MU a FN MU Brno po podepsání informovaného souhlasu s odběrem biologického materiálu. Lidská krev byla odebrána do uzavřeného odběrového systému S-Monovette (2,7ml zkumavka s K₃EDTA, Sar­stedt, Německo) a centrifugována 15 min při 2 200 g 20 °C. Plazma byla rozdělena do alikvotů po 0,5 ml a zamražena do –80 °C pro následnou analýzu. Vzorky 10 pacientů byly použity pro srovnávací studii frakcionačních postupů, vzorky druhé skupiny 18 pacientů vybrané pro vlastní proteomickou analýzu byly pak zpracovány zvoleným postupem. Základní charakteristika těchto 18 pacientů, u kterých byla provedena srovnávací 2-DE analýza, je uvedena v tab. 1.

Frakcionace proteomu krevní plazmy

Po rozmražení byla plazma centrifugována (5 min při 16 000 g, 20 °C) přes 0,22 µm filtr (Agilent Technologies, USA). Frakce nízkoabundantních proteinů 10 vzorků krevní plazmy byly získány paralelně metodou ProteoMiner (Bio-Rad, USA) a metodou afinitní chromatografie na koloně MARS-6-Hu (4,6 × 100 mm; Agilent Technologies, USA). U obou metod bylo postupováno podle pokynů výrobce (obr. 1).

ProteoMiner

Alikvóty plazmy (1 ml od každého pacienta) byly pipetovány do ProteoMiner centrifugačních kolon a inkubovány 2 hod na rotátoru SB3 Stuart (BioCote, UK) při 20 °C. Po promytí kolony (3 × 5 min) pufrem obsahujícím 150 mmol/l NaCl, 10 mmol/l NaH₂PO₄ pH 7,4 (3 × 5 min, 1 ml pufru) byly frakce nízkoabundantních proteinů z kolony vymyty elučním pufrem (Bio-Rad, USA) obsahujícím 8 mol/l močovinu a 2% 3-3[(3-cholamidopropyl)dimethyl­amonio]propan-1-sulfonát (CHAPS), 3 × 15 min při 750 rpm, 20 °C se 100 µl pufru. Všechny 3 eluované frakce od každého pacienta byly spojeny do jedné frakce.

Metoda MARS (Multiple Affinity Removal System)

Metodou MARS bylo odstraněno celkem 6 vysokoabundantních proteinů lidské krevní plazmy: albumin, IgG, IgA, transferin, alfa-1-antitrypsin a haptoglobin. Vzorek plazmy od každého pacienta byl zpracován paralelně dvakrát. Plazma byla 4× naředěna v pufru A (Agilent Technologies, USA): 80 µl plazmy + 240 µl pufru A. Nízkoabundantní frakce proteinů byla získána promytím kolony pufrem A při průtoku 0,5 ml/min a frakce vysoko­abundantních proteinů byla získána promytím kolony pufrem B při průtoku 1 ml/min (obr. 2). Jednotlivé frakce nízkoabundantních proteinů (500–600 µl) byly odsoleny kapalinovou chromatografií na koloně mRP-C18 s makroporézní silikou (4,6 × 50 mm; Agilent Technologies, USA) při 80 °C a průtoku 0,75 ml/min. Mobilní fáze A obsahovala 0,1% (v/v) kyselinu trifluoroctovou (TFA, Sigma-Aldrich, USA) a 3% (v/v) acetonitril (ACN, Merck, Německo) ve vodě, mobilní fáze B pak 97% (v/v) ACN a 0,08% (v/v) TFA ve vodě. Gradientová eluce začínala na 10 % mobilní fáze B a lineárně rostla na 70 % mobilní fáze B v prvních 5 minutách. V průběhu následující jedné minuty obsah mobilní fáze B vzrostl na 100 % a na této hodnotě zůstal další 2 minuty. Poté následovala reekvilibrace kolony 10 % mobilní fáze B. Frakcionace byly provedeny na kapalinovém chromatografu od firmy Waters. Na vakuové odparce SpeedVac (Thermo Scientific, USA) byly získané frakce obsahující nízkoabundantní proteiny odpařeny a proteinové pelety byly rozpuštěny v 60 µl IPG8 pufru obsahujícím 7 mol/l močovinu, 2 mol/l thiomočovinu, 4% CHAPS, 60 mmol/l dithiotreitol (DTT), 0,8% (v/v) amfolyt Pharmalyte pH 3–10, 0,003% (w/v) bromfenolovou modř (vše Sigma-Aldrich, USA). Celková koncentrace proteinů byla stanovena pomocí soupravy BioRad Protein Assay podle metody Bradfordové [26] na spektrofotometru SmartSpec Plus, s použitím standardu γ-globulinu (vše Bio-Rad, USA).

Dvourozměrná gelová elektroforéza (2-DE)

2-DE separace vzorku od každého pacienta byly prováděny v duplikátu. Proteiny krevní plazmy (100 µg/315 µl IPG8 pufru) byly naneseny na komerčně dostupné proužky s imobilizovaným nelineárním pH gradientem (ReadyStrip IPG Strips o délce 18 cm, pH 3–10, Bio-Rad, USA). Přes noc probíhala pasivní rehydratace vzorku na zvolený proužek (16 hod, 20 °C). První rozměr 2-DE byl proveden na izoelektrickém fokuzátoru Protean IEF cell (Bio-Rad, USA) při teplotě 20 °C v následujících krocích: 1) 150 V, 30 min, 2) 1 500 V, 3 hod, 3) 3 500 V, 3 hod, 4) 5 000 V, 80 kVh, 5) 500 V, 24 hod. Po izolektrické fokuzaci (IEF) byla při 20 °C provedena v IPG proužku 1) redukce proteinů 2% (w/v) DTT (10 min) a 2) alkylace proteinů 2,5% (w/v) jodacetamidem (IAA, Sigma-Aldrich, USA), 10 min, které byly rozpuštěny v ekvilibračním pufru obsahujícím 6 mol/l močovinu, 0,375 mol/l Tris(hydroxymethyl)-ami­nomethan pH 8,8 (Tris-HCl, Serva, USA), 2% (w/v) dodecylsulfát sodný (SDS, Serva, USA); 30% (v/v) glycerol. IPG proužek byl přenesen na 12% polyakrylamidový gel o rozměrech 18 × 20 cm s molekulovým standardem (Precision Plus Protein Standards, Bio-Rad, USA, 1 µl standardu naneseného na wicks) a zalit 1% agarózou (Fluka, USA). Elektroforéza probíhala v systému Protean Plus Dodeca Cell (Bio-Rad, USA) v elektroforetickém pufru obsahujícím 19,2 mmol/l glycin (Bio-Rad, USA), 19 mmol/l SDS, 2,5 mmol/l Tris-HCl pH 8,3 za konstantního napětí 50 V, 1 hod a následně 100 V, 17 hod (zdroj PowerPac Universal, Bio-Rad, USA). 2-DE nádoba byla chlazena na 10 °C (Julabo, Labortechnik, Německo).

Vizualizace 2-DE gelů a analýza obrazu

Gely byly fixovány 2 × 30 min ve fixačním pufru (200 ml/gel) obsahujícím 10% (v/v) ethanol a 7% (v/v) kyselinu octovou (vše Penta, Česká republika). Separované proteiny byly v gelu vizualizovány fluorescenčním barvením Sypro Ruby (Bio-Rad, USA) a snímány na laserovém skeneru Typhoon^TM FLA-7000 (Fuji Photo Film Co., Ltd., USA). Analýza obrazu 2-DE gelů byla provedena pomocí programu PDQuest 8. 0. 1 (Bio-Rad, USA). Při vyhodnocení byla provedena normalizace dat, která sloužila k vyrovnání intenzit jednotlivých gelů. Obraz tzv. Master gelu byl vytvořen jako syntetický obraz normalizovaných dat všech 36 2-DE gelů vytvořených z tzv. matchsetu. Pomocí analytických setů byly gely kvalitativně, kvantitativně a statisticky vyhodnoceny (Studentův t-test na hladině významnosti 0,05). Pomocí analýzy byly nalezeny rozdílové proteinové spoty, jejichž intenzita byla 2× nebo 4× snížená nebo zvýšená mezi skupinami pacientů citlivých a chemorezistentních na bortezomib. Zahrnuty jsou kvalitativní změny přesahující desetinásobek hodnoty pozadí.

Identifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie

Oblasti gelu obsahující rozdílně zastoupené proteiny mezi 2 skupinami pacientů byly vyřezány pomocí přístroje EXQuest^TM Spot Cutter (Bio-Rad, USA). Po odbarvení pak byly proteiny v gelu proteolyticky naštěpeny trypsinem (Promega, USA). Vzniklá směs peptidů byla analyzována pomocí MALDI-MS, resp. MALDI-MS/MS, a v případě dosažení nesignifikantního výsledku identifikace proteinu následně i kapalinovou chromatografií s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS).

Analýzy technikou MALDI-MS a MS//MS analýzy byly provedeny na přístroji Ultraflex III (Bruker Daltonik, Německo). Vzorek (1 µl) byl na vzorkovací desce AnchorChip smíchán s 0,6 µl roztoku matrice (2 mg/ml, kyselina α-kyano-4-hydro­-xyskořicová, Bruker Daltonik, Německo) ve směsi 2,5% TFA a 100% ACN, 1 : 2 v/v) [27].

Analýzy tryptických digestů technikou LC-MS/MS byly provedeny na systému EASY-nLC (Proxeon, Thermo Scientific, USA) spojeném on-line s HCTultra PTM Discovery System (Bruker Daltonik, Německo) hmotnostním spektrometrem s iontovou pastí vybaveným nanosprejem. Po odsolení a prekoncentraci na předkoloně (Jupiter Proteo, 100 µm × 30 mm, Pheno­-menex, USA) byly vzorky separovány na kapilární koloně (X-Bridge BEH 130 C18, 100 µm × 100 mm, Waters, USA) pomocí 0,1% FA/ACN gradientu. Prekoncentrační a separační kolony použité k LC separaci byly plněny podle dříve popsaného postupu [28]. Hmotnostní spektrometr pracoval v pozitivním módu v m/z rozsahu 300–1 500 pro MS a 100–2 500 pro MS/MS spektra.

Ke zpracování MS a MS/MS dat byl použit prohledávací algoritmus MASCOT 2.2 (MatrixScience, UK). Databázové hledání bylo provedeno proti NCBI databázi (neredundantní, taxonomie Homo sapiens). U peptidového mapování na základě MALDI-TOF MS dat byla nastavena tolerovaná chyba určení molekulové hmotnosti peptidu na 30 ppm, u MALDI-MS/MS dat pak na 0,5 Da. Při prohledávání ESI-MS/MS dat byla nastavena tolerance 0,5 Da pro MS i MS/MS data s korekcí na hmotnost prekurzorového iontu na jeden ¹³C atom. Pro všechna hledání byla nastavena oxidace methioninu a karbamidometylace jako variabilní modifikace a jedno povolené vynechané štěpné místo pro trypsin.

Pro určení funkce identifikovaných proteinů byla využita databáze UniProt­­KB/Swiss-Prot (http://www.uniprot.org/, [29]) a PANTHER klasifikační systém (http://www.pantherdb.org/, [30]).

Statistická analýza dat

Statisticky významný rozdíl mezi počtem proteinových spotů získaných metodami ProteoMiner a MARS-6-Hu byl určen Wilcoxonovým párovým testem na hladině významnosti 0,05 (program Statsoft Statistica 10.0).

Výsledky

V této práci jsme porovnali u 10 vzorků krevní plazmy dvě metody (MARS, ProteoMiner) umožňující odstranění vysokoabundantních proteinů krevní plazmy a zisk obohacené frakce nízkoabundantních proteinů (obr. 1). Metodou MARS bylo odstraněno celkem 6 majoritních proteinů krevní plazmy (obr. 2). Frakce nízkoabundantních proteinů získané oběma metodami byly poté separovány metodou 2-DE. U frakcí získaných metodou ProteoMiner bylo na 2-DE mapách detekováno o přibližně 200 proteinových spotů víc než u frakcí získaných metodou MARS, p < 0,005. Celkový přehled o počtu identifikovaných proteinových spotů na 2-DE gelech pro obě metody uvádí tab. 2. Na základě těchto výsledků byla metoda ProteoMiner vybrána pro další 2-DE analýzy vzorků krevní plazmy 18 pacientů nemocných MM. Rozdíly v proteinových mapách mezi skupinami pacientů citlivých a rezistentních na podaný bortezomib byly určeny pomocí programu PDQuest. Celkem bylo nalezeno 15 rozdílových proteinových spotů (obr. 3), ve kterých bylo identifikováno MS technikami 10 proteinů (tab. 3). Tři proteiny vykazovaly signifikantně nižší hladinu proteinu v celé skupině 9 chemosenzitivních pacientů – sérový amyloid P (spot 3203), fibrinogen – gama řetězec (spot 3625), retinol-vazebný protein 4 (spot 2208). Dvě formy komplementu faktoru C4-A (spoty 6117, 6319) a apolipoprotein E (spot 2224) vykazovaly signifikantně nižší hladinu proteinu u skupiny 8, resp. 6 chemosenzitivních pacientů. U šesti z devíti chemosenzitivních pacientů byla pozorována signifikantně zvýšená exprese tří proteinů – dvě formy sérové paraoxonázy (spoty 1335, 1336), alfa-1-antitrypsin (spot 1420) a komplement faktor B (spot 6513). U celé skupiny 9 chemorezistentních pacientů byly detekovány signifikantně zvýšené hladiny 2 proteinů: izoformy komplementu faktoru H – příbuzného proteinu 1 (spoty 4314, 5319, 6308, 7306) a karboxypeptidáza N (spot 5325).

Diskuze a závěr

Proteomické přístupy využívané při hledání nových biomarkerů krevní plazmy kombinují postupy založené na frakcionaci, separaci, detekci a identifikaci přítomných proteinů. Aby bylo možné detekovat nízkoabundantní proteiny krevní plazmy, je třeba nejdříve odstranit většinově zastoupené proteiny. K tomuto účelu je na trhu dostupných několik analytických metod [13,31,32]. V naší práci jsme se zaměřili na srovnání dvou prepurifikačních metod umožňujících detekci nízkoabundantních proteinů pomocí 2-DE. Použili jsme dvě afinitní metody: Multiple Affinity Removal Sy­stem (MARS) a ProteoMiner. Metoda ProteoMiner představuje odlišný, nedepleční systém pro zkoncentrování méně zastoupených proteinů a oproti metodě MARS umožnila detekci přibližně trojnásobného počtu proteinových spotů na 2-DE gelech (318 vs 111 identifikovaných spotů, p < 0,005). Výhodami metody ProteoMiner jsou dobrá reprodukovatelnost, jednoduchost postupu a přímá kompatibilita s dalšími proteomickými metodami, jako jsou např. diferenční gelová elektroforéza (2D-DIGE) a desorpce/ionizace laserem z upravených povrchů (SELDI-TOF-MS) [33]. Bylo prokázáno, že saturace kuliček vysokoabundantními proteiny neovlivňuje kvantifikaci obohacené frakce nízkoabundantních proteinů [34], proto jsme tuto metodu zvolili jako vhodnou prepurifikační metodu před 2-DE analýzou proteinů krevní plazmy.

Pomocí metod ProteoMiner/2-DE/MS byly identifikovány signifikantní změny v expresi proteinů mezi skupinami pacientů senzitivních a rezistentních na bortezomib. Identifikované proteiny patří především do skupiny běžně se vyskytujících proteinů, které se v plazmě nacházejí v poměrně vysoké koncentraci. Podle jejich specifické funkce se jedná o transportní proteiny (APOE, FGG, RBP4), metabolické proteiny (CPN1, PON1, CFHR1, C4A, CFB, SERPINA1), signální proteiny (FGG, C4A, CFHR1, CFB), proteiny aktivující komplementový systém (CFB, CFHR1, C4A), proteiny imunitní odpovědi (SAP, FGG, PON1) a proteiny aktivní při koagulaci krve (FGG, CFHR1).

U některých identifikovaných proteinů již byl popsán vztah k onemocněním nesouvisejícím s mnohočetným myelomem. Aktivovaná komplementová kaskáda je mechanizmem, který představuje prospěšnou obrannou reakci organizmu, ale také může vyvolávat širokou škálu patologických reakcí od zánětu až po degenerativní onemocnění nebo k nim přispívat. Aktivace komplementu byla popsána např. u alergické reakce typu III, kdy je komplement aktivován imunokomplexy, u systémového lupus erythematodes, u diabetes mellitus I. typu, u hemolytických anémií, revmatoidní artritidy a dny [35].

Alfa-1-antitrypsin je 52 kDa protein akutní fáze, typický serin proteázový inhibitor vyskytující se v plazmě o koncentraci 0,9–2,0 g/l. Protein je tvořený v játrech, odkud je uvolňován do krevního řečiště. Zabezpečuje ochranu organizmu před účinky enzymů (elastázy a kolagenázy) uvolňovaných z bílých krvinek při zánětu. Vrozený defekt AAT způsobuje rozvoj plicního a jaterního postižení [36].

Sérová paraoxonáza 1 (PON1) je glykoprotein o molekulové hmotnosti 43 kDa, který je syntetizován v játrech a následně vyplavován do krevního řečiště, kde je asociován s lipoproteiny o vysoké hustotě (HDL) [37]. PON1 hraje významnou roli ve vzniku a rozvoji aterosklerotického postižení, diabetu mellitu II. typu a jeho komplikací [38]. Řada asociač­ních studií prokázala vztah mezi polymorfizmy PON1 s neurodegenerativními onemocněními, zejména s Parkinsonovou a Alzheimerovou nemocí [39].

Retinol-vazebný protein 4 je významný klinický biomarker pro detekci inzulinové rezistence a diabetu melli­­tu II. typu [40]. Fibrinogen je glykoprotein o molekulové hmotnosti 340 kDa, který se běžně vyskytuje v krevní plazmě a je nezbytný ke správnému zajištění hemokoagulace. Jeho plazmatické koncentrace se zvyšují např. při zánětu, poškození tkání a při nádorových onemocněních. Apolipoprotein E je významný plazmatický lipoprotein zodpovědný za transport a metabolizmus cholesterolu. Klinicky abnormální funkce ApoE je sdružena s mnoha onemocněními, jako je ateroskleróza a Alzheimerova nemoc [41].

Ačkoli použití metody ProteoMiner v kombinaci s 2-DE analýzou podstatně zvýšilo počet detekovaných proteinů ve srovnání s jinými komerčně dostupnými frakcionačními technikami, zvolený postup analýzy se ukázal jako nevhodný pro detailní studium mechanizmu lékové rezistence v krevní plazmě pacientů nemocných MM. Ke studiu minoritních složek bude nutné využít vhodné vícestupňové kombinace frakcionačních a separačních chromatografických technik s následnou citlivou hmotnostně spektrometrickou detekcí.

Poděkování

Děkuji Danuši Fridrichové za přípravu tryptických digestů. 

Tato práce byla podpořena granty MŠMT ČR (LC06027 a MSM0021622434) a projektem IGA MZ (NS9683) a NT 12130) a grantem GAČR GAP304/10/1395..

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

prof. MUDr. Hájek Roman, CSc.

Ústav patologické fyziologie

Lékařská fakulta MU

Kamenice 5

625 00 Brno

e-mail: r.hajek@fnbrno.cz

Obdrženo: 3. 6. 2011

Přijato: 8. 9. 2011