Inhibice signalizace B buněčným receptorem: první cílená léčba u chronické lymfocytární leukemie a dalších B buněčných lymfomů

Súhrn

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je nejčastější a stále konvenčními metodami nevyléčitelnou leukemií dospělé populace v západním světě. Hromadící se poznatky o úloze signalizace zprostředkované B buněčným receptorem (BCR) v bio­logii maligních CLL B lymfocytů vedly k úvahám o možnosti klinického využití „BCR inhibitorů“. V nedávné době byly publikovány výsledky klinických studií tří různých molekul (fostamatinib, ibrutinib a GS‑ 1101) inhibujících kinázy zapojené v BCR dráze (Syk, Btk, PI3K), které vedly k impresivní klinické odpovědi u CLL. Domníváme se, že výsledky těchto klinických studií mohou výrazně změnit léčbu chronické lymfocytární leukemie a ně­kte­rých dalších B buněčných lymfomů v několika následujících letech a „BCR inhibitory“ možná představují tolik hledanou „cílenou léčbu“. V následujícím textu shrneme poznatky o molekulární podstatě deregulace BCR signalizace u CLL lymfocytů a výsledky klinických studií využívajících jejích inhibitorů.

Klíčová slova:
BCR signalizace –  B buněčný receptor –  Btk protein –  Syk protein –  Lyn protein –  PI3K –  CAL‑ 101 –  PCI‑ 32765 –  R788

Úvod

Chronická lymfocytární leukemie (chronic lymphocytic leukemia –  CLL) představuje nejčastější leukemii dospělé populace v západním světě. Jedná se o onemocnění s velmi variabilním klinickým průběhem, u nějž bylo popsáno množství klinicko‑bio­logických faktorů přispívajících k patogenezi a prognóze (shrnuto v [1,2]). Přesto, že se jedná o jednu z nejčastěji studovaných B buněčných malignit, dosud se nepodařilo navrhnout vhodnou cílenou léčbu vycházející z identifikace kauzálních molekulárních aberací. Nedávno byly publikovány výsledky celogenomového a exomového sekvenování mnoha genomů CLL pacientů (shrnuto v [3]), které překvapivě ukázaly, že u CLL neexistuje žádná jednoticí genová aberace a i ty nejčastější mutace se vyskytují u méně než 15 % případů. Pozornost výzkumníků se tedy opět obrátila k úloze deregulace BCR (B  cell receptor –  BCR) signalizace, která byla u CLL opakovaně popsána z mnoha úhlů a je možná tím základním patogenetickým mechanizmem. Tyto domněnky podpořila recentní publikace v časopise Nature [4], která ukázala, že u CLL dochází ke konstitutivní signalizaci přes B buněčný receptor bez přítomnosti antigenu, což je zřejmá paralela k deregulaci aktivačních kináz u mnoha jiných nádorových onemocnění. Hromadící se poznatky o úloze BCR signalizace vedly k úvahám o terapeutickém využití její inhibice. V nedávné době byly publikovány výsledky klinických studií tří různých inhibitorů BCR dráhy (fostamatinib, ibrutinib a GS‑ 1101), které vedly k léčebné odpovědi u výrazné části pacientů. Domníváme se, že výsledky těchto klinických studií jsou natolik zásadní, že mohou výrazně změnit terapii CLL v několika následujících letech a možná i představují onu tolik hledanou „cílenou léčbu“. Inhibice BCR signalizace je podstatný krok také v léčbě dalších B buněčných lymfomů, u nichž byla popsána dependence na BCR dráze (např. ABC subtyp DLBCL). V následujícím textu shrneme poznatky o molekulární podstatě deregulace BCR signalizace u maligních CLL lymfocytů a výsledky klinických studií využívajících jejích inhibitorů.

BCR signalizace u normálních a CLL B lymfocytů

První poznatky o důležitosti BCR pro popsání CLL patogeneze pocházejí ze studia struktury těžkého řetězce imunoglobulinu, který tvoří základní povrchovou komponentu BCR. Ve většině případů exprimují CLL buňky na membráně IgM a IgD imunoglobulin a na základě přítomnosti či absence somatických hypermutací v jeho těžkém řetězci je lze přiřadit k jednomu ze dvou klinicko‑bio­logických subtypů onemocnění [5,6]. Pacienti, u nichž došlo k hypermutacím ve variabilní části těžkého řetězce imunoglobulinu (IgHV), mají lepší prognózu a předpokládá se, že tyto buňky prošly germinálním centrem lymfatické uzliny, kde došlo k aktivaci AID enzymu zodpovědného za tento proces [1]. Druhá polovina CLL pacientů nemá mutace v IgHV (nebo jen minimální množství) a u těchto buněk se předpokládá, že došlo k maligní transformaci B lymfocytu před vstupem do germinálního centra. Důležitost struktury imunoglobulinové komponenty BCR je také zřejmá z preferenčního zastoupení ně­kte­rých variabilních subgenů IgHV (např. V3– 21, V1– 69) nebo vzniku tzn. stereotypních receptorů, které jsou přítomny u cca 1/ 3 případů CLL [7]. Stereotypní IgHV receptory mají identickou strukturu oblasti CDR3 u nepříbuzných CLL pacientů. Oblast CDR3 vzniká při přeskupení imunoglobulinových subgenů (V‑ D‑ J‑ C) a představuje hlavní místo vazby antigenu na imunoglobulin. Tyto poznatky vedly k všeobecně akceptovanému názoru, že se na patogenezi CLL podílí stimulace antigenem, pravděpodobně auto‑ antigenem [6,8,9]. U CLL buněk také dochází k endocytóze povrchových IgM molekul, což je známou reakcí B lymfocytů na perzistentní kontakt s antigenem vedoucí k částečné anergii [6,10]. Bylo identifikováno několik antigenů, které se mohou vázat na Ig z CLL lymfocytů, a například představují produkty apoptických buněk [11– 13]. Stimulace BCR receptoru antigenem vede k expresi genů pro‑proliferačních a anti‑ apoptických drah, což chrání buňky před spontánní i indukovanou apoptózou [14– 16]. Další důkaz významu BCR signalizace pro CLL pochází ze studie srovnávající genovou expresi CLL buněk izolovaných z různých kompartmentů (periferní krev, lymfatická uzlina, kostní dřeň) [17]. Tato studie ukázala, že právě v lymfatických uzlinách, kde probíhá nejvýraznější proliferace CLL buněk, dochází k prominentní aktivaci BCR dráhy. Důležitost BCR signalizace byla také popsána u difuzního velkobuněčného lymfomu (DLBCL) a lymfomu z plášťových buněk (MCL). U MCL jsou v maligních B lymfocytech konstitutivně aktivní kinázy Syk nebo PKCβII a u DLBCL se u agresivnějšího subtypu onemocnění, označovaného jako ABC (activated B cell‑like), vyskytují mutace v BCR‑ modulujících proteinech CARD11, CD79b a CD79a [18,19].

Základní subtypy CLL definované přítomností/ absencí mutací v IgHV se výrazně liší nejenom v prognóze [1], ale především v ně­kte­rých funkčních aspektech BCR signalizace. Buňky s nemutovaným IgHV odpovídají na stimulaci BCR in vitro výraznější aktivací signalizačních molekul a fosforylací kináz zodpovědných za aktivaci genů anti‑apoptické odpovědi [1,20]. Na druhé straně CLL buňky s mutovaným IgHV exprimují menší množství IgM na svém povrchu a jsou více anergní vůči BCR stimulaci [6]. Je třeba zdůraznit, že tyto poznatky vycházejí ze studia CLL buněk získaných z periferní krve a pravděpodobně neodrážejí charakteristiky klíčové populace dělících se CLL buněk v lymfatických uzlinách a kostní dřeni. Zároveň bylo nedávno překvapivě popsáno, že specifická struktura BCR receptoru derivovaného z CLL buněk způsobuje konstitutivní signalizaci bez přítomnosti antigenu [4]. Tyto poznatky zatím nejsou zcela vysvětleny na molekulární úrovni, ale je pravděpodobné, že antigen‑ dependentní signalizace se u CLL buněk často kombinuje také s konstitutivní aktivací BCR dráhy.

Signalizace přes BCR zprostředkovává u CLL buněk nezbytné signály pro přežití, proliferaci, migraci a rezistenci k terapii [21,22]. Není překvapivé, že inhibice BCR dráhy má pro maligní lymfocyt fatální důsledky, uvědomíme‑li si její důležitou úlohu pro osud vyvíjejícího se normálního B lymfocytu a klonální proliferaci maturovaného B lymfocytu. Dovolíme si zde stručně rekapitulovat klíčové proteiny a dráhy aktivované antigenem po vazbě na povrchový Ig. Imunoglobulinová komponenta BCR sama o sobě nemá kinázovou aktivitu a první kinázou odpovídající na jeho stimulaci je Lyn, která fosforyluje cytoplazmatické části BCR‑ asociovaných Igα a Igβ (ITAM), které následně slouží jako místa organizace „signalosomu“ (obr. 1, shrnuto v [23]). BCR signalizace je dále propagována kinázou Lyn rekrutující PI3K, kinázou Syk pomocí asociace s adaptorovou molekulou BLNK a kinázou Btk aktivující fosfolipázu PLCγ2. Pořadí, v kterém jsou jednotlivé kinázy a adaptorové molekuly sdruženy a aktivovány, bylo doposud studováno především na normálních B lymfocytech a v myších modelech, které prokázaly nezbytnost proteinů Syk, Btk, PI3Kδ a fosfolipázy PLCγ2 pro funkce BCR [23]. Je zajímavé, že první responsivní kináza Lyn není nezbytně nutná pro BCR signalizaci a její inhibice může paradoxně vést k posílení BCR dráhy, neboť Lyn zastává klíčové funkce také v její inhibici a „ukončení“ BCR aktivace. Tyto inhibiční funkce, na rozdíl od jejích úloh v aktivaci BCR, nejsou redundantní a u myší s delecí genu pro Lyn dochází k hyperaktivaci B lymfocytů a vzniku těžké autoimunity [23].

Funkcí výše zmíněných kináz je aktivovat proteiny PLCγ2 a PI3K zodpovědné za integraci signálu a produkci tzv. druhých poslů. PLCγ2 produkuje inositol‑ 1,4,5- trifosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG), které vedou k vylití intracelulárních zásob kalcia a aktivaci proteinkinázy C, MAPK, ERK1/ 2, p38, transkripční aktivaci NFκB a dalších. PI3K je na membráně vázána k intracelulární části CD19 a dává vznik fosfatidylinositol 3,4,5- trifosfátu a posiluje BCR signalizaci přes další aktivaci Btk a Akt dráhu [23]. U CLL byla kromě výše zmíněných proteinů popsána důležitá úloha tyrosinkinázy ZAP‑ 70, která zde ale pravděpodobně funguje spíše jako adaptorová molekula ně­kte­ré z kináz [24]. Rozdíly v expresi ZAP‑ 70 jsou silně asociovány s odpovědí CLL buněk na stimulaci BCR in vitro a jsou dobře známým prognostickým faktorem spojeným s nemutovaným IgHV [25]. Podobně také CD38 a C49d, obě asociované s prognózou CLL, napomáhají svými funkcemi v iniciaci BCR signalizace a možná tak integrují více signálů v mikroprostředí lymfatických orgánů, kde zprostředkovávají adhezi a migraci [26– 28].

Inhibice BCR‑ asociovaných kináz ovlivňuje nejen signalizaci, ale také migraci B lymfocytů, což bylo zřejmé od počátečních aplikací těchto inhibitorů pacientům. Aplikace „BCR inhibitorů“ vyvolává u většiny CLL pacientů během několika dní mobilizaci B lymfocytů z uzlin a kostní dřeně [29]. Tato iniciální lymfocytóza vedla k obavám, zda u pacientů nedochází k progresi choroby při léčbě, neboť vzestup periferní lymfocytózy při chemo‑ / chemoimunoterapii je uznaným hodnoticích kritériem pro progresi. Transientní lymfocytóza trvající několik měsíců je například přítomna u 70 % pacientů léčených Btk inhibitorem ibrutinibem (viz níže), ale nebývá provázena klinickými příznaky hyperviskozity. V kontextu těchto poznatků lze níže diskutované inhibitory klíčových enzymů BCR dráhy označit spíše za „BCR inhibitory v širším smyslu“, neboť specificky neinhibují pouze jednu molekulární dráhu. Je pravděpodobné, že právě kombinace inhibice několika drah, které jsou důležité pro přežití maligních B lymfocytů (BCR signalizace, signalizace chemokiny a integriny apod.), stojí za jejich dobrým klinickým efektem. Zároveň „BCR inhibitory“ prakticky postrádají myelotoxicitu, což dovoluje do jejich klinických studií zařazovat pacienty s hlubokou cytopenií, kteří by nebyli vhodní pro agresivní chemo-/ chemoimunoterapeutické kombinace.

„BCR inhibitory“

Inhibice Syk pomocí fostamatinibu

Syk (Spleen Tyrosine Kinase) představuje nereceptorovou tyrosinkinázu, která ve vývoji B lymfocytů zaujímá částečně redundantní funkce se ZAP‑ 70 (význam ZAP‑ 70 u CLL viz výše). Delece genu Syk v myším modelu způsobuje blok ve vývoji a absenci zralých B lymfocytů. U CLL byla popsána konstitutivní aktivace Syk (fosforylace pY352) u signifikantního množství pacientů a amplituda aktivace Syk v odpovědi na stimulaci BCR je také známkou agresivnějšího fenotypu [24,30,31]. Inhibice Syk kinázy přeruší stromatem mediovanou rezistenci k apoptóze a inhibuje BCR‑ , chemokin‑ a integrin‑ dependentní signalizaci [16,30,32].

Fostamatinib (R788, FosD) je prvním „inhibitorem BCR signalizace“, který byl u CLL testován a prokázal životaschopnost tohoto terapeutického konceptu (opomineme‑li dasatinib, který také částečně inhibuje tuto dráhu přes vazbu na Lyn). Fostamatinib je podáván orálně a konvertován na aktivní metabolit (R406) [33], který inhibuje preferenčně Syk, ale také Flt3, Jak a Lck [34]. V klinické studii fáze 1/ 2 byl testován fostamatinib u 68 pacientů s relabujícím non‑hodgkinským lymfomem, kteří zahrnovali také 15 CLL/ SLL pacientů, z nichž 55 % dosáhlo klinické odpovědi (výsledky klinického testování shrnuty v tab. 1) [35]. U ostatních diagnóz dosáhl fostamatinib výrazně menšího procenta léčebné odpovědi –  22 % (5 z 23) u DLBCL, 10 % (2 z 21) u FL a 11 % (1 z 9) u MCL [35]. V současném okamžiku nepokračuje testování u hematoonkologických diagnóz, neboť výrobce (AstraZeneca) se soustředil na schválení preparátu pro léčbu revmatoidní artritidy. Lze však očekávat, že budou u CLL testovány nové, specifičtější inhibitory Syk.

Inhibice PI3K pomocí GS‑ 1101

PI3K se skládá z regulační subjednotky p85 a katalytické subjednotky p110, které integrují množství proliferačních a anti‑apoptických signálů a dále je přenášejí prostřednictvím rekrutování Btk, PLCγ2 a aktivace Akt (obr. 1). V B lymfocytech se především vyskytuje jedna ze čtyř izoforem enzymu označovaná jako PI3K delta (δ). Mutace inaktivující gen pro PI3Kδ způsobuje u myší poruchu vyzrávání B lymfocytů (především B1 a MZ) a produkce protilátek [23]. U CLL je PI3K konstitutivně více exprimována ve srovnání s normálními B lymfocyty a je aktivována podobně jako Syk v odpovědi na BCR stimulaci, chemokiny a adhezi přes integriny [36].

GS‑ 1101 (dříve CAL‑ 101, Gilead Scien­ces) byl vyvinut jako selektivní, orálně podávaný inhibitor PI3K izoformy δ, tak aby se odstranilo maximum nežádoucích účinků způsobených inhibicí PI3K mimo hematopoetické buňky. Ve fázi 1/ 2 byl GS‑ 1101 podán 54 CLL pacientům, z nichž u 80 % došlo ke zmenšení lymfatických uzlin alespoň o 50 % [37]. Vzhledem k lymfocytóze, která je přičítána inhibici migrace a adheze maligních buněk (viz výše), byla celková terapeutická odpověď hodnocená dle standardních kritérií relativně nízká (26 %) –  výsledky klinického testování shrnuty v tab. 1. Tyto výsledky (společně s výsledky při podáváni ibrutinibu, viz níže) vedly k zavedení provizorní kategorie hodnocení léčebné odpovědi „parciální odpověď s lymfocytózou“ a pravděpodobně povedou k přepracování hodnoticích doporučení v tomto smyslu.

Předpokládaným mechanizmem účinku GS‑ 1101 je indukce apoptózy, inhibice BCR signalizace a také vliv na chemotaxi [38– 41]. Podávání GS‑ 1101 vede k normalizaci hladin chemokinu CXCL12 a CXCL13 u CLL pacientů, což by mohlo být využitelné jako marker odpovědi na léčbu [38]. Velmi zajímavé výsledky s léčebnou odpovědí u > 80 % pacientů poskytuje kombinace GS‑ 1101 s rituximabem nebo bendamustinem [42]. Kombinace léčiv mobilizujících maligní B lymfocyty do periferie s monoklonálními protilátkami je velmi racionální, neboť bylo prokázáno, že stromální buňky kostní dřeně a lymfatických uzlin chrání B lymfocyty před efekty terapeutických protilátek [28]. U kombinace „BCR inhibitorů“ s protilátkami je pozorován velmi dobrý klinický efekt při odstranění ně­kte­rých komplikací plynoucích z aplikace chemoterapeutické komponenty onkologických režimů [43].

Inhibice Btk pomocí ibrutinibu

Brutonova tyrosinkináza (Btk) byla popsána při studiu primárního imunodeficitu projevujícího se nízkou koncentrací imunoglobulinů v séru a absencí B lymfocytů v periferní krvi. Tento imunodeficit byl nazván X‑ vázaná agamaglobulinemie (XLA) u lidí a X‑ vázaná imunodeficience u myší s mutací v genu Btk [44]. Btk je k BCR signalosomu připojena v závislosti na aktivitě PI3K a má esenciální funkce v aktivaci PLCγ2, která produkuje DAG, IP3 a umožňuje vyplavení kalcia (obr. 1). Btk je také zapojena do mnoha dalších interakcí B lymfocytů v mikroprostředí [21,22,45,46]. Terapeutický potenciál Btk inhibitoru byl poprvé odhalen při studiu agresivních buněk ABC subtypu DLBCL, kde byla prokázána jejich vysoká dependence na BCR dráze [47].

Ibrutinib (PCI‑ 32765) je orální ireverzibilní inhibitor fosforylace a enzymatické aktivity Btk, který kromě BCR signalizace inhibuje stromatem a cytokiny mediovanou protekci před apoptózou [48– 50]. První studie fáze I testovala ibrutinib (výrobce Pharmacyclics) u 50 pacientů s relabovaným a refrakterním B buněčným lymfomem, kde popsala klinickou odpověď u 60 % pacientů [51]. Zároveň byl v této studii využit sofistikovaný přístup s fluorescenčně značenou próbou vázající se na Btk, který umožnil sledování vlivu dávky ibrutinibu na jeho vazbu ke kináze. Pomocí tohoto přístupu bylo popsáno, že 420 mg 1krát denně je dostatečnou dávkou k inhibici více než 90 % aktivity Btk [51]. Do navazující studie fáze Ib/ II u CLL [29] bylo zatím zařazeno 116 pacientů, kteří jsou rozděleni do tří kohort na základě agresivity onemocnění: (i) dosud neléčení pacienti nad 65 let, (ii) relabující a refrakterní pacienti a (iii) pacienti s vysokým rizikem, u nichž došlo k progresi choroby po léčbě do 24 měsíců a/ nebo mají del17p (delece 17p zahrnující tumor‑ supresor p53 je nejagresivnějším subtypem CLL s mediánem přežití cca tři roky). U těchto kohort jsou testovány dávky 420 a 840 mg/ denně. Doposud zveřejněné výsledky jsou bezprecedentní, neboť bez ohledu na nepříznivé prognostické faktory dosahuje tato léčba vysokého procenta klinických odpovědí (> 80 %) a u pacientů navozuje dlouhotrvající remisi (tab. 1, obr. 2 A). Předpokládaný čas bez progrese po 22 měsících sledování je u relabovaných/ refrakterních pacientů 76 % (n = 85) a u nepředléčených pacientů 96 % (n = 31), viz obr. 2 B, C. Podobně předpokládané přežití po 22 měsících je u relabovaných/ refrakterních pacientů 85 % (n = 85) a u nepředléčených pacientů 96 % (n = 31). Hlavním nežádoucím účinkem léčby (stupeň ≤ 2) je diarea (54 %), fatigue (29 %), infekce horních cest dýchacích (29 %), rash (28 %), nausea (26 %) a atralgie (25 %). Hematologická toxicita stupně ≥ 3 je relativně vzácná (< 10 %) a nevykazuje známky kumulativní toxicity. Je zajímavé, že přes známý vliv absence funkčního Btk na vznik agamaglobulinemie k tomuto u CLL pacientů nedochází a léčba způsobuje spíše vyšší hladiny IgA a nemá efekt na plazmatické hladiny IgG/ IgM [29]. Podobně jako u GS‑ 1101 je ibrutinib nyní testován v kombinaci s rituximabem [43] a pro účely registrace FDA porovnáván s léčbou chlorambucilem.

Ibrutinib se také ukázal dobře účinným u lymfomu z plášťových buněk, který je obecně obtížně léčitelný a se špatnou prognózou [52]. V této studii byl ibrutinib podán 48 pacientům, z nichž 19 mělo za sebou léčbu bortezomibem. Pacienti ve studii byli všichni starší 60 let (medián 67 let), s mediánem počtu předešlých terapií 2 (1– 5). Terapeutické odpovědi dle IWG kritérií bylo dosaženo u 67 % pacientů (58 % u bortezomib‑ nepředléčených a 75 % u bortezomib‑ předléčených). Nejčastějším nežádoucím efektem byla stejně jako u CLL diarea a léčba byla prakticky bez známek myelotoxicity [52].

Zajímavých výsledků bylo také dosaženo při podání ibrutinibu pacientům s DLBCL, kteří byli rozděleni pro hodnocení účinnosti na prognosticky nepříznivý subtyp ABC (activated B cell, n = 29) a prognosticky příznivý subtyp GC (germinal center, n = 20) [53]. Autoři studie předpokládali, že na rozdíl od klasické terapie můžeme u pacientů s ABC očekávat lepší terapeutickou odpověď, neboť byla popsána „závislost“ těchto buněk na BCR dráze a četné mutace v CD79a/ b, které ji konstitutivně aktivují. Tato hypotéza se potvrdila a u subtypu ABC dosáhlo klinické odpovědi 40 % pacientů ve srovnání s 5 % u subtypu GC. Subtyp ABC byl vůči ibrutinibu responsivní bez ohledu na přítomnost (60 % pacientů) či absenci mutace v CD79b [53]. Tyto výsledky naznačují potenciál ibrutinibu v léčbě u agresivního DLBCL a již jsou testovány možnosti synergie s mTOR inhibitory.

Závěr

Intenzivní výzkum molekulární patogeneze B buněčných lymfomů umožnil odhalení dependence ně­kte­rých těchto onemocnění či subtypů onemocnění na aktivaci BCR signalizace. Klinické testování molekul, které inhibují BCR‑ asociované kinázy, prokázalo, že je možné toto využít k účinné cílené léčbě CLL a ně­kte­rých lymfomů. Obrovskou výhodou těchto „BCR inhibitorů“ je jejich minimální myelotoxicita, orální aplikace, dobrý efekt i u onemocnění refrakterního na cytostatika (např. pacienti s aberací p53 u CLL, ABC subtyp DLBCL) a potenciál ke kombinaci s monoklonálními protilátkami, jejichž účinek potencují. Zůstává otázkou, do jaké míry jsou efekty „BCR inhibitorů“ kombinací jejich vlivu na další důležité dráhy, v nichž jsou cílové kinázy zapojeny (především mi­grace a adheze). Lepší pochopení mechanizmu účinku je nezbytné pro jejich případné vzájemné kombinace a odhalení molekulárních mechanizmů rezistence. V případě CLL se zdá, že léčba ibrutinibem či GS‑ 1101 bude ve velmi blízké době schválena americkou F. D. A. (Federal Drug Agency) a stane se standardním režimem u tohoto onemocnění.

Podíl autorů na rukopisu

Marek Mráz sepsal rukopis. Všichni autoři revidovali rukopis a přispěli k diskuzi nad relevancí publikovaných studií. Marek Mráz děkuje za diskuzi nad tématem Dr. T. J. Kippsovi a Dr. M. Choiovi (University of California, San Diego).

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR č. NT11218-6/2010 a Grantovou agenturou ČR.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

MUDr. Mgr. Marek Mráz, Ph.D.

Moores Cancer Center, University of California-San Diego

3855 Health Sciences Dr. #0820

La Jolla, CA, 92093, USA

e-mail: marek.mraz@email.cz

Obdrženo: 16. 1. 2013

Přijato: 24. 3. 2013