Molekulární patologie kolorektálního karcinomu, mikrosatelitová nestabilita – způsob detekce, vztah k patofyziologii a prognóze

Česká verzia English info

Molecular Pathology of Colorectal Cancer, Microsatellite Instability – the Detection, the Relationship to the Pathophysiology and Prognosis

Background:
Colorectal carcinoma (CRC) is third most common cancer worldwide with very heterogenous character. In most cases, it is caused by sporadic events leading to disruption of epithelial cells of the colon. The minority evolves from germline mutations associated with hereditary cancer syndromes. Mechanisms leading to mutations of oncogenes, tumour suppressors and genes of DNA repair mechanisms include: 1. chromosomal instability, 2. microsatellite instability and 3. CpG island methylator phenotype. Microsatellite instability (MSI) usually arises from a germline mutation of the component of mismatch repair machinery (MMR) or somatic hypermethylation of the MLH1 promoter. The diagnostic approaches include PCR methods and immunohistochemistry for the detection of the loss of MMR part. The aim of our study was to characterise the cohort of ongoing study of gut microbiome in CRC patients considering MSI.

Material and Methods:
The consecutive study group consisted of 103 patients diagnosed with CRC. The cohort consisted of 45 women (43.7%) and 58 men (56.3%). Patient age at the time of diagnosis was within the range of 31–83 years (median 66 years). The expression of MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2 proteins was detected by immunohistochemical method and the positivity was correlated with the stage and the localization of the primary tumour.

Results:
The MMR status was determined by immunohistochemical method in 43 (41.7%) from the existing total of 103 patients. MSI was detected in 11 (25.6%) cases while 32 (74.4%) were microsatellite stabile. With the respect to cancer clasification the most cases of MSI was detected in stage II (8 cases; 22.2%). In regard to localization of primary tumour, MSI rather correlates to right site CRC, while microsatellite stable tumours do not show any site preferences.

Conclusion:
Considering low number of MMR status determination in study group, statistic evaluation is inaccurate so far. However there is a trend in our cohort in relation to determination of the portion of MSI in CRC population and also in localization of primary tumour according to literature.

Key words:
colorectal carcinoma – microsatellite instability – Lynch syndrome

The work was supported by the project MEYS – NPS I – LO1413 and AZV 16-31966A.

The authors declare they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Submitted:
13. 3. 2017

Accepted:
26. 3. 2017

Autoři: V. Brychtová ¹; R. Šefr ²; R. Hrstka ¹; P. Vídeňská ³; B. Bencsiková ¹; B. Hanáková ¹; L. Zdražilová Dubská ¹; R. Nenutil ¹; E. Budinská ¹
Působiště autorů: RECAMO, Masarykův onkologický ústav, Brno ¹; Klinika operační onkologie, Masarykův onkologický ústav, Brno ²; Centrum pro výzkum toxických látek v prostředí, PřF MU, Brno ³
Vyšlo v časopise: Klin Onkol 2017; 30(Supplementum1): 153-155
Kategorie: Article

Souhrn

Východiska:
Kolorektální karcinom (CRC) je v populaci třetí nejčastější nádorové onemocnění, které má velmi heterogenní charakter. Většina případů se rozvíjí v důsledku sporadických událostí, ale menší část vzniká na základě zárodečných mutací asociovaných s hereditárními nádorovými syndromy. Mechanizmy vedoucí k mutacím onkogenů, nádorových supresorů a genů, které se účastní opravy DNA, zahrnují: 1. chromozomální nestabilitu, 2. mikrosatelitovou nestabilitu a 3. metylační fenotyp CpG ostrůvků. Mikrosatelitová nestabilita (MSI) vzniká nejčastěji v důsledku zárodečné mutace složky systému opravujícího nesprávně spárované báze (MMR) nebo somatické hypermetylace MLH1 promotoru. Diagnostické přístupy zahrnují metody jako je PCR a imunohistochemie pro detekci ztráty složky MMR. Cílem naší práce bylo charakterizovat soubor probíhající studie střevního mikrobiomu u CRC z pohledu MSI.

Materiál a metody:
Pro studii byl vybrán konsekutivní soubor 103 pacientů s diagnózou CRC. Studijní skupina zahrnovala 45 žen (43,7 %) a 58 mužů (56,3 %). Věk pacientů v době diagnózy se pohyboval v rozmezí 31–83 let (medián 66 let). Exprese proteinů MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2 byla stanovena imunohistochemicky a případná pozitivita byla korelována se stadiem onemocnění a lokalizací primárního tumoru.

Výsledky:
Z celkového počtu 103 pacientů doposud zahrnutých do studie byl MMR status imunohistochemicky stanoven u 43 pacientů (41,7 %). Z tohoto počtu byla MSI stanovena u 11 případů (25,6 %), zatímco 32 případů (74,4 %) bylo mikrosatelitově stabilní. Vzhledem ke klasifikaci stadia onemocnění bylo nejvíce případů MSI pozorováno u stadia II (8 případů; 22,2 %). Ve vztahu k lokalizaci koreluje MSI spíše s pravostranným výskytem primárního nádoru, zatímco mikrosatelitově stabilní nádory nevykazují stranovou preferenci.

Závěr:
Vzhledem k nízkému počtu stanovení MMR statutu ve studijní skupině je prozatím statistické zhodnocení nepřesné. V našem souboru však lze pozorovat trend ve vztahu k procentuálnímu výskytu MSI v populaci pacientů s CRC i v lokalizaci primárního nádoru souhlasně s literaturou.

Klíčová slova:
kolorektální karcinom – mikrosatelitová nestabilita – Lynchův syndrom

Úvod

Kolorektální karcinom (colorectal cancer – CRC) je velmi heterogenní onemocnění zahrnující sporadickou, hereditární a familiární formu.

Patologie signálních drah u CRC

Vznik CRC podléhá vícestupňovému modelu kancerogenze, který byl poprvé navržen v roce 1990 Fearonem a Vogelsteinem [1]. Většina případů CRC se vyvíjí jako následek sporadické genomické události, která má za příčinu narušení normální funkce epitelových buněk tlustého střeva. Genomická nestabilita může vzniknout jako důsledek tří odlišných situací: 1. chromozomální nestability, 2. mikrosatelitové nestability nebo 3. hypermetylace CpG ostrůvků označované jako metylační fenotyp CpG ostrůvků. U CRC bývají nejčastěji postiženy důležité signální dráhy jako WNT, MAPK/PI3K, TGF-β, TP53 a mutované geny jako c-MYC, KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN, SMAD2 a SMAD4, které slouží jako prediktivní markery [2].

Mikrosatelitová nestabilita

Mikrosatelitová nestabilita (MSI) se vyskytuje přibližně u 15 % případů CRC [3]. Ke genetické nestabilitě dochází při ztrátě funkce MMR proteinů, která vede k akumulaci chyb v oblastech mikrosatelitů. Systém opravy nesprávně párovaných bází má zásadní význam při opravě špatných sekvencí DNA vzniklých v průběhu replikace. Tento reparační mechanizmus zahrnuje funkci proteinů MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1 a PMS2, které jako funkční heterodimery spolupracují při detekci a vystřižení nesprávných párů bází [4,5]. Zásadní roli pro funkčnost MMR systému mají komplexy MSH2-MSH6 a MLH1-PMS2. K MSI dochází při defektu jednoho ze čtyř zmíněných proteinů. MSI je u většiny případů vyvolána inaktivací genu kódujícího proteiny MLH1 nebo MSH2 a v menší míře genů kódujících proteiny MSH6 nebo PMS2 [6].

Vzhledem k tomu, že se mikrosatelitové sekvence nachází i v oblastech promotorů a exonů genů, MSI může vést i k posunu čtecího rámce a tím pádem nefunkčním produktům. Jedná se o geny, které často kódují regulátory proliferace, apoptózy a proteiny účastnící se reparace DNA [3,5–8].

Diagnóza MSI a prognostický význam

Nádorové buňky CRC s MSI se liší od nádorových buněk se stabilními mikrosatelity (MSS). Tyto buňky mají tendenci být diploidní s menší mírou LOH [9]. V nádorových buňkách s MSI bývají zasaženy podobné cíle a signální dráhy jako u nádorů s MSS, avšak ovlivněny jsou odlišné proteiny těchto drah [3].

Pro stanovení diagnózy CRC s MSI se používají vybrané panely pro MSI testování, přičemž konsenzus pro testování stability mikrosatelitů zahrnuje dva mononukleotidové (BAT25/26) a tři dinukleotidové mikrosatelity (D2S123, D5S345 a D17S250) metodou PCR [3]. Alternativně se využívá imunohistochemická detekce MMR proteinů (MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2) ve vzorcích nádorové tkáně, přičemž obě metody se mohou doplňovat [10].

Na základě tohoto testování se rozlišuje MSI-high (MSI-H), u kterého je > 30 % markerů mikrosatelitů mutováno (definováno Bethesda kritérii) a MSI-low (MSI-L) mutovaného u alespoň jednoho a současně < 30 % markerů.

Detekce MSI u pacientů s CRC je považováno (obzvlášť u mladších pacientů) za pozitivní prognostický faktor vzhledem k tomu, že tito pacienti mají výrazně delší dobu přežití a nižší úmrtnost než pacienti bez MSI [3]. Současně může tato skupina pacientů odlišně odpovídat na léčbu 5-fluorouracilem [3].

Podstatou testování MSI u CRC pacientů je identifikace pacientů s Lynchovým syndromem.

Fenotyp CRC s MSI

Včasné stanovení MSI fenotypu je významné z hlediska nastavení léčby. Pacienti s MSI pozitivním CRC mají charakteristické klinické i patologické rysy. Pro tuto skupinu pacientů je typická predominance proximální části tlustého střeva v lokalizaci nádoru, nízká diferenciace a histologicky mucinózní charakter nádoru, zvýšený počet infiltrujících lymfocytů a diploidní obsah DNA [3]. Nejčastěji se jedná o stadium II s nízkým výskytem metastatického onemocnění [11].

Materiál

Studijní skupina zahrnuje 103 pacientů s diagnózou CRC (stadium I–IV), kteří podstoupili chirurgický zákrok v Masarykově onkologickém ústavu v letech 2015–2017. Konsekutivní soubor se skládal ze 45 žen (43,7 %) a 58 mužů (56,3 %). Věk pacientů v době diagnózy se pohyboval v rozmezí 31–83 let (medián 66 let). Data byla anonymizována a zpracována podle platné legislativy ČR.

Metody

Stanovení MSI u CRC vzorků

MMR proteiny byly imunohistochemicky stanoveny v řezech nádorové tkáně fixo-vané ve formaldehydu. Detekován byl protein MLH1 pomocí protilátky EF05 (Dako; ředění 1: 200), MSH2 protilátkou FE11 (Dako; 1: 200), MSH6 protilátkou EP49 (Dako; 1: 800) a PMS2 pro-tilátkou EP51 (Dako; 1: 800). Hodno-cení bylo vztaženo k vnitřní pozitivní kontrole (normální epitelie, stromální lymfocyty). Pro hodnocení imunohistochemie bylo stanoveny dvě kategorie – pozitivní/negativní.

Statistické hodnocení kohorty

MSI status byl korelován s lokalizací primárního nádoru a stadiem onemocnění.

Výsledky

Z celkového počtu 103 pacientů doposud zahrnutých do studie byl MMR status imunohistochemicky stanoven u 43 pacientů (41,7 %). Z tohoto počtu byla MSI stanovena u 11 případů (25,6 %) zatímco 32 případů (74,4 %) bylo mikrosatelitově stabilních. Vzhledem ke klasifikaci stadia onemocnění bylo nejvíce případů MSI pozorováno u stadia II (8 případů; 22, 2 %). Ve vztahu k lokalizaci koreluje MSI spíše s pravostranným výskytem primárního nádoru, zatímco u mikrosatelitově stabilní nádory nevykazují stranovou preferenci.

Závěr

Vzhledem k nízkému počtu stanovení MMR statutu ve studijní skupině je prozatím statistické zhodnocení nepřesné. V našem souboru však lze pozorovat trend ve vztahu k procentuálnímu výskytu MSI v populaci pacientů s CRC i v lokalizaci primárního nádoru souhlasně s literaturou.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413 a AZV 16-31966A.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Veronika Brychtová, Ph.D.

RECAMO

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: vebrychtova@mou.cz

Obdrženo: 13. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017

Zdroje

1. Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 1990; 61 (5): 759–767.

2. Mármol I, Sánchez-De-Diego C, Pradilla Dieste A et al. Colorectal carcinoma: a general overview and future perspectives in colorectal cancer. Int J Mol Sci 2017; 18 (1): 197. doi: 10.3390/ijms18010197.

3. Boland CR, Goel A. Microsatellite instability in colorectal cancer. Gastroenterology 2010; 138 (6): 2073–2087. doi: 10.1053/j.gastro.2009.12.064.

4. Gelsomino F, Barbolini M, Spallanzani A et al. The evolving role of microsatellite instability in colorectal cancer: a review. Cancer Treat Rev 2016; 51: 19–26. doi: 10.1016/j.ctrv.2016.10.005.

5. Kanthan R, Senger Kanthan SC. Molecular events in primary and metastatic colorectal carcinoma: a review. Patholog Res Int 2012; 2012: 597497.

6. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000; 100 (1): 57–70.

7. Zoratto F, Rossi L, Verrico M. Focus on genetic and epigenetic events of colorectal cancer pathogenesis: implications for molecular diagnosis. Tumor Biol 2014; 35 (7): 6195–6206. doi: 10.1007/s13277-014-1845-9.

8. Walker KK, Levine AJ. Identification of a novel p53 functional domain that is necessary for efficient growth suppression. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93 (26): 15335–15340.

9. Markowitz S, Wang J, Myeroff L et al. Inactivation of the type II TGF-beta receptor in colon cancer cells with microsatellite instability. Science 1995; 268 (5215): 1336–1338.

10. Kawakami H, Zaanan A, Sinicrope F. Microsatellite instability testing and its role in the management of colorectal cancer. Curr Treat Options Oncol 2015; 16 (7): 30. doi: 10.1007/s11864-015-0348-2.

11. Roth AD, Tejpar S, Delorenzi M et al. Prognostic role of KRAS and BRAF in stage II and III resected colon cancer: results of the translational study on the PETACC-3, EORTC 40993, SAKK 60-00 trial. J Clin Oncol 2010; 28 (3): 466–474. doi: 10.1200/JCO.2009.23.3452.