Metylácia vybraných tumor-supresorických génov v benígnych a malígnych ovariálnych nádoroch

Súhrn

Cieľ štúdie:
Zhodnotenie využiteľnosti vyšetrovania metylačného stavu vybraných tumor-supresorických génov vo včasnej diagnostike ovariálneho karcinómu.

Typ štúdie:
Prospektívna klinická štúdia.

Názov a sídlo pracoviska:
Gynekologicko-pôrodnícka klinika, Ústav molekulovej biológie, Jesseniova lekárska fakulta, Univerzita Komenského, Martin, Slovenská republika.

Metodika:
V tejto štúdii bola analyzovaná hypermetylácia 5 génov RASSF1A, GSTP, E-kadherín, p16 a APC vo vzorkch ovariálnych tkanív od 34 pacientok – od 13 pacientok s epiteliálnym karcinómom ovárií, od 2 pacientok s border-line tumorom ovária, od 12 pacientok s benígnymi ovariálnymi léziami a od 7 pacientok so zdravým ovariálnym tkanivom. Metylačný stav promotorových oblastí tumor-supresorických génov bol stanovený na základe metylačne špecifickej polymerázovej reťazovej reakcie s využitím dvojkrokového prístupu s bisulfidovou modifikáciou DNA a špecifickými primermi.

Výsledky:
Analýza metylácie génov odhalila hypermetyláciu génu RASSF1A (46%) a GSTP (8%) len vo vzorkách malígnych ovariálnych tkanív. Gény E-cad, p16 a APC boli metylované v malígnych aj benígnych tkanivových vzorkách. Metylácia vyšetrovaných génov bola prítomná nezávisle od klinického štádia a od gradingu tumorov. Bol pozorovaný trend zvýšeného počtu a selektívnej prítomnosti metylovaných génov so stúpajúcim štádiom ochorenia. Nebola zaznamenaná asociácia medzi pozitivitou metylácie a histologickými subtypmi ovariálneho karcinómu.

Záver:
Metylácia RASSF1A a GSTP je asociovaná s ovariálnym karcinómom. Odhalená génovo-selektívna pozitivita metylácie a zvyšujúce sa množstvo metylovaných génov so stúpajúcim štádiom ochorenia by mohli byť užitočným molekulárnym markerom pre včasnú detekciu ovariálneho karcinómu. Stále je však potrebné pátrať po ďalších špecificky a frekventne metylovaných génoch, determinujúcich metylačný fenotyp pre včasnú diagnostiku ovariálnych malignít.

Kľúčové slová:
ovariálny karcinóm, DNA metylácia, včasná diagnostika.

ÚVOD

Ovariálny karcinóm je závažné ochorenie s vyskokou mortalitou, ktorá je z veľkej časti spôsobená jeho neskorým záchytom v pokročilom štádiu, kedy je 5-ročné prežívanie pacientiek len okolo 30 %. Skoršia diagnostika ochorenia v štádiu I–II by mohla zvýšiť prežívanie pacientiek v niektorých prípadoch až na 80–90 % [1]. Súčasný skríning ovariálneho karcinómu, pozostávajúci z ultrasonografie a vyšetrenia sérovej hladiny tumormarkerov však nie je dostatočne efektívny v detekcii včasných štádií tohto ochorenia, preto aj napriek pokrokom v liečbe počas posledných 30 rokov mortalita ovariálnych malignít neklesla [2].

Jednou z novo sa otvárajúcich možností včasnej diagnostiky malígnych ochorení je detekcia metylácie DNA. DNA hypermetylácia je kovalentná chemická modifikácia, ktorá spočíva v pripojení metylovej skupiny na piaty uhlík v cytozínovom kruhu. Je to fyziologický proces, založený už vo včasných štádiách embryogenézy a veľmi precízne kontrolovaný. Jeho úlohou je udržiavať určité všeobecné vlastnosti vo všetkých bunkách a vytvárať špecifické vlastnosti v bunkách rôznych tkanív a orgánov. Metylácia DNA je realizovaná prostredníctvom DNA metyltransferáz, ktorých aktivita v dospelosti prudko klesá, väčšina genómu je teda za fyziologických okolnosti v nemetylovanom stave [3].

Nadmerná metylácia promotorových oblastí génov vedie spolu s deacetyláciou histónov k potlačeniu ich expresie [4]. Metylácii podliehajú gény, zapojené do regulácie bunkového cyklu, diferenciácie, reparácie DNA, apoptózy, detoxifikácie, angiogenézy, adhezivity buniek a metastazovania, ale aj rezistencie na chemoterapiu. Hypermetylácia génov patrí ku včasným udalostiam v procese karcinogenézy a je detekovateľná nielen v postihnutých tkanivách, ale aj rôznych telesných tekutinách [24]. Vďaka týmto vlastnostiam by mohla byť vhodným markerom pre včasnú diagnostiku malignít. Jej využitie je možné aj v predikcii prognózy ochorenia a odpovede na liečbu, a dokonca i v liečbe samotnej, keďže metylácia génov je reverzibilný proces, ktorý je možné ovplyvniť pomocou demetylačných činidiel (inhibítory DNA metyltransferáz a histónových deacetyláz) [6, 7].

Kým niektoré gény sa vyskytujú v hypermetylovanom stave u viacerých malignít, iné sú špecifické len pre určitý typ zhubných nádorov [5]. Pri ovariálnom karcinóme nebol dosiaľ objavený jeden univerzálny gén, potvrdzujúci jeho ochorenia. Doterajšie štúdie ukazujú, že bude potrebné zostaviť tzv. metylačný fenotyp, pozostávajúci zo skupiny génov, ktoré sa vyskytujú pri ovariálnom karcinóme s najvyššou frekvenciou [11]. Keďže takúto skupinu génov sa pri ovariálnom karcinóme zatiaľ nepodarilo zostaviť, alternatívou je tzv. metylačný index. Index je založený na celkovom počte metylovaných génov u pacienta s nádorovým ochorením. Čím je vyšší, tým je vyššie riziko prítomnosti malígneho nádoru a jeho nepriaznivej prognózy. U invazívnych ovariálnych lézií je metylačný index signifikantne vyšší ako u neinvazívnych tumorov [26].

Cieľom tejto štúdie je zistiť súvislosť metylácie vyšetrovanej skupiny tumor-supresorických génov s etiopatogenézou ovariálneho karcinómu a posúdiť eventuálnu využiteľnosť tohoto vyšetrenia vo včasnej diagnostike ochorenia. 

METODIKA

Do štúdie bolo zapojených 34 pacientiek, u ktorých bola na základe palpačného a ultrasonografického vyšetrenia zistená prítomnosť ovariálneho tumoru a nebolo u nich potvrdené iné malígne ochorenie. Všetky pacientky sa podrobili operačnej liečbe. Z čerstvého nefixovaného tkaniva nádoru bola odobratá vzorka 3x3 mm, ktorá bola následne zaliata fyziologickým roztokom a v chladiacom boxe transportovaná do ústavu molekulovej biológie, kde prebiehalo jej ďalšie spracovanie.

Izolácia DNA

Do nádobky, obsahujúcej ovariálne tkanivo, bolo pridaných 300 μl jadrá rozkladajúceho roztoku a 20 μl proteinkinázy. Nasledovala inkubácia pri 56 °C až do rozrušenia tkaniva. Do nukleárneho lyzátu bolo pridaných 100 μl proteín precipitačného roztoku a po 15 sekundách sa vytvorili skupinky bielkovín, ktoré boli potom centrifugované 3 minúty. Centrifugát bol transferovaný do čistých 1,5 ml mikrocentrifugačných túb, obsahujúcich 300 μl izopropanolu izbovej teploty. Po jemnom premiešaní roztoku sa vytvorili biele prúžky DNA. Nasledovala centrifugácia pri 14 000 rpm 1 minútu pri izbovej teplote. Po odstránení supernatantu bol do DNA pridaný 70% etanol izbovej teploty a skúmavka bola jemne premiešaná, aby sa očistili čiastočky DNA. Pokračovalo sa v centrifugovaní pri 14 000 rpm 1 minútu pri izbovej teplote. Potom bol etanol opatrne aspirovaný pipetovou špičkou. Čiastočky DNA sa nechali vysušiť 10–15 minút a znovu rozpustili v 20–50 μl TE. DNA bola uskladnená pri 2–8 °C.

Bisulfidová modifikácia

Bisulfidová modifikácia nemetylovaného cytozínu vo vzorkách genomickej DNA, vedúca k jeho konverzii na uracil, bola realizovaná pomocou CpGenom DNA modifikačného kitu (Millipore, USA) podľa protokolu výrobcu. 1 μg genomickej DNA, rozpustenej v 100 μl vody, bol denaturovaný pomocou 7,0 μl of 3 M NaOH a inkubovaný cez noc. DNA bola potom naviazaná na 5 μl mikročiastkový nosič v prítomnosti 750 μl Reagens II, zodpovedného za desulfonáciu. Modifikovaná DNA bola získaná opakovaným premytím 70% etanolom a nasledujúcou centrifugáciou. DNA bola nakoniec odlúčená od nosiča zohriatím v 25 μl TE nárazníka, rozdelená po 5 μl a uskladnená pri -20 °C.

Metylačne špecifická PCR

Metylačný stav promotorových oblastí génov GSTP1, Ecad, APC, p16 a RASSF1A bol determinovaný prostredníctvom MSP. Polymerázová reťazová reakcia (polymerase chain reaction – PCR) bola realizovaná s 1,0 μl bisulfidovo modifikovanej vzorky DNA v 25 μl reagenčnej zmesi, obsahujúcej 2,5 mmol/l MgCl₂, 10 pmol/l dopredu idúceho a reverzného primeru, 0,5 mmol/l každého zo štyroch dNTPáz, 2,5 μl 10x PCR nárazníka (ABgene, United Kingdom) a jednu jednotku Thermostart Taq polymerázy (ABgene, United Kingdom). Sekvencie primerov ukazuje tabuľka 1. Prvý krok PCR bol realizovaný pomocou externých primerov, viažúcich sa na metylovanú aj nemetylovanú DNA. PCR produkty z prvého kroku boli rozriedené 1:500 a nasledovala druhá PCR s primermi, viažúcimi sa na metylovanú DNA. Teplota PCR reakcie stúpala na 95 °C počas 5 minút, nasledovalo 35 cyklov denaturácie pri 95 °C 30 sekúnd, annealing pri 56 °C 30 sekúnd, extenzia pri 72 °C 30 sekúnd a ako posledný krok 4 minúty pri 72 °C. Druhý krok PCR bol realizovaný identicky okrem annealingovej teploty, ktorá bola v rozmedzí 58–62 °C, a počtu cyklov 25–30. Pre každý set bisulfidovej modifikácie a PCR bola použitá pozitívna a negatívna kontrola pre metylovanú a nemetylovanú DNA – CpGenome Universal Methylated DNA (Millipore, USA) and CpGenome Unmethylated DNA (Millipore, USA). Voda bez vzorky DNA bola použitá ako kontrola možnej kontaminácie. 12 μl každej PCR reakcie bolo naložených na 1,75% agarózový gél, nasledovalo farbenie ethidium bromidom a vizualizácia výsledkov prostredníctvom UV iluminátora. 100 bp rebrík (Fermentas, Germany) bol použitý ako štandard molekulárnej hmotnosti. 

VÝSLEDKY

Do štúdie bolo zaradených 34 pacientok vo vekovom rozmedzí 34 až 78 rokov, ktoré podpísali informovaný súhlas so zaradením do štúdie. Vekové rozloženie pacientok v jednotlivých sledovaných skupinách zobrazuje tabuľka 2. Priebeh štúdie bol odsúhlasený Etickou komisiou UK v Martine.

Typ nádoru bol určený na základe histologického vyšetrenia. U 13 pacientok bol diagnostikovaný ovariálny karcinóm, u 2 border-line tumor ovária, 12 žien malo benígnu ovariálnu léziu a 7 ovariálnych tkanív bolo od zdravých žien. Výsledky vyšetrenia metylácie promotorov génov RASSF1A, GSTP, Ecad, p16 a APC zobrazuje tabuľka 3.

Gény RASSF1A a GSTP boli metylované výlučne vo vzorkách ovariálnych karcinómov, kým gény Ecad, p16 a APC sa nachádzali v metylovanom stave aj u border-line a benígnych tumorov ovárií. Najvyššia frekvencia metylácie v skupine malígnych nádorov bola zistená u génov RASSF1A, p16 a APC. U border-line tumorov ovárií boli hypermetylované gény Ecad a APC. 69 % malígnych vzoriek malo metylovaný aspoň 1 gén, 31 % 2 a viac génov a 8 % malo metylovaných všetkých 5 génov. Border-line tumory mali metylovaný aspoň 1 gén v 50 %. U benígnych a zdravých ovariálnych tkanív bola detekovaná metylácia najviac 2 génov a 42 % z nich nemalo metylovaný ani jeden z vyšetrovaných génov.

Medzi vyšetrenými vzorkami nebol pozorovaný signifikantný rozdiel v metylácii génov v závislosti od histologického subtypu nádoru. Z 13 malígnych ovariálnych nádorov bolo 6 seróznych (metylované gény RASSF1A, APC, p16), 2 endometroidné (metylované gény RASSF1A, p16 a Ecad), 1 nediferencovaný (metylované všetky gény) a 4 zmiešané karcinómy (tabuľka 4).

Hypermetylácia promotorov génov RASSF1A, p16 a Ecad bola detekovaná už u dobre diferencovaných tumorov (grade 1, 2), u zle diferencovaných boli metylované všetky vyšetrované gény. U génov RASSF1A, p16 a Ecad bola potvrdená metylácia už v 1. štádiu ochorenia. V štádiu 3 bola prítomná hypermetylácia všetkých vyšetrovaných génov. 

DISKUSIA

V štúdii bolo analyzovaných 34 vzoriek ovariálnych tkanív na prítomnosť hypermetylácie promotorových oblastí génov RASSF1A, GSTP, Ecad, p16 a APC.

RASSF1 gén je lokalizovaný na chromozóme 3p21.3 [14]. Ras GTPázy tvoria rodinu molekúl, regulujúcich bunkovú proliferáciu, diferenciáciu, motilitu a apoptózu na základe extracelulárnych signálov [9]. Mechanizmus účinku génu RASSF1A spočíva v asociácii s mikrotubulmi počas interfázy, čo je esenciálny krok pre inhibíciu rastu buniek [8]. Strata expresie RASSF1A je zvyčajne podmienená promotorovou hypermetyláciou. Jeho somatické mutácie nie sú bežné [12]. Metylácia RASSF1A sa vyskytuje so stredne vysokou až vysokou frekvenciou u viacerých rôznych typov malígnych tumorov (karcinóm prsníka, pľúc, prostaty, obličky, ovária) a zriedkavo sa vyskytuje v normálnych tkanivách [33]. U border-line nádorov ovárií metylácia RASSF1A koreluje s prítomnosťou mikroinvázie, peritoneálnych implantátov a s bilateralitou [13]. Frekvencia hypermetylácie stúpa so štádium ochorenia a jeho zhoršujúcou sa diferenciáciou, indikuje zlú prognózu [15]. V tejto štúdii bola potvrdená prítomnosť metylácie génu RASSF1A výlučne u malígnych ovariálnych tumorov s frekvenciou 46% bez subtypovej diferenciácie, a to už v štádiu 1 a u dobre diferencovaných nádorov. Mohol by teda byť potenciálne využiteľný vo včasnej diagnostike malígnych ovariálnych lézií.

Gén GSTP je lokalizovaný na chromozóme 11q13. Glutatión-S-transferázy katalyzujú konjugáciu glutatiónu s mnohými potenciálne genotoxickými zlúčeninami. Zabezpečujú detoxifikáciu produtov oxidačného stresu v bunkách. Sú zahrnuté do regulácie bunkovej proliferácie a apoptózy [19]. Hypermetylácia GSTP sa vyskytuje u viacerých typov malignít (typicky pri karcinóme prostaty) [29]. V prípade ovariálnych tumorov je dosiaľ popisovaná len u invazívnych lézií [20]. Takýto záver bol potvrdený aj v tejto štúdii, kde bola detekovaná jeho metylácia v 8% vyšetrených vzoriek ovariálnych karcinómov.

Gén Ecad je lokalizovaný na chromozóme 16q22.1 a patrí do rodiny kalcium dependentných bunkových adhezívnych molekúl [16]. Nachádza sa predominantne v epiteliálnych bunkách a jeho úloha spočíva v udržiavaní integrity tkanív [21]. Metylácia Ecad bola popisovaná u rôznych typov karcinómov (karcinóm žalúdka, prsníka, močového mechúra, kolorekta, ovária) [28]. Metylačné potlačenie jeho funkcie vedie ku zvýšenej invazivite a metastazovaniu [27]. U ovariálnych tumorov môže byť prítomná metylácia Ecad už u benígnych lézií a u invazívnych nádorov koreluje s ich štádiom, prítomnosťou metastáz v lymfatických uzlinách a stupňom diferenciácie [17]. Táto štúdia zistila metyláciu Ecad v 15 % vo vzorkách malígnych ovariálnych tumorov, v 50 % border-line nádorov a v 16 % benígnych lézií. V prípade vzoriek ovariálnych karcinómov bola detekovaná metylácia Ecad už v 1. štádiu a u dobre diferencovaných tumorov.

Gén p16 je tumor-supresorický gén, lokalizovaný na chromozóme 9p21 a patrí do rodiny inhibítorov cyklín-dependentných kináz [30]. Zasahuje do regulácie bunkového cyklu [31]. Strata jeho expresie je prítomná v širokom spektre tumorov a súvisí s progresiou ochorenia a zhoršením prognózy [22]. Pri ovariálnom karcinóme bola detekovaná znížená expresia p16 v 71–79 % endometroidných a mucinóznych tumorov, kým len asi v 10 % seróznych tumorov [25]. Redukcia jeho expresie je najčastejšie spôsobená metyláciou promotorovej oblasti, no môže byť aj dôsledkom mutácií, delécií či kombináciou genetických a epigenetických zmien [23]. Metylácia môže byť prítomná už u benígnych lézií [32]. V tejto štúdii bol p16 gén metylovaný v 38 % malígnych ovariálnych tumorov, a to už v 1. štádiu a u dobre diferencovaných nádorov, a v 26 % benígnych lézií.

APC gén je lokalizovaný na chromozóme 5q21-q22 [10]. Je to tumor-supresorický gén, ktorý kontroluje bunkové delenie a podmieňuje zastavenie bunkového cyklu a apoptózu. Hypermetylácia APC génu vedie k nekontrolovanému deleniu buniek a bola potvrdená u karcinómu kolorekta, pľúc, ovárií, prsníka, prostaty i u ďalších typov malignít [18]. V tejto štúdii bola detekovaná hypermetylácia APC v 23 % malígnych ovariálnych tumorov, v 50 % border-line nádorov a v 26 % benígnych lézií.  U vzoriek malígnych tkanív bola metylácia prítomná až v pokročilom štádiu ochorenia a u zle diferencovaných nádorov. 

ZÁVER

Ovariálny karcinóm zapríčiňuje viac úmrtí u žien ako ktorýkoľvek iný zhubný nádor ženského genitálu. Keďže chýbajú včasné špecifické symptómy tohto ochorenia, v prevažnej väčšine prípadov je diagnostikované až v pokročilom štádiu. Včasné štádiá ovariálneho karcinómu sa vyznačujú signifikantne lepšou prognózou, problémom však ostáva ich diagnostika. Súčasný skríning ochorenia nemá dostatočnú senzitivitu ani špecificitu a nie je teda efektívny vo vyhľadávaní skorých štádií invazívnych ovariálnych lézií. Hľadanie nových účinnejších skríningovýcn metód sa stále viac posúva na molekulárnu úroveň – genetické a epigenetické zmeny, súvisiace s etiopatogenézou ovariálneho karcinómu. Výhodou využitia detekcie DNA metylácie je jej prítomnosť v postihnutých tkanivách, ale aj v telesných tekutinách vrátane krvi, a to už vo včasnom, klinicky nemanifestnom štádiu.

V tejto štúdii bola zistená metylácia génov RASSF1A (46%) a GSTP (8%) len vo vzorkách malígnych ovariálnych tkanív a metylácia génov Ecad, p16 a APC u benígnych i malígnych tumorov ovárií. Najvyššia frekvencia metylácie vo vzorkách ovariálnych karcinómov bola pozorovaná u génov RASSF1A, p16 a APC. Hypermetylácia génov RASSF1A, p16 a Ecad bola prítomná už v 1. štádiu ochorenia a u dobre diferencovaných nádorov. Z uvedených výsledkov vyplýva, že vyšetrovanie metylácie génu RASSF1A by mohlo byť potenciálne využiteľné vo včasnej diagnostike ovariálneho karcinómu. Je však potrebné pátrať po ďalších génoch, ktoré by v kombinácii s ním vytvorili metylačný fenotyp s dostatočnou senzitivitou a špecificitou pre diagnostiku ovariálneho karcinómu prostredníctvom korelácie cez univerzálny epigenetický signál medzi nádorom a metylačnou zmenou v sére.

Táto práca bola podporená projektom „Dobudovanie Centra excelentnosti pre perinatologický výskum“, ITMS kód: 26220120036, ktorý je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ-ERDF.

Priebeh tejto štúdie bol podporovaný grantmi UK/420/2008 a UK/60/2009.

MUDr. Martina Cuľbová

Gynekologicko-pôrodnícka klinika

JLF UK a UNM

Kollárova 2

036 59 Martin

Slovensko

e-mail: culbova@jfmed.uniba.sk