Zvýšení sérových hladin S100–A11 a AIF-1 u pacientek s karcinomem hrdla děložního a postižením lymfatických uzlin

Súhrn

Cíl studie: Cílem této studie bylo porovnat sérové hladiny TFF3, AIF-1, S100–A11 a DKK1 u pacientek s karcinomem hrdla děložního a u zdravých kontrol.

Metodika: Celkem bylo zařazeno na Porodnicko-gynekologické klinice ve Fakultní nemocnici v Olomouci 85 pacientek s dia­gnózou karcinomu děložního hrdla, které podstoupily radikální hysterektomii nebo fertilitu zachovávající operaci s pánevní lymfadenektomií. Kontrolní skupinu tvořilo 90 pacientek, které podstoupily jakoukoli hysterektomii pro nemaligní onemocnění. U všech pacientek byly předoperačně odebrány a separovány vzorky séra a všechna séra byla skladována při teplotě –80 °C až do analýzy hladin TFF3, AIF-1, S100–A11 a DKK1.

Výsledky: U 32 pacientek (40,5 %) ze 79 s karcinomem hrdla děložního, u kterých byly lymfatické uzliny histologicky vyšetřeny, byly pozitivní lymfatické uzliny. Sérové hladiny S100–A11 (p < 0,0001) a AIF-1 (p < 0,0001) byly vyšší u pacientek s karcinomem hrdla děložního než u kontrol. Kromě toho byly sérové hladiny S100–A11 (p > 0,04) a AIF-1 (p > 0,01) významně vyšší u pacientek s pozitivními lymfatickými uzlinami ve srovnání s pacientkami s negativními lymfatickými uzlinami. Hladiny TFF3 a DKK1 byly vyšší (p < 0,0001) u kontrol než u pacientek s karcinomem hrdla děložního a nelišily se ve skupinách s postižením lymfatických uzlin, nebo bez něj.

Závěr: S100–A11 a AIF-1 představují potenciální bio­markery u pacientek s karcinomem hrdla děložního. V naší studii byly současně vyšší hladiny S100–A11 a AIF-1 u pacientek s přítomností metastáz v lymfatických uzlinách.

Klíčová slova:

onkogynekologie – bio­markery – karcinom hrdla děložního – S100–A11 – TFF3 – AIF-1 – DKK1

Úvod

Karcinom hrdla děložního je celosvětově čtvrtým nejčastějším zhoubným nádorem u žen [1]. Incidence v ČR v roce 2016 byla 15,3/100 000 žen, což je 822 nových případů za rok. Incidence tohoto nádorového onemocnění je v ČR tedy přibližně o 50 % vyšší než v západních evropských zemích. Mortalita v roce 2016 byla 6,28/100 00 žen, což je v absolutních číslech 384 žen. Karcinom hrdla děložního má dva věkové vrcholy výskytu, a to v 30–35 letech a 60–65 letech a je častější u sociálně a ekonomicky slabší populace. Pánevní lymfatické uzliny jsou primárními lymfatickými uzlinami u tohoto nádorového onemocnění a jejich postižení výrazně zhoršuje šance na přežití [1–3]. Dosud neexistuje možnost spolehlivé neinvazivní predikce případného metastatického postižení lymfatických uzlin u pacientek s karcinomem hrdla děložního.

Jako tumor marker označujeme chemickou substanci, která je produkována tumorem nebo hostitelem jako odpověď na přítomnost nádoru. Nachází se v krvi, moči nebo tkáních pacientů s nádorovým onemocněním, může být ale produkována i u benigních onemocnění [4]. Biomarker bývá definován jako měřitelný indikátor určitého bio­logického stavu či podmínek. V souvislosti s postižením uzlin u karcinomu hrdla děložního byl studován SCC-Ag (antigen skvamocelulárního karcinomu), CA125, CEA (karcinoembryonální antigen), CA19-9 a CYFRA-21 [5–9].

Studované bio­markery

Trefoil faktor 3 (TFF3) je protein, který byl v roce 1991 objeven u krys [10]. Trifoláty jsou skupinou malých polypeptidů bohatých na cystein, jsou exprimovány ve tkáních, které obsahují buňky produkující hlen, obzvláště v gastrointestinálním traktu a v jiných epiteliálních tkáních. V roce 1989 byly pojmenovány Thimem jako „trefoil“ peptidy a dosud byly identifikovány tři: TFF1, TFF2  a TFF3 [11]. Bylo prokázáno, že sérové hladiny TFF3 jsou významně vyšší u pacientek s karcinomem endometria než u pacientek s endometriální hyperplazií  a u kontrol [12].

Allograft inflammatory factor 1 (AIF-1)  je protein nacházející se v cytoplazmě buněk a byl objeven roku 1995 u krys [13]. U proteinu AIF-1 již byla prokázána zvýšená exprese u karcinomu hrdla děložního. Není ovšem známo, jak se na patogenezi tohoto onemocnění podílí [14].

Proteiny rodiny S100 mají poměrně nízkou molekulovou hmotnost a do současnosti jich bylo objeveno již 25. Většina S100 proteinů váže kalcium a je lokalizována intracelulárně. Tyto proteiny mají různé funkce, jsou zastoupeny v širokém spektru bio­logických procesů a jejich název je odvozen od vlastnosti proteinů rozpouštět se v nasyceném roztoku síranu amonného. Proteiny S100 jsou asociovány s různými nádorovými onemocněními, ačkoli ve většině případů není funkce S100 proteinů v nádorových buňkách stále známá [15]. U námi studovaného proteinu S100–A11 již byla v literatuře publikována asociace s karcinomem prsu, slinivky břišní, žaludku, močového měchýře, prostaty a ledvin. U karcinomu hrdla děložního byla prokázána asociace s hladinou proteinu S100–A9 [16].

Dickkopf-related proteins (DKK) je rodina sekrečních proteinů, které jsou celkem čtyři, a to DKK1, DKK2, DKK3, DKK4. Tyto proteiny mají molekulovou hmotnost 24–38 kDa [17]. DKK1 je protein, který je exprimován převážně osteoblasty a stromálními buňkami kostní dřeně a je u lidí kódován genem DKK1 [18]. Byl objeven roku 1998 Glinkou u drápatky vodní (Xenopus laevis) a podílí se na embryonálním vývoji prostřednictvím inhibice signální dráhy Wnt [19,20]. Tato inhibice hraje klíčovou roli při embryonálním vývoji srdce, hlavy a horních končetin [21]. Signální dráha Wnt hraje důležitou roli také v tumorogenezi, což bylo prokázáno například u kolorektálního karcinomu [18,22].

Cílem této studie bylo porovnat sérové hladiny TFF3, AIF-1, S100–  A11 a DKK1 u pacientek s karcinomem hrdla děložního a u zdravých kontrol, dále jsme porovnávali tyto sérové hladiny u pacientek s postižením a bez postižení lymfatických uzlin.

Metodika

Tato experimentální prospektivní studie probíhala od října 2012 do června 2015 na Porodnicko-gynekologické klinice Fakultní nemocnice v Olomouci. Studie byla schválena lokální etickou komisí a všechny pacientky potvrdily svou účast ve studii podpisem informovaného souhlasu. Celkem bylo do studie zařazeno 85 pacientek s karcinomem hrdla děložního, které podstoupily radikální hysterektomii nebo fertilitu zachovávající operaci s pánevní lymfadenektomií. Histopatologicky byl dia­gnostikován spinocelulární karcinom u 68 (80 %), adenokarcinom u 13 (15 %), mukoepidermoidní karcinom u 2 (2 %), adenoskvamózní karcinom u 1 (1 %) a 1 (1 %) pacientka měla dia­gnostikován clear cell karcinom. Dle klasifikace FIGO 2009 bylo 45 (53 %) pacientek v I. stadiu, 31 (36 %) ve II. stadiu, 7 (8 %) ve III. stadiu a 2 (2 %) pacientky ve IV. stadiu onemocnění. U 32 pacientek (40,5 %) ze 79 s karcinomem hrdla děložního, u kterých byly lymfatické uzliny histologicky vyšetřeny, byly metastázy v pánevních nebo paraaortálních lymfatických uzlinách. Kontrolní skupinu tvořilo 90 pacientek, které podstoupily jakoukoli hysterektomii pro nemaligní onemocnění. Ve skupině pacientek s karcinomem hrdla děložního měla nejmladší pacientka 29 let, nejstarší 83 let, medián věku byl 45 let a průměrný věk 48,1 let. Ve skupině kontrol měla nejmladší pacientka 15 let, nejstarší 77 let, medián věku byl 41 let a průměrný věk 41,6 let.

U všech pacientek byly předoperačně odebrány vzorky séra po 12 hod lačnění. Poté byly vzorky centrifugovány (1 600 × g, 10 min, +4 °C) a následně byla provedena separace séra. Dále bylo 200 µl séra rozředěno s 100 µl fosfátového pufru (15 mmol/l, pH 6,5) a dále deproteinizováno pomocí 100 µl chlazeného etanolu (10 min, –25 °C). Po další centrifugaci (14 000 × g, 10 min) byl supernatant filtrován za použití titračních filtrů a vakuován, filtrovaný roztok byl vložen do HPLC (high-performance liquid chromatography) sloupce. Všechna séra byla skladována při teplotě –80 °C až do analýzy hladin TFF3, AIF-1, S100–A11 a DKK1.

Statistické vyhodnocení dat bylo provedeno ve spolupráci s Ústavem lékařské bio­fyziky Lékařské fakulty Univerzity Palackého v Olomouci. Ke statistickému zpracování dat byl použit statistický software IBM SPSS Statistics for Windows, Version 23.0. (Armonk, NY: IBM Corp).

Korelace byly testovány Mann-Whitneyovým U-testem. Vodorovná čára v krabicovém grafu znázorňuje hodnotu mediánu, dolní hrana krabice hodnotu 1. kvartilu (25. percentilu), horní hrana hodnotu 3. kvartilu (75. percentilu). Anténky ukazují maximální a minimální naměřené hodnoty. Pokud byly v souboru nalezeny odlehlé a extrémní hodnoty, jsou zakresleny kroužky a hvězdičkami (graf 1, 2).

Výsledky

Sérové hladiny S100–A11 (p < 0,0001) a AIF-1 (p < 0,0001) byly vyšší u pacientek s karcinomem děložního hrdla než u kontrol, což je znázorněno na grafech 1 a 2. U 32 pacientek (40,5 %) ze 79 s karcinomem hrdla děložního, u kterých byly lymfatické uzliny histologicky vyšetřeny, byly pozitivní lymfatické uzliny. Sérové hladiny S100–A11 (p > 0,04) a AIF-1 (p > 0,01) byly statisticky významně vyšší u pacientek s pozitivními lymfatickými uzlinami ve srovnání s pacientkami s negativními lymfatickými uzlinami (tab. 1). Sérové hladiny S100–A11 byly ve skupině s pozitivními lymfatickými uzlinami na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 14,8 ± 13,7 ng/ml (0,9–58,1), ve skupině s negativními lymfatickými uzlinami byly 12,6 ± 17,8 ng/ml (1,4–94,4). Sérové hladiny AIF-1 byly ve skupině s pozitivními lymfatickými uzlinami na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 939,6 ± 733,5 pg/ml (167,0–3 689,0), ve skupině s negativními lymfatickými uzlinami byly 778,2 ± 991,5 pg/ml (41,1–5 242,0).

Hladiny TFF3 a DKK1 byly vyšší (p < 0,0001) u kontrol než u pacientek s karcinomem hrdla děložního a nelišily se ve skupinách s postižením lymfatických uzlin, nebo bez něj (tab. 1). Sérové hladiny TFF3 byly ve skupině s pozitivními lymfatickými uzlinami na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 2,2 ± 2,6 ng/ml (0,7–13,5), ve skupině s negativními lymfatickými uzlinami byly 1,9 ± 1,7 ng/ml (0,1–8,1). Sérové hladiny DKK1 byly ve skupině s pozitivními lymfatickými uzlinami na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 2,2 ± 1,1 ng/ml (0,5–5,4), ve skupině s negativními lymfatickými uzlinami byly 2,3 ± 1,1 ng/ml (0,1–5,5).

Spearmanovým korelačním koeficientem byla prokázána statisticky významná slabá negativní korelace mezi věkem pacientek a všemi sledovanými markery (S100–A11, AIF-1, TFF3 a DKK1). Z tohoto lze usuzovat, že se zvyšujícím se věkem produkce všech těchto proteinů klesá, a jsou tedy i nižší sérové hladiny. Věk pacientek ve skupině s pozitivními lymfatickými uzlinami byl na úrovni (průměr ± směrodatná odchylka) 46,4 ± 11,9 let (29,0–77,0), ve skupině s negativními lymfatickými uzlinami 49,3 ± 14,3 let (30,0–83,0) (tab. 1).

Diskuze

Karcinom hrdla děložního je v ČR čtvrtým nejčastějším gynekologickým nádorem po karcinomu prsu, endometria a ovaria [3]. Dokud se nepodaří zajistit celoplošnou primární prevenci tohoto onemocnění, bude nadále nutné zlepšovat sekundární prevenci formou screeningu, dia­gnostiku i follow-up již nemocných pacientek. Tak jako u jiných onkologických onemocnění jsou cen­trem zájmu nové potenciální bio­markery. Velmi rychle narůstá množství informací o nových proteinech TFF3, AIF-1, S100–A11, DKK1 a jejich fyziologickém i patofyziologickém významu.

Metastáza v lymfatických uzlinách je u pacientek s cervikálním karcinomem jedním z důležitých prognostických faktorů. Dalšími jsou stadium onemocnění, objem tumoru, stromální invaze, grading, histologický typ (špatná prognóza např. u neuroendokrinního karcinomu a clear cell karcinomu) a také poruchy imunity [2].

Sérový marker pro spinocelulární karcinom SCC-Ag je používán v klinické praxi. Je přítomen ve vysokých hladinách u 20–60 % pacientek s časným stadiem cervikálního karcinomu. Zvýšené hladiny SCC-Ag jsou přítomny u 64 % pacientek se spinocelulárním karcinomem a u 25 % pacientek s adenokarcinomem [23]. Sérová hladina SCC-Ag před léčbou je asociována s velikostí tumoru, stadiem onemocnění, hloubkou stromální invaze, invazí lymfovaskulárního prostoru i s postižením lymfatických uzlin. Se zvýšenými sérovými hladinami SCC-Ag bylo signifikantně asociováno postižení společných ilických a paraaortálních uzlin [5,6].

Dalšími používanými bio­markery u cervikálního karcinomu jsou antigen CA125, CA19–9 a CYFRA21–1 [7]. Zvýšené hladiny CA125 jsou asociovány s vyšším stadiem karcinomu hrdla děložního, a to u 42,6 % pacientek s adenokarcinomem a 18,9 % pacientek se spinocelulárním karcinomem [24]. Bylo zjištěno, že hladina CA125 je významně vyšší u pacientek s metastázami v pánevních a paraaortálních lymfatických uzlinách než u pacientek bez postižení lymfatických uzlin [25]. Bylo prokázáno, že vyšetřením sérové hladiny kombinace tumor markerů SCC-Ag, CEA a CA19–9 lze předpovědět pozitivní pánevní lymfatické uzliny a postižení parametrií u spinocelulárního karcinomu děložního hrdla [8]. Byla také prokázána korelace mezi sérovou hladinou CYFRA-21 a přítomností metastáz v lymfatických uzlinách u pacientek s karcinomem hrdla děložního [9].

Naše výsledky prokazují korelaci mezi zvýšením sérových hladin S100–A11 a AIF-1 a metastatickým postižením pánevních lymfatických uzlin, a mohou tedy být využity v predikci tohoto metastatického postižení.

Závěr

Proteiny S100–A11 a AIF-1 představují potenciální bio­markery u pacientek s karcinomem hrdla děložního. V naší studii jsme prokázali zvýšení sérové hladiny S100–A11 a AIF-1 u těchto pacientek v porovnání s kontrolní skupinou. Sérové hladiny S100–A11 a AIF-1 se dále u těchto pacientek významně zvyšují, pokud byly prokázány metastázy v lymfatických uzlinách.

Tumor markery hrají stále důležitější roli při detekci nádorových onemocnění. V současnosti užívané tumor markery u karcinomu hrdla děložního nejsou ideální, protože jim chybí silná specificita. Výzkum by se měl zaměřit na vývoj kombinačních panelů více bio­markerů, které by byly pro dia­gnostiku nejúčinnější.

Obdrženo/Submitted: 24. 11. 2020

Přijato/Accepted: 28. 12. 2020

MUDr. Martin Maděrka

Porodnicko-gynekologická klinika

LF UP a FN Olomouc

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

maderka. m@gmail.com