Co potřebuje patolog vědět o poruchách komplementového systému

Komplementový systém je velmi důležitou oblastí vrozené (tzv. nespecifické) imunity a představuje klíčovou součást první linie obrany proti infekcím. Současně komplement hraje významnou roli při odklízení apoptotických a poškozených endogenních buněk a podstatnou měrou přispívá k homeostáze organismu. Fylogeneticky jde o velmi starobylý systém, který v jednoduché formě existoval už u láčkovců před více než 500 miliony let.

Komplementový systém zahrnuje několik desítek solubilních a membránově vázaných proteinů. Solubilní proteiny komplementu jsou dominantně tvořeny v játrech, ale jejich zdrojem jsou i různé buňky mnoha orgánů (1). Jde o složitý a komplexní systém, který po aktivaci funguje jako kaskáda umožňující opsonizaci patogenů; a dále navodí sérii zánětlivých kroků, které usnadní buňkám imunitního systému potlačit infekci a znovu nastolit homeostázu.

Kaskáda reakcí komplementu je aktivovaná ihned poté, co se patogen objeví (Schéma 1). K aktivaci může dojít klasickou cestou (pokud jsme se již v minulosti s infekčním agens setkali a máme protilátky) nebo tzv. lektinovou cestou (pokud protilátky nemáme a na povrchu infekčních agens jsou molekuly cukrů, které aktivují lektin). Pokud infekční agens unikne identifikaci předchozími cestami, máme v záloze ještě tzv. alternativní cestu, která k aktivaci nepotřebuje předchozí kontakt s infekcí. Alternativní cesta představuje reakci, při které se za normálního stavu stále spontánně štěpí malé množství C3. Komponenty tohoto štěpení jsou na buněčných membránách rychle inaktivovány naší antikomplementovou ochranou. Protože mikroby tuto specifickou ochranu nemají, rozvinne se amplifikace reakce s aktivací terminální fáze komplementu, kterou je formace lytického komplexu složek C5b9/MAC (membrane attack complex, Schéma 2). Aktivace všech 3 komplementových cest vedou k C3, tj. centrální složce komplementu. Štěpení C3 je součástí tzv. efektorového systému komplementu. Tento systém umožňuje přímou lýzu v oblasti cíleného povrchu (tvorba defektu v buněčné membráně). Současně se v průběhu aktivace vytvářejí mocné prozánětlivé anafylatoxiny (C3a a C5a) a dochází k opsonizaci. Další kroky ovlivňují adaptivní imunitní odpověď, což zahrnuje spolupráci s antigen prezentujícími buňkami a Ta B-lymfocyty. Současně dojde k úklidu poškozených struktur díky aktivaci komplementových receptorů na fagocytujících buňkách (makrofázích a neutrofilech).

Terminální fází kaskády je formace lytického komplexu C5b-9/ MAC, po štěpení C6 dojde k integraci komplexu do fosfolipidové membrány (Schéma 2), kde se formují nejprve nestabilní póry a další polymerizací dojde k vytvoření stabilního otvoru (průměru 10nm). Klasická a lektinová cesta komplementu má rozhodující úlohu v rozpoznání patogenu a ve spuštění komplementové kaskády. Alternativní cesta zajišťuje více než 80 % aktivity terminální kaskády komplementu (2).

Schéma 1. Základní cesty aktivace komplementu.

Velmi zjednodušené schéma 3 hlavních kaskád komplementového systému zahrnuje aktivaci klasické cesty, která využívá protilátky. Lektinová cesta využívá molekuly cukrů na povrchu infekčních agens, aktivuje lektin, obchází C1 a pokračuje stejně jako klasická cesta. Alternativní cesta se aktivuje přes amplifikační smyčku na všech strukturách, které nemají antikomplementovou ochranu. Všechny 3 cesty aktivace komplementového systému se setkávají u aktivace C3 složky a následné tvorbě terminální lytické formace, která vede k lýze struktury, v místě, kde reakce probíhá.

Aktivace komplementu obecně je velmi pečlivě regulovaný systém, protože v efektorové funkci terminální kaskády je klíčová alternativní cesta komplementu je její regulace udržovaná pod striktní kontrolou nejen v rozpustné fázi (faktor H a I), ale také v komponentách vázaných na membrány (CD46, CD55 a CD35). Jde o systém anti-komplementové ochrany, který brání poškození vlastních tkání. Regulační proteiny inaktivují nebo podporují inaktivaci aktivních komponent, urychlují disociaci konvertáz a také potlačují spojení C9 s komplexem C5b-8, což zabraňuje terminální tvorbě MAC. Důležitou složkou inaktivace je udržení velmi krátkého času, po který jsou aktivní komponenty funkční. Proces kontroly alternativní cesty je velmi komplexní; a pokud se v regulaci systému vyskytnou problémy, dojde k rozvoji různých, často závažných onemocnění.

Vzhledem k tomu, že infekční choroby zůstávají z celosvětového pohledu stále mezi vedoucími příčinami úmrtí, obrana proti nim přírodní selekcí po tisíciletí směrovala komplement k vylepšení všech funkcí tak, aby dosahovaly maximální účinnosti. Protože fyziologická tendence k nadměrné aktivaci komplementu nabízela výhodu přežití infekčních chorob, byla preferovaná nad nízkou aktivací. Pokud si pro zjednodušení představíme komplement jako Gaussovu křivku s rovnoměrným rozložením, kde nalevo od centra je riziko infekce a nižší aktivace komplementu a napravo je vysoká aktivace komplementu s lepší šancí na přežití infekcí, tak dnes se díky přirozenému výběru většina populace posunula na pravou stranu a má tendenci k nadměrné aktivaci. Evoluce ovlivňovala nejen komplement, ale i patogenní mikroorganismy, které také během evoluce pozměňovali a pozměňují svoji strategii a vyvinuli cesty, jak se vyhnout aktivaci komplementu. Některé dokáží vytvářet komplexy s regulátory komplementu (především faktorem H) a tím se bránit aktivaci komplementu, další umí blokovat rozpoznávání povrchových molekul a Staphylococcus aureus vyvinul komplexní strategii, kterou dokáže inhibovat všechny 3 cesty aktivace komplementu (3).

Schéma 2. Formace terminální efektorové složky komplementu (MAC). MAC (tzv. membrane attack complex) představuje cytolytický koncový produkt komplementových kaskád, který vytvoří transmembránový kanál a osmotickou lýzou zničí cílovou strukturu.
Tvorba MAC je iniciována ireverzibilním proteolytickým štěpením C5 na dvě složky (C5a a C5b) C5 konvertázou. C5b poskytuje lešení pro vazbu C6, tím se z nestabilní struktury vytvoří stabilní komplex, který se může spontánně kombinovat s C7. V důsledku tohoto spojení se změní konfigurace C7, což má dále vysokou afinitu k C8. S vazbou C8 je hluboce penetrovaná membrána (sublytické poškození). V další progresi pokud není zablokovaná vazba k C9, dojde k polymeraci s vytvořením dalších 12-15 molekul C9, které jsou nejprve připojeny k sobě a po té se rozestoupí, čímž vytvoří 10nm velký otvor v membráně. Takhle velký otvor je stabilní a umožní osmotickou lýzu poškozené buňky.
V poslední době nové techniky odkrývají detailní terminální struktury formace MAC, ukazují heterogenitu MAC prekurzorů a terminálních struktur na různých typech buněk. Potvrzují, že MAC je trojvrstevná proměnlivá struktura, která má ale mnohem více biologických aktivit. Může indukovat intracelulární signalizaci a buněčnou aktivaci. Buňky aktivované MAC exprimují různé prozánětlivé proteiny, usnadňují sekreci IL18 a ovlivňují prozánětlivé signální dráhy, tím jsou zapojené do různých autoimunitních, zánětlivých a transplantačních onemocnění.

Evolučně výhodná nadměrná aktivace komplementové obrany proti infekcím na druhé straně představuje riziko setrvalých zánětlivých stimulů. Dlouhotrvající zánětlivý stav způsobuje poškození jak lokálně, tak systémově a spolupodílí se na rozvoji autoimunních onemocnění a chronických infekcí. Osoby s nadměrnou aktivací nebo s nedostatečnou kontrolou komplementu kvůli vrozeným defektům komplementových genů nebo kvůli nově vytvořeným autoprotilátkám proti regulačním proteinům, predisponují k různým onemocněním, mezi nejznámější patří SLE, C3 nefropatie, postinfekční GN, atypický hemolyticko-uremický syndrom (aHUS) a další trombotické mikroangiopatie. Ale dysbalance komplementových kaskád, které ovlivňují klinický průběh chorob, se objevují i na pozadí dalších onemocnění včetně závažných forem Covid-19 (4, 5). Poruchy komplementu na jedné straně pomohou vysvětlit, proč těžkou formu onemocnění vyvine jen někdo, na druhé straně u chorob, kde se vliv komplementu nepředpokládá, se poruchy komplementu stávají tzv. druhou diagnózou, tj. diagnózou v pozadí, která nebývá odhalena.

Onemocnění s prokázanými poruchami komplementu

Atypický hemolyticko-uremický syndrom (aHUS)

Hemolyticko-uremický syndrom (HUS) je raritní onemocnění, které je v klinice definované mikroangiopatickou hemolytickou anemií, trombocytopenií a akutním poškozením ledvin. Jde o jednu z forem tzv. trombotických mikroangiopatií (TMA), což je skupina chorob, které jsou v morfologii charakterizované tromby v mikrocirkulaci různých orgánů, nejčastěji ledvin. U dětí je HUS obvykle součástí infekce Escherichia coli produkující Shiga toxin. Asi u 5 % dětských pacientů jde o infekci kmeny Streptoccus pneumonie, které produkují neuroamidasu. Termín aHUS se používá k popisu stejného onemocnění u dětí i dospělých, kde nebyly identifikované tyto infekce. Infekční HUS má příznivější prognózu, obvykle se kolem 80 % pacientů uzdraví a udrží si funkci ledvin. V případě aHUS jde o velmi vážné onemocnění, většina pacientů vyžaduje v době diagnózy dialýzu. Před současnou léčbou, která umožňuje blokaci C5 frakce komplementu, 20 % pacientů zemřelo během akutní epizody onemocnění a více než 50 % neobnovilo funkci ledvin.

První mutace regulačního faktoru H komplementu byla popsaná v r. 1998 a dosud představuje nejčastější genetickou abnormalitu spojovanou s rozvojem aHUS (6). Někteří pacienti jsou homozygoti, ale většinově jde o heterozygotní stavy. Hladina faktoru H v séru zůstává u většiny pacientů normální, což svědčí pro to, že problém je na úrovni bazální membrány, kde se mutovaný protein nedokáže správně navázat a regulovat komplement na buněčném povrchu. Bylo také prokázáno, že tyto proteiny narušují vazbu k destičkám, které následně vykazují zvýšenou aktivaci.

U většiny pacientů předchází rozvoji onemocnění epizoda infekce, obvykle respirační, což přispívá ke komplexní klinické prezentaci, která se překrývá s infekčním HUS. Extrarenální manifestaci vyvine cca 20 % pacientů s aHUS a nejběžnější postižené lokality jsou CNS a GIT. Projevy při postižení GIT u HUS a aHUS jsou stejné a diarea typická pro HUS nevylučuje diagnózu aHUS. U případů s postižením CNS vstupuje do diferenciální diagnózy trombotická trombocytopenická purpura (TTP), což je onemocnění s nízkou aktivitou enzymu ADAMTS13, proti kterému má většina pacientů s TTP autoprotilátky. Tento enzym funguje jako nůžky, které za normálního stavu rozstříhají multimery von Wilebrantova faktoru (vWF) a uvolní síť, do které se v případě jeho nedostatečné aktivity zachytávají destičky, což je podkladem pro tvorbu mikrotrombů. Na úrovni morfologie není odlišení HUS, aHUS a TTP možné, morfologická diagnóza je TMA (Obr. 1). Většina pacientů s TMA má současně akcelerovanou nebo tzv. maligní hypertenzi a tak je diferenciální diagnostika opravdu složitá. Prvním krokem je obvykle vyloučení deficitu ADAMTS13 a vyloučení TTP. Dále jde o vyloučení toxin-produkujících bakterií a dalších existujících stavů, které jsou historicky udávané jako faktory vyskytující se u TMA (tzv. sekundární HUS). Mezi nejběžnější příčiny tzv. sekundárního HUS patří trombotické mikroangiopatie indukované některými léky (mitomycin A, cyclosporin), stavy v graviditě (preeclampsia, HELLP syndrom), maligní hypertenze, hypertenzní krize u sklerodermie atd. Problémem je, že zde stojíme v situaci, kdy je součástí diagnózy empirická zkušenost, bez současné znalosti genetických nebo autoimunních faktorů ovlivňujících dysregulaci komplementu. Proto nepřekvapí, že stále více studií a kazuistických případů ukazuje, že i v případech s tzv. sekundárním HUS onemocní nositelé skrytých genetických variant, které vedou k abnormalitám regulace komplementu. Spouštěčem rozvoje onemocnění je stav, který je s tzv. sekundárním HUS spojován (např. maligní hypertenze). To také částečně vysvětluje, proč u těchto stavů TMA vyvinou jen někteří pacienti.

Obr. 1. Trombotická mikroangiopatie s trombem v hilové arteriole s přesahem do glomerulu u pacienta s aHUS. V okolí je zřetelné ischemické poškození tubulů s oploštělou výstelkou a v luminech s detritem.

Genetická analýza je tedy nezbytná pro terapii pacientů s aHUS. Jenže genetická analýza obvykle dlouho trvá a dosud nedokáže identifikovat abnormality u 40 % pacientů. Navíc definice patogenní varianty je stále problematická a časově velmi náročná, což je dané komplexitou funkčních studií, proto je velké množství variant označeno jako varianty nejistého významu (7). Celou situaci zhoršuje fakt, že penetrance onemocnění je velmi nekompletní (90 % variant je zděděno od rodičů bez onemocnění a jsou přítomny také u příbuzných pacienta, kteří nejsou nemocní). Na druhé straně, séra pacientů s aHUS indukovala ve 100 % testovaných vzorků intenzivní depozici C5b-9 na buňkách v tkáňové kultuře, bez závislosti na tom, o jakou genetickou variantu se jednalo. Totéž platilo pro séra pacientů s aHUS, kde se žádná ze známých variant neprokázala, což znamená, že jistě existují nějaké další patogenní, ale dnes neznámé varianty (8). Depozice C5b-9 může kromě známého lytického efektu poškozovat endotel i jinými způsoby. Sublytické množství C5b-9 vede k sekreci multimerů vWF, který několika dalšími kroky navodí protrombotický povrch endotelu, což aktivuje destičky a přispívá k depozici fibrinu. Navíc komplex C5b-9 způsobí retrakci endotelu a tím dojde k odhalení protrombotické matrix, v případě glomerulů jde o GBM, která nemá antikomplementovou ochranu.

C3 nefropatie

Mezi nejznámější onemocnění s poruchou komplementu patří C3 nefropatie. Historicky jde o nemoc denzních depozit (DDD) a další tzv. membranoproloferativní GN (MPGN). Objevy v oblasti komplementu vedly ke změně pohledu na tuto skupinu chorob (10). Změnila se i jejich klasifikace: MPGN jsou v současnosti považované za nemoci s abnormalitami komplementu a jejich klasifikace stojí na detekci imunoglobulinů a frakcí komplementu. Jde o skupinu vzácných a závažných onemocnění ledvin, které jsou charakterizované dysregulací komplementu v rozpustné fázi, což ve výsledku vede k ukládání C3 v glomerulech (v mesangiu a podél nebo uvnitř GBM) a k intraglomerulárnímu zánětu (Obr. 2 a 3). Obě kategorie DDD a C3 GN jsou považované za kontinuum jednoho onemocnění, protože mají překrývající se morfologii i klinický průběh. Jako důvod rozvoje onemocnění byla nejprve identifikovaná dysregulace alternativní cesty komplementu, později se ukázalo, že je běžná také dysregulace terminální kaskády. Na rozdíl od aHUS, kde dominují genetické faktory, u C3 nefropatie k onemocnění vedou především získané faktory, kterými jsou u většiny pacientů různé autoprotilátky proti komponentám C3 a C5 konvertáz. Protilátky zvyšují čas působení těchto důležitých a za normálního stavu velmi krátce fungujících enzymů.

Obr. 2. C3 nefropatie, imunofluorescenční detekce C3c frakce komplementu s četnými granulárními a splývajícími depozity v mesangiu.

Obr. 3. C3 nefropatie, glomerulus s rozšířenými mesangiálními oblastmi s vyšší mezangiální buněčností jako součást morfologie C3 nefropatie. Na základě histologie nelze C3 nefropatii diagnostikovat. Rozhodující je imunofluorescence s izolovanými depozity C3.

Nejčastěji onemocní mladí dospělí nebo děti a klinický průběh zahrnuje proteinurii, hematurii a progresivní chronické onemocnění, které vede u většiny pacientů k selhání ledvin během 2 dekád. U některých pacientů se může během let morfologie měnit nejen mezi DDD a C3 nefropatií, ale také např. mezi C3 nefropatií a aHUS. Faktor H je nejvýznamnějším regulátorem alternativní cesty komplementu a vytváří strukturu podobnou smyčce, která při regulaci jednou koncovou částí naléhá na bazální membránu. Na tomto konci jsou nejčastější genetické varianty, které jsou identifikovány u pacientů s aHUS. Naproti tomu, protilátky vytvořené proti komponentám konce, který je volně v séru, jsou typické pro pacienty s C3 nefropatií.

Léčba C3 nefropatie je obtížná a i když imunosuprese nebo blokáda terminální komplementové kaskády některým pacientům pomáhá, neexistuje dnes terapie, která by universálně fungovala nebo dokázala onemocnění vyléčit (11).

C3 nefropatie a postinfekční glomerulonefritida

V průběhu postinfekční glomerulonefritidy je distribuce imunokomplexů variabilní. V klasickém průběhu subepiteliální depozita (tzv. humps), která obsahují IgG a komplement, mizí cca po 8 týdnech. U některých pacientů přetrvá porucha funkce ledvin i po tomto období a v morfologii začne dominovat depozice C3 a IgG slábne nebo může zcela chybět. Pro nefropatology platí, že pokud klinické abnormality přetrvávají více než 12 týdnů a v biopsii je morfologie odpovídající C3 nefropatii, diagnóza se může z postinfekční GN změnit na C3 nefropatii a mělo by být indikované vyšetření komplementu. Problém představuje obtížně dostupné vyšetření protilátek proti různým komponentám komplementových kaskád stejně tak, jako vyšetření genetických variant komplementu. Bohužel ani vyšetření komplementu nemusí přinést jasno do dalšího vývoje onemocnění. Během infekce někteří pacienti mohou vyvinout různé protilátky včetně monoklonálních, jejich působení může být krátkodobé a časem se může měnit na polyklonální nebo obráceně, z polyklonálních na monoklonální nebo mohou protilátky přetrvávat a podílet se na další progresi onemocnění. A tak není výjimečné, že diagnóza zůstává orientační. Nicméně je doloženo, že u nemalé části těchto pacientů je to dysregulace komplementu, která vede k další progresi onemocnění (12, 13).