Borrelia burgdorferi s.l. v klíšťatech na ostravských haldách

Súhrn

V letech 2005 a 2006 byly prováděny periodické sběry klíštěte obecného Ixodes ricinus na ostravských haldách Oskar (A) a Emma (B), částečně porostlých vegetací včetně dřevin, a na kontrolní lesní lokalitě (C) u nedalekého města Hlučín. Průměrná frekvence klíšťat (počet nasbíraných klíšťat za hodinu vlajkování) byla vysoká, na haldě A 35,3 nymf a 12,7 dospělců, na haldě B 23,3 nymf a 26,0 dospělců, a na lokalitě C 25,4 nymf a 16,8 dospělců. Mikroskopií v zástinu bylo na přítomnost borrelií Borrelia burgdorferi sensu lato vyšetřeno z každé lokality 100 nymf a 100 dospělců (50 samic a 50 samců). Průměrná prevalence B. burgdorferi s.l. v klíšťatech byla na haldě A 10,0 % u nymf a 12,0 % u dospělců, na haldě B 10,0 % u nymf a 24,0 % u dospělců, a na lokalitě C byl tento podíl 13,0 % u nymf a 17,0 % u dospělců. Rozdíly v celkové prevalenci borrelií v klíšťatech mezi haldami A nebo B a kontrolní plochou bez ohledu na stadium klíštěte nebyly statisticky průkazné, i když dospělá klíšťata z haldy B obsahovala borrelie signifikantně četněji než dospělci z haldy A. Lokality se mezi sebou lišily ve frekvenci průměrného počtu klíšťat infikovaných borreliemi za hodinu sběru: na haldě A to bylo 3,3 nymf a 1,2 dospělců, na haldě B 1,5 nymf a 2,9 dospělců, a na kontrolní lokalitě 3,1 nymf a 2,6 dospělců. Izolační pokusy byly provedeny u 16 klíšťat s přítomností většího počtu spirochét, a u 8 z nich se podařilo vykultivovat borrelie, které byly pomocí PCR-RFLP identifikovány jako B. garinii (3 izoláty: 1 Hlučín; 2 halda B), B. afzelii (4 izoláty: 1 halda A; 3 halda B) a B. burgdorferi s.s. (1 izolát halda A). Výsledky poněkud překvapivě naznačují, že ostravské haldy hlušiny, pokud jsou porostlé vegetací včetně dřevin a navštěvovány lidmi, mohou teoreticky představovat přibližně stejné potenciální riziko nákazy člověka lymskou borreliózou jako běžné lesní biotopy.

Klíčová slova:
Ixodes ricinus – výsypky hlušiny – lymská borrelióza – riziko přenosu.

Lymská borrelióza (LB), jejímž původcem je Borrelia burgdorferi sensu lato [2], je jednou z nejvýznamnějších a nejhojnějších zoonóz holarktické oblasti [6, 28, 30, 31]. Komplex B. burgdorferi s.l. zahrnuje t.č. minimálně 12 genomických druhů (genomospecies, nomenklatoricky nepřesně zvaných genospecies), které se částečně liší také svou ekologií, epidemiologií, mírou patogenity i klinickým obrazem vyvolávané nemoci. Pro člověka patogenní a LB prokazatelně vyvolávající jsou především B. burgdorferi s.s., B. afzelii a B. garinii, ojediněle jsou však popisovány také případy LB vyvolané B. valaisiana a B. lusitaniae [3, 27].

V České republice byly případy LB člověka laboratorně (sérologicky) potvrzeny poprvé ve druhé polovině 80. let [4, 21], a borrelie přítomné v tkáních pacientů byly u nás pozorovány nedlouho poté [15, 29]. V tomto období byla také v Česku B. burgdorferi s.l. poprvé mikroskopicky detekována v klíšťatech Ixodes ricinus [20] a následně z klíšťat izolována [14]. LB je u nás nejhojnější klíšťaty přenosnou zoonózou: během let 1993–2007 bylo v ČR hlášeno průměrně 3680 (rozsah 2138–6302) LB případů ročně [18, EpiDat – Státní zdravotní ústav Praha]. V roce 1995 bylo zaznamenáno rekordních 6302 případů onemocnění, což podle epidemiologů souviselo s nadnormálním výskytem klíšťat. Signifikantní vztah mezi početností nymf klíštěte obecného a incidencí LB byl prokázán např. na jižní Moravě [12].

Ekosystém, v němž se vektor LB – klíště komplexu Ixodes ricinus – převážně vyskytuje, jsou listnaté a smíšené lesy mírného klimatického pásu. Popsán je ovšem také častý výskyt borrelií v klíšťatech evropských městských parků [1, 7, 10, 19, 22–24]. Doposud však nebyla věnována dostatečná pozornost možnosti výskytu klíšťat infikovaných borreliemi v tak vyhraněně antropogenním biotopu, jaký představují odvaly karbonské hlušiny z černouhelných dolů, které se nacházejí např. na Ostravsku. Mnohé z těchto ostravských hald byly sukcesně osidlovány vegetací, a postupně se na nich objevovaly také některé druhy endotermních obratlovců, potenciálních hostitelů klíšťat. Proto jsme se domnívali, že by se na haldách mohla vyskytovat i klíšťata, případně nakažená borreliemi. Klíště I. ricinus bylo ostatně trvale nalézáno na výsypkách hnědouhelných dolů na Mostecku zhruba 10 let po jejich rekultivaci [26].

Materiál a metody

Charakteristika lokalit

Všechny 3 sledované lokality se nacházejí na území Moravskoslezského kraje (obr. 1). V období 1961-1990 byl na tomto území průměrný roční souhrn srážek 677 mm, průměrná teplota vzduchu 8,6 °C, v měsících březen až listopad 11,7 °C. V roce 2005 byla průměrná teplota vzduchu od března do listopadu mírně nadnormální (12,4 °C), a roční souhrn srážek činil 699 mm (údaje Českého hydrometeorologického ústavu).

Sběry klíšťat byly prováděny na haldách patřících ke dvěma městským částem Ostravy, a na kontrolní lokalitě u Hlučína. Oba studované umělé biotopy odvalů na území Ostravy vznikly relativně nedávno, kdy byla hlušina (odpad z těžby černého uhlí) navezena do „hald“ a tyto haldy pak postupně osídleny přírodním náletem dřevin anebo dřevinami uměle osazeny (rekultivovány).

Halda Oskar (lokalita A: 49°51’45” N, 18°14’10” E) je výsypkou nepravidelného tvaru z bývalého dolu Oskar (později přejmenovaného na důl Lidice), který byl založen v roce 1891 u západního okraje obce Petřkovice. Těžba uhlí zde probíhala v letech 1896–1967. Halda není termicky aktivní, má rozlohu 2,2 ha a objem hlušiny >1,5 mil. m³. Výsypka byla rekultivována, vegetační kryt je přesto tvořen z velké části přírodním náletem dřevin (obr. 2). V druhové skladbě převládají ve stromovém patru bříza bradavičnatá, dub zimní a cer, javor klen, lípa malolistá, olše lepkavá; v keřovém patru bez černý, líska. Bylinné patro je zastoupeno např. druhy hluchavka bílá, kopřiva dvoudomá, sasanka hajní, jahodník obecný. Zdejší faunu obratlovců – hostitelů klíšťat – tvoří hraboš polní, norník rudý, myšice křovinná a lesní, rejsek obecný, ježek východní, zajíc, liška, prase divoké, srnec; z ptáků bažant obecný, kukačka, drozd zpěvný, kos, červenka, strnad obecný. Z klíšťat jsme prokázali pouze druh klíště obecné(Ixodes ricinus).

Halda Emma (lokalita B, halda označována také jako Terezie, Terezie-Emma či Emma-Terezie: 49°50’23” N 18°18’54” E) je bývalou výsypkou dolu Terezie (přejmenovaného na důl Petr Bezruč) a dolu Svaté Trojice, a nachází se v oblasti na pravém břehu řeky. Oba doly byly založeny ve 40. letech 19. století, byly posléze sloučeny, a těžba v dolu Petr Bezruč probíhala až do roku 1992. Haldu o rozloze asi 34 ha tvoří >4 mil. m³ slehávající hlušiny. Tato více než 150 let stará halda je termicky aktivní, vyvěrají z ní bělostné obláčky plynů, obsahující zejména oxid siřičitý. Díky tomu se také na vrcholu odvalu nikdy neudrží sníh. Výsypka byla rekultivována: na severní straně je hustý les; jižní svah, který stále prohořívá, je porostlý řidčeji náletovými dřevinami (obr. 3). Halda je protkána několika značenými stezkami, a slouží dokonce jako výletní místo pro obyvatelstvo. V druhové skladbě převládají ve stromovém patru bříza bradavičnatá, dub zimní a cer, javor mléč, jasan ztepilý, jeřáb obecný; v keřovém patru bez černý, líska, dřín, lípa malolistá, svída. V bylinném patru jsou druhy kopřiva dvoudomá, svízel přítula, netýkavka malokvětá, starček obecný, kapraď samec a mnoho dalších. Ze savců se zde vyskytuje veverka, hraboš polní, myšice křovinná a lesní, rejsek obecný, ježek východní, zajíc; z ptáků např. bažant, kos, drozd zpěvný, červenka a strnad obecný. Z klíšťat jsme na lokalitě zjistili pouze klíště obecné.

Hlučín – porost Štípky (lokalita C: 49°55’25” N, 18°13’45” E; 286 m n.m.). Les Štípky, který jsme zvolili za kontrolní lokalitu, se nachází asi 2 km od předměstí Darkovičky, a je součástí bažantnice v Šilheřovicích. V druhové skladbě převládají ve stromovém patru dub letní, zimní a cer, javor klen a mléč, buk, bříza bradavičnatá, habr, olše lepkavá, smrk, jeřáb obecný; v keřovém patru pak bez černý, líska, ostružiník křovitý a maliník. V bylinném patru jsou zastoupeny druhy hluchavka bílá, kopřiva dvoudomá, sasanka hajní, netýkavka malokvětá, tuřice třeslicovitá, kapraď samec a mnoho dalších. Ze savců se běžně vyskytují hraboš polní, norník rudý, myšice křovinná, lesní a temnopásá, veverka, rejsek obecný, krtek, ježek východní, zajíc, liška, prase divoké, srnec. Pohybuje se zde velké množství bažantů a mnohé další druhy ptáků např. kukačka, kos, drozd zpěvný, červenka, střízlík, brhlík, sojka, straka, strnad obecný. Z klíšťat se zde nachází pouze druh klíště obecné.

Sběr klíšťat a jejich vyšetření na borrelie

Sběr. Hladové nymfy a imaga klíštěte obecného Ixodes ricinus byly sbírány vlajkováním nízké vegetace pomocí bílé flanelové látky (60x100 cm) od dubna do září v letech 2005 a 2006, a transportovány do laboratoře ve skleněných zkumavkách s korkovými zátkami a několika vloženými listy travin proti vyschnutí. Zkumavky s živými klíšťaty byly v laboratoři uchovávány při 5 °C, a listy travin podle potřeby obměňovány. Sběry klíšťat byly provedeny v 10 termínech: 4krát v roce 2005 a 6krát v roce 2006, všechny od dubna do července; podzimní sběry nebyly uskutečněny vzhledem k nízké početnosti klíšťat. Úhrnem bylo na borrelie mikroskopicky vyšetřeno 600 klíšťat – po 200 kusech (50 samic, 50 samců a 100 nymf) z každé lokality.

Mikroskopie. U jednotlivých klíšťat byla na mikroskopickém podložním sklíčku idiosoma oddělena od gnathosomy a končetin pomocí preparačních jehel. Vypreparované střevo bylo rozmělněno a střevní obsah homogenizován v kapce sterilního fyziologického roztoku, překryt krycím sklíčkem a vyšetřen mikroskopií v zástinu při zvětšení 160krát a 400krát. Prohlédnuta byla vždy celá plocha preparátu, a u pozitivních vzorků byly spirochéty spočítány. Spirochéty morfologicky shodné s borreliemi jsou považovány v této studii za Borrelia burgdorferi s.l., neboť nálezy spirochét jiných než náležejících ke komplexu B. burgdorferi s.l. v nymfách a dospělcích I. ricinus jsou ve střední Evropě zcela výjimečné (a tudíž zanedbatelné).

Izolace a kultivace. Byla-li infekce borreliemi podle mikroskopického vyšetření dostatečně intenzivní (>100 spirochét v klíštěti) nebo vykazovaly-li spirochéty výraznou motilitu, bylo přistoupeno k izolačnímu pokusu. Homogenát střeva klíštěte byl z krycího i podložního sklíčka smyt do malé (3 ml) skleněné zkumavky s médiem BSK-H (Sigma, Německo) s přídavkem fosfomycinu (100 μg/ml) a rifampicinu (50 μg/ml). Ve zvláštních případech (při rezistenci kontaminanty) byl použit také sulfametoxazol (50 μg/ml) a trimetoprim (10 μg/ml) (Sigma, USA). Inokuláty byly inkubovány až 4 týdny při 33 °C, průběžně mikroskopicky kontrolovány, a pozitivní vzorky pasážovány do čerstvého kompletního média BSK-H doplněného antibiotiky. Izolované kmeny byly pro uchování zmrazeny v plastových kryozkumavkách (Nunc, Dánsko) v médiu BSK-H s přídavkem 10% dimetylsulfoxidu (Sigma) jako kryoprotektiva při teplotě –60°C, případně i v kapalném dusíku při –196 °C.

Identifikace borrelií (PCR a polymorfismus délky restrikčních fragmentů, RFLP). Spirochetální buňky určené pro izolaci DNA byly kultivovány do logaritmické fáze růstu, zkoncentrovány centrifugací (8500 g, 30 min, 4 °C), 2krát promyty sterilním fyziologickým roztokem centrifugací za stejných podmínek, resuspendovány v odpovídajícím množství sterilního fyziologického roztoku (cca 0,5ml), a zmraženy při  20 °C. Bakteriální DNA byla izolována pomocí DNeasy^® Tissue Kit (Qiagen, Německo) přesně podle návodu dodávaného výrobcem. Takto připravený vzorek DNA byl uchováván při –20 °C, a použit jako templát pro PCR. Primery byly vybrány tak, aby došlo k amplifikaci variabilního regionu mezi dvěmi konzervovanými strukturami, 3’ koncem 5S rRNA (rrf) a 5’ koncem 23S rRNA (rrl). Amplifikované fragmenty jsou u různých kmenů borrelií dlouhé 226 až 266 bp [25]. Byly připraveny vzorky našich izolátů a také typových kmenů borrelií, které byly pasážovány a uchovávány na oddělení medicínské zoologie ÚBO AVČR ve Valticích (tab. 1). V PCR byl použit 2krát koncentrovaný PPP Master Mix (Top-Bio, ČR): 15 mM Tris-HCl (pH 8,8); 40 mM (NH₄)₂SO₄; 0,02% Tween 20; 5 mM MgCl₂; 400 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP; 100 U/ml Taq purple DNA polymerázy; aditiva, stabilizátory. Reakční směs o celkovém objemu 25 ml se skládala z PPP Master Mix, PCR H₂O, primerů (Invitrogen, USA) o koncentraci 20 pmol, a templátové DNA. Program termocykleru PTC-200 (MJ Research, USA) zahrnoval celkem 30 cyklů s etapami 1 min/94 °C; 1 min/52 °C; a 2 min/72 °C. Izolace DNA, příprava PCR směsi, vlastní amplifikace stejně jako post-PCR kroky probíhaly odděleně (časově i prostorově) kvůli zamezení možné zkřížené kontaminace vzorků.

Amplikon mezerníkového úseku mezi geny rrf a rrl byl dále štěpen restrikčním enzymem MseI (New England Biolabs, USA), který rozkládá DNA v cílovém místě 5’- T↓TAA- 3’; 3’- AATT- 5’ [25]. Po restrikčním štěpení PCR produktu byla provedena elektroforéza vzorků v aparatuře Biorad (Biorad Laboratories, USA) v 3% agarózovém gelu (Invitrogen, USA) při použití 0,5krát TBE pufru (SERVA, Německo) za standardních podmínek (napětí 70 V, 18 mA, 2,5 h). Gel byl barven ethidium bromidem (Top-Bio, ČR), a amplifikovaná DNA byla analyzována pod UV světlem v transluminátoru (Ultra-Cam, USA). Vizualizovaná DNA byla zpracována dokumentačním systémem Ultra-Cam (USA).

Kvantitatívní údaje a jejich statistické zpracování

Abundance klíšťat a borrelií byly vyjádřeny indexy:

1. Frekvence klíšťat (F) – průměrný počet klíšťat za hodinu sběru vlajkou (neboli „na vlajkohodinu“). Charakterizuje momentální početnost klíšťat na lokalitě.
2. Prevalence borrelií (P) – průměrný podíl klíšťat s borreliemi z celkového počtu vyšetřených.
3. Frekvence pozitivních klíšťat (F_p) – průměrný počet klíšťat s borreliemi za hodinu vlajkování; F_p = F x P [13].

Pro hodnocení statistické průkaznosti rozdílů v proporcích (četnosti) podle tabulek 2x2 nebo 2x3 byl použit χ² test (program SOLO 4.0, BMDP Statistical Software, California, USA).

Výsledky

Početnost klíšťat

Celková průměrná frekvence klíšťat/h byla na kontrolní lokalitě 25,4 nymf a 16,8 dospělců; na haldě A 35,3 nymf a 12,7 dospělců; a na haldě B 23,3 nymf a 26,0 dospělců (tab. 2). Ze všech 3 lokalit byla nejvyšší frekvence nymf na haldě A při sběru dne 30.4.2005 (62,0), na haldě B 13.5.2005 (43,0), a v Hlučíně 16.4.2006 (rovněž 43,0). Frekvence dospělců na haldě A byla nejvyšší při sběrech 13.5.2005 a 28.4.2006 (pokaždé 22/h), na haldě B 28.4.2006 (56/h), a v Hlučíně 17.6.2006 (30/h). Sezonalita klíšťat I. ricinus byla posouzena pomocí hodnot jejich frekvence na všech 3 lokalitách během měsíců duben–červenec 2006: maximum frekvence nymf bylo na haldě A v dubnu (38/h), na haldě B v květnu (30/h) a na lokalitě C v dubnu (31/h); maxima frekvence dospělců bylo dosaženo na haldě A v květnu (22/h), na haldě B již v dubnu (33/h), a na lokalitě C až v červnu (30/h).

Prevalence borrelií v klíšťatech

Prevalenci ukazuje rovněž tab. 2. Celková průměrná prevalence B. burgdorferi s.l. v klíšťatech byla 11,0 % u nymf a 17,7 % u dospělců. Na lokalitě A bylo pozitivních 10,0 % samic, 14,0 % samců a 10,0 % nymf; na B 26,0 % samic, 22,0 % samců, 10,0 % nymf, a na kontrolní lokalitě 24,0 % samic, 10,0 % samců a 13,0 % nymf. Nejvyšší procento pozitivních dospělců, jak samic tak samců, bylo tedy zaznamenáno na haldě B. Pomocí χ² testu nebyl zjištěn průkazný rozdíl v prevalenci borrelií mezi samicemi a samci v úhrnu (χ² = 1,12; P = 0,289), ani na žádné ze 3 lokalit. Byla však zjištěna průkazně vyšší celková prevalence borrelií u dospělců než u nymf klíšťat (χ² = 5,43; P = 0,020), která byla velmi výrazná zejména u klíšťat z haldy B (χ² = 6,94; P = 0,008). Dospělá klíšťata z haldy B obsahovala také borrelie průkazně (χ² = 4,88; P = 0,027) četněji (24,0%) než dospělci z haldy A (12,0%), ostatní rozdíly v prevalenci mezi lokalitami u imag ani u nymf průkazné nebyly.

Početnost infikovaných klíšťat

Průměrná frekvence klíšťat s borreliemi „za vlajkohodinu“ byla na kontrolní lokalitě 3,1 nymf, 2,6 dospělců (1,6 samic a 1,3 samců); na haldě A 3,3 nymf, 1,2 dospělců (0,6 samic, 0,8 samců); a na haldě B 1,5 nymf, 2,9 dospělců (2,1 samic, 2,3 samců). Nejvyšší frekvence pozitivních nymf (tab. 2) byla na haldě A při sběru 16.4.2006 (9,0), na haldě B 20.5.2006 (6,0), a v Hlučíně 16.4.2006 (7,7). Frekvence pozitivních dospělců byla nejvyšší na haldě A při sběru 20.5.2006 (3,1), na haldě B 16.4.2006 (5,0), a v Hlučíně 28.4.2006 (8,0).

Počty borrelií v klíšťatech

Klíšťata byla rozdělena podle počtu zjištěných borrelií do 3 skupin (tab. 3). Nejvíce dospělců obsahujících >100 borrelií bylo nasbíráno na haldě B. Nymf obsahujících >100 borrelií bylo jen několik, a nymf s 10–99 borreliemi bylo nejvíce na kontrolní lokalitě C.

Izolace a identifikace borrelií

Z 16 izolačních pokusů v médiu BSK-H bylo úspěšných 8 pokusů (tab. 4). Amplifikací pomocí PCR primerů byl získán u vzorků pozitivních na přítomnost amplikonu B. burgdorferi s.l. fragment o velikosti 226-266 pb, který byl dále štěpen restriktázou MseI. Separací produktů štěpení na 3% agarózovém gelu byly získány fragmenty, které byly porovnány s již publikovanými restrikčními vzory [25]. Izolát BR-V2, který pocházel z lokality Hlučín, byl identifikován jako B. garinii. Izoláty BR-V5 a BR-V9 z lokality A byly identifikovány jako B. afzelii a B. burgdorferi s.s. Z haldy B pocházely vzorky BR-V4, BR-V10, BR-V11, BR-V12 a BR-V14. Ve třech případech byla identifikována B. afzelii a ve dvou případech B. garinii (tab. 4).

Diskuse

Tato studie byla zaměřena na opakovaný sběr klíšťat v antropogenně narušených ekosystémech ostravské aglomerace (2 starší haldy) a na kontrolním nenarušeném biotopu smíšeného lesa (Hlučínsko). Vybrané lokality jsou od sebe vzdáleny <10 km. Při výběru hald se muselo příhlížet jak k jejich dostupnosti, tak k možnosti provádět sběry. Halda A (Oskar) se nachází na okraji města, v její blízkosti jsou lesy a pole, a proto se u ní předpokládalo větší druhové zastoupení hostitelů a tedy i větší frekvence záchytu klíšťat než u haldy B (Emma), která se nachází v blízkosti centra města Ostravy. To ovšem bylo potvrzeno pouze u nymf, zatímco dospělých klíšťat bylo více na haldě B. Početnost klíšťat mezi lokalitami byla rozdílná, a vcelku výrazně převyšovaly nymfy nad dospělci.

Distribuce LB je vázána na výskyt klíštěte obecného a bývá proto spojena s lesními biotopy, avšak riziko nákazy představují také např. městské parky (viz úvod). Některé studie uvádějí, že v městských parcích dosahuje pozitivita klíšťat až 30 % u dospělců a 14 % procent u nymf – např. v Brně [10]. V literatuře jsme ovšem nenalezli práci, která by se zabývala vyšetřením na borrelie klíšťat z rekultivovaných hald hlušiny z černouhelných dolů. Naše nálezy překvapivě ukazují, že i v tomto extrémním antropogenním biotopu se klíšťata obsahující borrelie vyskytují, a to s početností, která dosahuje abundance v biotopech přirozených.

Všechny sběry byly uskutečněny v měsících duben až červenec. Podzimní sběry nebyly prováděny vzhledem k nízké početnosti klíšťat v této době. V popisu sezonality frekvencí se zaměřujeme pouze na rok 2006, poněvadž v r. 2005 byly provedeny jen 4 jarní sběry. Maximální početnost nymf byla zjištěna na lokalitě Hlučín a na haldě A v dubnu, zatímco na haldě B v květnu. Avšak maximální početnosti dospělců bylo dosaženo u Hlučína v červnu, na haldě A v květnu, na haldě B v dubnu. Zdá se, že na haldách je sezónní vývoj klíšťat rychlejší, pravděpodobně díky teplejšímu mezoklimatu odvalů (zvláště na haldě Emma). Na haldě A a také na haldě B během letních měsíců klesala početnost jak dospělců tak i nymf. To odpovídá studii, ve které v jarních měsících byla početnost klíšťat (dospělců i nymf) maximální a v následujících měsících klesala [13].

Průměrná prevalence B. burgdorferi s.l. v I. ricinus v Evropě dosahuje 1,9 % u larev, 10,8 % u nymf a 17,4 % u dospělců [9] a liší se podle metod použitých k detekci. Kultivace v BSK médiu je méně citlivá metoda než mikroskopie (v zástinu či fázovém kontrastu) a PCR [5, 9]. V naší studii byla celková průměrná prevalence B. burgdorferi s.l. v klíšťatech 11,0 % u nymf a 17,7 % u dospělců, což zcela odpovídá celoevropskému průměru, a neliší se nijak významně od dat uvedených v jiných pracech uskutečněných na území Česka. Např. na jižní Moravě byla zjištěna prevalence u nymf 17,2 % a u dospělců 23,2 % [11], na Olomoucku u nymf 7,0 % a u dospělců 11,8 % [17], v Praze 8,2 % u nymf a 15,9 % u dospělců [23]. V naší studii byla zjištěna průkazně vyšší celková prevalence borrelií u dospělců než u nymf klíšťat, která byla velmi výrazná zejména u klíšťat z haldy B. Je možné, že mikroklima tohoto termicky aktivního odvalu příznivě ovlivňuje vývoj klíšťat i borrelií, zejména v chladnějších obdobích roku. Rozdíly v prevalenci borrelií v klíšťatech mezi kontrolní plochou a haldami nebyly statisticky průkazné.

Lokality se mezi sebou mírně lišily v indexu průměrného počtu klíšťat infikovaných borreliemi za hodinu sběru: nejvyšší frekvence pozitivních nymf byla na haldě A (9,0) a největší frekvence pozitivních dospělců v Hlučíně (8,0), a obecně byla nejvyšší frekvence pozitivních klíšťat v květnu. Míra rizika, jakou představuje počet infikovaných klíšťat za hodinu pro potenciální návštěvníky daného stanoviště, je vysoká především u nymf na kontrolní lokalitě a haldě A, a u dospělců na haldě B, kde můžeme v průměru každých 20 min narazit na infikované klíště. Míra rizika je nejvyšší u haldy B, na které se vyskytovalo nejvíce dospělých klíšťat obsahujících >100 borrelií. Nymf obashujících >100 borrelií bylo jen několik, a nymf obsahujících 10–99 borrelií bylo nejvíce na kontrolní lokalitě Hlučín.

Pro identifikaci spirochét druhového komplexu B. burgdorferi s.l. se úspěšně používá PCR amplifikace rrf (5S)-rrl (23S) intergenového mezerníku (‘spaceru’) a následné analýzy tohoto amplikonu pomocí RFLP [25, 31], což bylo potvrzeno i v naší studii, v níž bylo pomocí této techniky určeno všech 8 získaných izolátů. Izolát z kontrolní lokality C byl identifikován jako B. garinii, izoláty z haldy A jako B. afzelii a B. burgdorferi s.s., a mezi kmeny pocházejícími z haldy B byla ve třech případech identifikována B. afzelii a ve dvou případech B. garinii. Toto zastoupení jednotlivých genomických druhů je typické pro Evropu, v níž převažují genomické druhy B. garinii (39,7%) a B. afzelii (37,1%), méně bývá zastoupena B.burgdorferi s.s. (15,9%) [8]. Frekvence výskytu B. burgdorferi s.s. se obecně snižuje od západu k východu, v České republice není nijak častá, a nevyskytuje se v Rusku [8, 25, 27]. Genomospecies B. valaisiana a B. lusitaniae jsou daleko méně obvyklé, i když byly zaznamenány i v zemích střední Evropy: B. valaisiana i u nás [16] a na Slovensku [5], a B. lusitaniae v Portugalsku [3], na Ukrajině, v České republice [11,16] a na Slovensku [5].

Poděkování

Údaje charakterizující obě haldy poskytlo Hornické muzeum v Petřkovicích. Tato studie byla podpořena grantem EU GOCE-2003-010284 EDEN (je evidována Radou projektu jako EDEN 0136), a částečně také Grantovou agenturou Akademie věd České republiky (KJB600930613).

Do redakce došlo 8. 1. 2009

Prof. RNDr. Zdeněk Hubálek, DrSc.

Ústav biologie obratlovců AVČR, v.v.i.

Klášterní 2

691 42 Valtice

e-mail: zhubalek@brno.cas.cz