Genetické faktory a riziko kardiovaskulárnych ochorení

Súhrn

Cieľom tejto práce je sumarizovať genetický podklad kardiovaskulárnych ochorení podľa doterajších poznatkov, so zameraním na genetické markery multifaktoriálnych foriem kardiovaskulárnych ochorení na podklade aterosklerózy, vrátane ich interakcie s klasickými rizikovými faktormi.

Kľúčová slová:
ateroskleróza - kardiovaskulárne riziko - deoxyribonukelová kyselina - genetika - polymorfizmus

Úvod

Ľudský genóm možno v dnešnej dobe počítačov definovať ako zbierku informácií, programov, algoritmov a časo-priestorových plánov ich spúšťania a vypínania [18]. Popri fyzickej - materiálnej existencii dovoľujú jeho produkty existenciu a realizáciu abstraktných, do neživej formy transformovaných informácií [18]. Lekársky pohľad býva profesionálne zúžený na otázky ľudského tela (vrátane mysle), jeho zdravia a chorôb. Hľadá vzťah medzi genotypom a fenotypom, ktorý by mohol nejakým spôsobom využiť pre optimalizáciu fenotypu [143]. V poslednom čase došlo k značným zmenám v našom chápaní tohto vzťahu. Fertilizáciou vzniká zárodok s určitou výbavou aj so všetkými familiárnymi (dedičnými, hereditárnymi) „chybami“. Túto výbavu možno prirovnať k neotesanému balvanu, ako pracovnému materiálu. Od tejto chvíle je materiál pod vplyvom vonkajších faktorov. Možnosť zásahu do intenzity pôsobenia každého faktora sa počas života mení. Výsledkom je mnohopočetná, časopriestorová, situačná interakcia, ktorá vytvára podstatu biologickej i psychosociálnej existencie ľudského indivídua [58]. Vzťah medzi genotypom a fenotypom teda nie je priamočiary a historické klinické jednotky, tvorené vyložene z obrazov, ktoré sme získali pozorovaním fenotypu, nás vedú k nesúladu až rozporu medzi kategorizáciou príčin a klasifikáciou následkov [52,143].

Genetická determinácia sa na vzniku chorôb podieľa rôznou mierou. Od takmer absolútnej, prakticky stopercentnej genetickej podmienenosti až po takmer úplnú nezávislosť [18]. Najmenšou zodpovednou genetickou jednotkou je v detaile jeden nukleotid a jeho bodová mutácia. Existuje celý rad ochorení, ktoré možno takto klasifikovať - rôzne alely toho istého génu zodpovedajú rôznym klinickým jednotkám (napr. Duchennova a Beckerova svalová dystrofia, erozívna vitreoretinopatia a Wagnerova choroba) [13,18,42-44,145]. Na druhej strane identické alely toho istého génu na rôznom geno-enviromentálnom pozadí môžu mať rozdielne fenotypové prejavy [58,59]. Navyše mutovaný gén sa nemusí vôbec prejaviť. Ak sa znak u niektorých z nositeľov neprejaví, má neúplnú penetranciu. Ak sa znak vyskytuje u viacerých členov rodiny v odlišných formách (napr. ľahkej, stredne ťažkej a závažnej), hovoríme, že znak má variabilnú expresivitu [142]. Penetrancia teda prejav genetického znaku charakterizuje kvalitatívne a expresivita kvantitatívne. O výslednom fenotype často rozhoduje aj druhá alela, čiže genotyp daného lokusu (charakter genetickej informácie v príslušnej časti určitého chromozómu) a v konečnom dôsledku celá genetická výbava jedinca v rámci jednej bunky, označovaná ako genóm (tzv. efekt génového pozadia - „genetic background“) [80]. V prípade monogénových ochorení s dominanciou patogénnej alely a jej úplnou penetranciou (prejavom) je vplyv génového pozadia. Takéto ochorenia sa nazývajú aj alelové. Choroby, ktoré sú determinované expresiou kombinácie dvoch alel príslušného génu možno označiť ako genotypové. Ak sa akákoľvek patogénna alela určitého génu exprimuje vo forme toho istého fenotypu, ide o ochorenia génové a pokiaľ o penetrancii patogénneho fenotypu rozhodujú alelové variácie vo viacerých génoch, hovoríme o polygénových, multilokusových ochoreniach. Keďže žiadny gén neexistuje v úplnom vzduchoprázdne a celkom nezávisle od okolia, je zrejmé, že čím viac génov je v hre, tým väčší priestor sa utvára pre uplatnenie situačných vplyvov [80]. Tým viac sa od hodnotenia „buď - alebo“ blížime k pravdepodobnostnému postoju „asi, snáď“, vyjadreného ako náchylnosť (susceptibilita) alebo odolnosť [18,136]. Na vyjadrenie určitého chorobného stavu, ktorý vzniká interakciou génov a prostredia, používame termín multifaktoriálne ochorenia. Vo svetle poznania ľudského genómu tak vzniká v medicíne potreba nájsť nový súlad medzi príčinou a následkom.

Mnohotvárnosť ľudského genómu

Genetická informácia eukaryotických organizmov netvorí jeden celok, ale pomocou intrónov je podelená na rôzne dlhé úseky - exóny, ktoré sú vo forme ribonukleových kyselín (ribonucleic acid - RNA) pred jej transláciou dodatočne zložené. Expresia génov kontrolovaná prostredníctvom regulačných oblastí v ich štruktúre. Medzi esenciálne regulačné oblasti, ktorá sa nachádza aspoň v jednom exemplári na začiatku každého známeho génu, patrí promótor. V tejto oblasti sa rozvíja činnosť RNA polymerázy, nevyhnutnej pre prepis dedičnej informácie - transkripciu [80]. Na konci génu sa nachádza terminátor, ktorý ukončuje prácu polymerázy. Mozaikovitý charakter štruktúry s niekoľkými promotórmi alebo terminátormi umožňuje využitie jednej dedičnej informácie vo viacerých formách. Gén ako informačná jednotka v štruktúre nukleovej kyseliny tak nadobúda množstvo podôb [122,136]. Jeden a ten istý úsek vlákna deoxyribonukleové kyseliny (deoxyribonucleic acid - DNA) môže byť súčasťou viacerých génov - napr. jeden gén môže mať svoj začiatok umiestnený v rámci druhého génu prípadne v ňom môže byť celý umiestnený. Rovnako pamäťový úsek jedného génu môže byť regulačnou oblasťou iného génu [80]. Definovanie génu na úrovni DNA sa tak stáva neúplnym. Presnejšie by snáď mohol gén definovať úsek RNA, prepisovaný v celku.

Gény, ako ich chápeme na úrovni DNA, sa teda navzájom prekrývajú [18,80]. Vzhľadom na veľkosť intrónov nie je raritou umiestnenie jedného génu v rámci intrónu druhého génu. Ďalšou možnosťou je použitie každého reťazca určitého úseku dvojzávitnice DNA na prepis dvoch rôznych génov (tzv. mt gény) [122]. Uvedeným zaobchádzaním s dedičným materiálom možno podľa hesla „menej je niekedy viac“ vysvetliť, prečo náš genóm nie spomedzi všetkých organizmov ani zďaleka najrozsiahlejší. U vírusov (fágov) ide takéto šetrenie molekulou tak ďaleko, že rovnaký reťazec môže slúžiť na syntézu funkčne rôznych proteínov len podľa toho, v ktorom mieste je transkripcia zahájená - v RNA reprezentuje každú aminokyselinu v reťazci proteínu triplet nukleotidov, pričom posunom počiatočnej lokalizácie čítacieho rámca tripletov o jeden nukleotid možno získať z identickej sekvencie tri rôzne bielkoviny [2]. U eukaryotických organizmov je vďaka intrónom využitie DNA ešte znásobené rôznym poradím exónov v konečnom produkte. Týmto mechanizmom sa vysvetľuje podiel intrónov na evolúcii organizmov.

Ďalšou možnosťou je vznik funkčne odlišných bielkovín z RNA pomocou alternatívneho zostrihu intrónov pred transláciou (tzv. „alternative splicing“) alebo na základe odlišnej posttranslačnej úpravy proteínu. Uvedený mechanizmus sa bežne uplatňuje pri diferenciácii tkanív napr. kardiovaskulárneho systému [2,80,122].

Štruktúru génu ďalej dopĺňajú tzv. „CpG ostrovy“. Ide o regulačné sekvencie s motívom cytozín-guanín. Metylácia cytozínov vedie k útlmu prepisu príslušného génu.

Nie všetky gény v ľudskom genóme disponujú aktívne použiteľnou informáciou. Tzv. pseudogény sú úseky DNA, ktoré sa aktívnym génom veľmi podobali, ale väčšinou im chýbajú intróny, prípadne iné regulačné oblasti, nevyhnutné k prepisu [80]. Väčšina pseudogénov nie je transkripčne a translačne aktívna. Existujú však aj výnimky, prekladané počas určitých období života do proteínov. Výskyt pseudogénov je pomerne veľký a v niektorých oblastiach dokonca zodpovedá výskytu funkčných génov. Význam pseudogénov nie je celkom objasnený [18]. Predpokladá sa, že ide o určitú evolučne tlmenú, avšak udržiavanú zálohu informácií, ktorá zbiera chyby, vznikajúce počas replikácie DNA a pri opätovnej aktivácii počas evolúcie potenciálne zvyšuje variabilitu a tým aj možnosť nadobudnutia nových vlastností [58].

Evolúciu možno považovať za výsledok pôsobenia dvoch protikladných tendencií - konzervatívneho princípu stálosti, nemennosti a dynamického princípu neustálych zmien. V živej hmote sú tieto princípy vyvážene upevňujú a využívajú to, čo sa v súboji s vonkajšími i vnútornými podmienkami osvedčilo a na strane druhej neustále ponúkajú nové varianty riešenia [58,122].

Mnohotvárnosť ľudského genómu ako dôsledok jeho variability nadobúda v súčasnosti nový rozmer. Od rôznosti znakov, ako prejavov dedičných a environmentálnych vplyvov, prechádza medicína aj vďaka genetike k ich podstate a príčinám [18]. Každý jedinec na zemeguli je svojou genetickou výbavou jedinečný. Existencia odlišností spočíva v neprestajne vznikajúcich a miznúcich zmenách štruktúry genómu [58,142]. Vzácne variácie sú klasifikované ako mutácie. V prípade bežného výskytu v populácii ide o tzv. polymorfizmy [52]. Uvedený rozdiel vo frekvencii výskytu je daný zlúčiteľnosťou variácie so životom resp. vplyvom na reproducibilitu jedinca. Pre odlíšenie polymorfizmov a mutácií sa používa dohodnutá miera pre frekvenciu najčastejších alel určitého génu v populácii do 99 %. Pri prekročení tejto hodnoty sa prestáva hovoriť o polymorfizmoch a všetky ostatné alely sa považujú za mutácie odvodené od tejto štandardnej alely [18,52,80].

Medzi základné polymorfizmy na úrovni DNA patria jednonukleotidové odlišnosti - tzv. SNP (single nucleotide polymorphisms), používané aj na mapovanie genómu [52]. Poznaním ich presnej lokalizácie v DNA možno určiť polohu celých génových lokusov. Frekvencia ich výskytu sa pohybuje v intervale 1 SNP na 200 - 2 000 bázových párov. SNP majú svoju databázu, ktorá obsahuje milióny variácií a neustále sa rozrastá (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/).

Polymorfizmy možno štatistickým dôkazom spájať s patologickými prejavmi. Následne je možné odhadnúť empirické riziko, keďže je zo skúseností známe, že u osôb s určitým genotypom dochádza k rozvoju daného ochorenia častejšie ako u osôb s iným genotypom v danom polymorfnom systéme [52,136,143]. Takýchto asociácií bolo doposiaľ identifikované veľké množstvo [13,42-44,57,69,165] Na overenie kauzality týchto štatistických vzťahov je potrebné objasnenie funkcie produktov zainteresovaných génov, ako sa to už deje napr. v systéme HLA a ďalších imunokompetentných molekúl [18].

Genetika kardiovaskulárneho systému

Kardiovaskulárne ochorenia patria medzi najrozšírenejšie, najzávažnejšie a najpálčivejšie nielen zdravotnícke, ale aj ekonomické a sociálne problémy takmer všetkých krajín súčasného sveta. Zapríčiňujú vysokú morbiditu, spojenú s dlhotrvajúcou invalidizáciou a asi polovicu úmrtí populácie, čo je dva razy viac ako na druhú najčastejšiu príčinu mortality - onkologické choroby [32]. Drvivá väčšina týchto ochorení vzniká na podklade systémových degeneratívnych zmien cievnych stien s predilekčným prejavom v ich určitých úsekoch. Tento proces je známy pod súhrnným názvom ateroskleróza (odtiaľ aterosklerózou podmienené kardiovaskulárne ochorenia - AS KVS). Na základe doterajších epidemiologických, experimentálnych a klinických prác sa pri vzniku aterosklerózy predpokladá súčinnosť viacerých rizikových faktorov a mechanizmov [32]. Ukazuje sa, že ide o patologický proces s multifaktoriálnym pozadím a významným etiologickým podielom dedičnej informácie [58]. Ukončenie „Projektu ľudského genómu“ (Human Genome Project) poskytlo výskumným tímom aj klinikom nové možnosti uplatnenia techník genetickej analýzy pri identifikáciu rizikových pacientov. V minulosti patrili medzi nozologické jednotky s objasnenou genetickou zložkou iba zriedkavé ochorenia, podmienené variáciou v jednom géne (napr. Brugada syndróm, Liddlov syndróm) [52]. Pozornosť sa v súčasnosti stále viac sústreďuje na odhaľovanie genetickej náchylnosti k bežným, multifaktoriálnym ochoreniam, s ktorými sa klinik stretáva v každodennej praxi [76]. Variácie génov pomerne často nie sú spojené priamo s AS KVS, ale ako ich markery sa podieľajú zlepšení diagnostiky a hodnotenia rizika pacienta. Ukázalo sa, že stupeň expresie určitých génov (množstvo detegovanej RNA alebo proteínu príslušného génu) odráža štádium ochorenia. Pokiaľ ide o asociáciu s určitými špecifickými klinickými podmienkami, ide o priame biomarkery týchto klinických stavov [34].

Pri identifikácii genetických markerov sa používajú štúdie kandidátnych génov, zamerané na jednotlivé gény oddelene a genomické štúdie, ktoré za zaoberajú výskumom genómu ako celku. Podľa dizajnu ich možno rozdeliť na dva hlavné typy:

• asociačné štúdie
• väzbové štúdie

Cieľom asociačných štúdií je demonštrovať, že určitý génový variant (obvykle SNP) je signifikantných rizikovým faktorom sledovaného patologického znaku (viď tab. 2). Výhodou asociačných štúdií je možnosť porovnávacích analýz v rámci rodín aj medzi podsúbormi pacientov verzus kontrol. Cieľom je testovať predpoklad asociácie ochorenia s predurčeným génom resp. setom génov (ide o tzv. „kandidátne gény“). Nevýhodou tohto dizajnu je, že asociáciu demonštrovanú v jednej štúdií sa obvykle nepodarí potvrdiť v nadväzujúcich projektoch [162]. Z množstva faktorov, ktorá sa podieľajú na nesúrodnosti dát, zohráva najvýznamnejšiu úlohu inkonzistencia v definovaní chorobných fenotypov, nedostatočná veľkosť súborov, etnický profil sledovanej populácie (frekvencia SNP značne varíruje v jednotlivých etnikách), falošne pozitívne a falošne negatívne asociácie a stratifikácia populačnej vzorky [34].

Jedným z prístupov na odstránenie uvedených nepresností je identifikácia skupín markerov, prenášaných v rodinách resp. v populácií spolu. Tieto súbory variácií sa označujú ako haplotypy (súbor variantov, prítomných na jednom chromozóme) [40]. Ľudský genóm tak môže byť usporiadaný podľa oblastí obmedzenej variability, ktoré za nazývajú „haplotypové bloky“ [29]. Haplotypové bloky pozostávajú obvykle z tisícov nukleotidov a zrejme zahŕňajú globálnu variabilitu dedičnej informácie [127]. Na detekciu bežných haplotypov je potrebných iba niekoľko, pre príslušný haplotyp špecifických SNP-ov. Tieto SNP sa nazývajú ako „značkové“ (tzv. „haplotype tag-SNP“) a sú pre každý haplotyp špecifické [127]. Ideálna je aplikácia haplotypov do dizajnov asociačných štúdií, čo by značne rozšírilo ich záber a tým aj validitu výstupov, pokrývajúc globálnu variabilitu genómu. V súčasnosti sú tag-SNP definované iba pre menšinu génov. Zmenu majú priniesť projekty typu haplotypová mapa (haplotyp map - HAP-MAP) a Národný kardiopulmohematologický inštitút (the National Heart, Lung, and Blood Institute - NHLBI) riadené Programy aplikácie celogenómového výskumu (Programs in Genomic Applications - PGA), zamerané na celogenómové mapovanie kľúčových tag-SNP. Haplotypová asociačná analýza po prebratí nových výkonných a pritom cenovo dostupných techník zrejme nahradí terajšie analýzy asociácií individuálnych SNP. Medicínsky význam celogenómového prístupu sa podarilo demonštrovať v štúdii, definujúcej gény spojené so zvýšenou náchylnosťou (susceptibilitou) k infarktu myokardu (IM) [109].

Druhou formu výskumu sú väzbové štúdie („linkage studies“), často aplikované celogenómovo. Cieľom je identifikovať oblasti chromozómov - lokusov, ktoré môžu obsahovať gény, zodpovedné za príslušné ochorenie. Rozdiely oproti asociačnému dizajnu sú zhrnuté v tab. 1.

Na rozdiel od asociačných štúdií, vyžaduje dizajn väzbových štúdií porovnanie údajov z DNA pokrvne príbuzných jedincov na detekciu lokusov, ktoré sú dedené nenáhodne (t.j. v rodinách) vo vzťahu k sledovanému ochoreniu. Výhodou tohto typu štúdií je, že nie je a priori potrebná vstupná hypotéza, predkladajúca konkrétne genetické determinanty ochorenia [52]. Regióny (lokusy), identifikované väzbovými štúdiami, však obvykle zahŕňajú milióny bázových párov a stovky génov. Preto sa následne uskutočňujú asociačné analýzy jednotlivých génov v rozsahu pozitívneho väzbového signálu, s cieľom overiť asociáciu lokusu s ochorením a identifikovať konkrétne variácie génov, zodpovedných za túto asociáciu. Ide o časovo aj finančne náročný proces, ktorý bol už niekoľkokrát aplikovaný úspešne. Uskutočnili sa aj celogenómové štúdie asociačného typu [34]. Veľké nádeje sú v tomto prípade vkladané do identifikácie haplotyp-špecifických-SNP pre celý genóm, čím sa zníži náročnosť celogenómových štúdií s asociačným a stanú sa dominantnou metódou pri definícii patogénnych alelových variácií [127].

Genetické markery sú varianty (alely) v kóde DNA, ktoré sú samostatne alebo v kombinácii s inými faktormi spojené s prítomnosťou špecifického patologického znaku. V prípade monogénových ochorení umožňujú genetické štúdie priamočiare stanovenie klinickej diagnózy prostredníctvom analýzy DNA stanovenia expresie génu pomocou reverzné polymerázové reťazové reakcie (real time polymerase chain reaction - RT-PCR) resp. „Western blotting“ (analýzy proteínových produktov génov).

Pre multifaktoriálne, polygénové ochorenia s vysokou prevalenciou je však identifikácia genetických markerov oveľa obtiažnejšia. Interaktívna „sieť“, pozostávajúca z množstva génov, je veľmi rozsiahla a podmieňuje rozvoj chorobného stavu komplexne, zahŕňajúc navyše interakcie genetických, environmentálnych a fyziologických vplyvov. Obzvlášť to platí pre kardiovaskulárne ochorenia ako je napr. srdcové zlyhanie, kedy sa ako významný ukázal komplexný prístup sledovania genómu ako celku [143] v záujme urýchliť hľadanie genetických faktorov polygénnych ochorení sa aplikujú rôzne techniky, vrátane genómových skenov, mikročipových profilov expresie génov (tzv. „microarray gene profiling) a RT-PCR (polymerázová reťazová reakcia s použitím reverznej transkriptázy) [60]. Popri štúdiu na ľudských populáciách má aj v humánnej genetike naďalej nezastupiteľnú pozíciu výskum s použitím zvieracích modelov [22].

Viaceré známe markery s významným diagnostickým a prognostickým potenciálom pre kardiovaskulárne ochorenia sú zhrnuté v tab. 2. Markery, ktorých prítomnosť je spojená s vysokou pravdepodobnosťou ochorenia (tzv. vysokoprediktívne faktory), by mohli byť užitočné v diagnostickom procese, ako aj pri odhade prognózy ochorenia či účinnosti terapie. Markery s malou prediktívnou epidemiologickou silou môžu zas poskytovať nové poznatky o patofyziológii ochorenia alebo o nových možnostiach liečby [52,80]. Niektoré variácie majú funkčný dopad zmenou expresie alebo štruktúry produktu jedného až viacerých génov, podieľajúcich sa na rozvoji ochorenia. Naopak markery bez vplyvu na funkciu sú pomerne často lokalizované v blízkosti variantov s funkčným dopadom tak, že v populácii s často dochádza k ich spoločnému prenosu medzi generáciami (tzv. väzbová nerovnováha - linkage disequilibrium). Uvedená skupina markerov má nielen prediktívnu hodnotu, ale umožňuje tiež odhaľovanie variantov s priamym patologickým efektom na príslušný gén, s ktorým sa spoločne prenáša. Vysoká pozornosť sa venuje už vyššie spomenutým jednonukleotidovým polymorfizmom (SNP), najmä vďaka nenáročným postupom ich stanovenia a vysokej frekvencie ich výskytu v ľudskom genóme [18]. V súčasnosti prichádzajú stále nové informácie o ďalších genetických markeroch jednotlivých štádií aterotrombózy, pričom nové poznatky by mali pomôcť pochopiť dedičnosť a patofyziológiu s dopadom na klinickú prax a zlepšením prognózy, prevencie a liečby kardiovaskulárnych ochorení na podklade aterosklerózy (viď tab. 3)

Za „zlatý štandard“ genetického výskumu u človeka boli tradične považované štúdie na dvojičkách (gemelilogický výskum) [136]. Fenotypové rozdiely u identických dvojčiat odrážajú vplyv odlišných faktorov prostredia, zatiaľ čo dizygotné dvojčatá môžu byť použité na výskum malých genetických rozdielov, keďže sú často, najmä v detstve, vystavované podobným environmentálnym vplyvom [18]. Štúdie na dvojičkách priniesli množstvo nových poznatkov aj o genetickej báze kardiovaskulárnych ochorení. Touto metódou bola prvýkrát demonštrovaná dedivosť krvného tlaku. Ďalším príkladom je úspešná aplikácia gemelilógie v štúdiách, testujúcich špecifické polymorfizmy angiotenzín II konverzjúceho enzýmu (ACE) vo vzťahu k hypertrofii myokardu resp. k infarktu myokardu. Iným príkladom výskum na dvojičkách v projektoch, objasňujúcich význam génu, kódujúceho peroxyzómovým proliferátorom aktivovaný receptor - PPAR ako aj ďalších génov v patogenéze obezity [88].

Jedným z najdôležitejších aspektov, určujúcich úspešnosť a reproducibilitu asociačných aj väzbových štúdií, je zadefinovanie sledovaného ochorenia resp. znaku (fenotypu). Obzvlášť to platí pre polygénne choroby, bežne sa vyskytujúce v populácii. Ako príklad možno spomenúť hypertenziu, ktorá je definovaná ako výška krvného tlaku nad 140/90 mm Hg. Z pohľadu genetiky však ide o hrubú charakteristiku patologického znaku, ktorá môže v analýzach pôsobiť ako mätúci faktor, keďže sa predpokladá značná heterogenita príčin vysokého krvného tlaku. Príčiny sú dané súhrou množstva genetických aj environmentánych faktorov v čase a priestore. Doterajšie genómové analýzy, hľadajúce „gén hypertenzie“ nepriniesli vzhľadom na nesúrodosť dát veľa svetla do tejto problematiky [115]. Tieto fakty iba dokumentujú kritický význam dôslednej definície skúmaného fenotypu, čo možno dosiahnuť jeho detailným patofyziologickým výkladom. Tak napríklad inzulínová rezistencia resp. senzitivita je často definovaná prostredníctvom glykémie nalačno, inzulinémie nalačno alebo pomocou indexov, vypočítaných z týchto parametrov, ktoré sú pomerne dostupné aj pre populačný výskum [64]. Ani tieto ľahko získateľné parametre však nie sú tak spoľahlivé, ako priame meranie inzulínovej senzitivity (predovšetkým intravenózny test glukózovej tolerancie a hyperinzulinemická euglykemická zámka), používané v rámci patofyziologických štúdií. Detailná definícia znaku vedie k odhaleniu fyziologických súvislostí, ako je to v prípade demonštrácie zdieľanej genetickej kontroly pre výšku krvného tlaku aj inzulínovej senzitivity [172]. Aplikácia euglykemickej svorky ako markera inzulínovej senzitivity spolu s vyššie opísaným haplotypovým prístupom umožnila identifikáciu génu lipoproteínovej lipázy ako markera inzulínovej senzitivity [39]. Ide o využitie tzv. „intermediárnych fenotypov“, čo sú skoré, subklinické štádiá patologických znakov, ktoré sa manifestujú v prirodzenom priebehu ochorenia [72]. Medzi detailne zadefinované fenotypy patrí odpoveď plazmatických hladín aldosterónu na infúziu angiotenzínu II pri hypertenzii (odlíšenie tzv. modulujúceho a non-modulujúceho fenotypu) a veľkosť LDL častíc pri dyslipidémii [3,123]. Znak tzv. „non-modulácie“ sa vyznačuje neschopnosťou angiotenzínu II regulovať sekréciu aldosterónu a prietok krvi obličkami u časti pacientov s esenciálnou hypertenziou. Novšie práce demonštrovali asociáciu tohto fenotypu s genotypom M235T v lokuse pre angiotenzinogén [55]. Ďalším príkladom intermediálneho fenotypu je vysoký výskyt zvýšenej koncentrácie voľného kortizolu v moči pri hypertenzii s nadmernou senzitivitou na prívod soli [84]. Pre aterosklerózu je referenčným intermediárnym fenotypom endoteliálna dysfunkcia. Analýza genetického pozadia v intermediárnych štádiách ochorenia je pomerne výhodná, keďže tieto štádiá sú obvykle detegovateľné u mladých, zdravých jedincov, bez anamnézy predchádzajúcej manifestácie ochorenia. Navyše samotný chorobný proces často spôsobuje sekundárne zmeny v sledovanom fenotype, čo môže výrazne ovplyvniť jeho vzťah ku genetickým markerom [143].

Monogénové kardiovaskulárne ochorenia

Výrazný progres sa zaznamenal v oblasti výskumu monogénových kardiovaskulárnych ochorení, manifestných vo forme hyperlipidémie, hypertenzie, hypertrofie myokardu alebo náhlej smrti [20,100,132,158]. Objasnenie patogenézy týchto zriedkavých, ale dramatických príkladov dedičnosti porúch v kardiovaskulárnom systéme poskytla nové poznatky implikovateľné do všeobecnej patogenézy kardiovaskulárnych chorôb resp. asociovaných stavov. Pilotná práca Browna a Goldsteina [37], zaoberajúca sa touto problematikou, prvýkrát charakterizovala molekulárnu bázu familiárnej hypercholesterolémie. Išlo o prevratný projekt, ktorý odhalil vzťah medzi perturbáciou metabolizmu cholesterolu, aterosklerózou a postihnutím koronárnych artérii na podklade aterotrombózy. Identifikácia kľúčových mutácií v géne pre LDL receptor, zodpovedných za vznik tejto metabolickej odchýlky, viedla k objavu 3-hydroxy, 3-metyl glutarylkoenzýmu A (hydroxymethyl-glutaryl Conezym A - HMG CoA - reduktázy, kľúčového regulátora metabolizmu cholesterolu. Tento poznatok následne poskytol priestor pre vývoj inhibítorov HMG CoA reduktázy (statínov), ktoré kompletne zmenili pohľad na terapiu kardiovaskulárnych ochorení na podklade aterosklerózy [67]. Deskripcia ďalších typov dedičných dyslipidémií (Tangierova choroba, sitosterolémia) umožnila pochopiť väčšinu mechanizmov cholesterolového transportu a metabolizmu [87,114]. Popis kľúčových metabolických dráh patogenézy monogénnych foriem dyslipidémií môže definovať genetické markery, ktoré by mohli byť rovnako relevantné pre bežnejšie, polygénne podmienené poruchy metabolizmu lipidov.

Objasnenie molekulárnej podstaty familiárnej hypertrofickej kardiomyopatie umožnilo detailný popis fundamentálnej patogenézy hypertrofie myokardu [128]. Aj keď je klinický korelát tohto fenotypu zameraný na všeobecné známky komorovej hypertrofie, je už dnes dokázaná expresia tuctov mutácií viac než desiatich rôznych sarkomérových proteínov v sprievode tohto kardiovaskulárneho end-pointu. Naproti tomu, určitá mutácia môže podnietiť rozvoj niekoľkých odlišných klinických fenotypov u rôznych príbuzných [128]. Uvedené pozorovania naznačujú prídatný efekt modulujúcich génov a environmentálnych vplyvov, určujúcich charakter exprimovaného fenotypu monogénových porúch a získaných komorbidít [18,143]. Objavy ako tento sú zdrojom dôležitých informácií, ktoré zdôrazňujú význam genetickej heterogenity zdanlivo jednotných klinických fenotypov, ako je ventrikulárna hypertrofia myokardu. Navyše ide o zistenia, podčiarkujúce signifikanciu komplexných interakcií medzi génmi navzájom resp. génov s prostredím, ako aditívnych determinantov klinickej manifestácie genetického faktora.

Ďalšie dôležité poznatky o patomechanizmoch kardiovaskulárnych rizikových faktorov priniesli štúdie monogénnych foriem hypertenzie [81]. Systematická analýza rodín s elevovaným resp. zníženým krvným tlakom definovala aspoň desať monogénne podmienených porúch. Zaujímavým bolo zistenie, že molekulárne charakteristiky týchto foriem hypertenzie sú v súlade s dlho známym Guytonovým modelom regulácie krvného tlaku a homeostázy sodíka, zameraných na obličky ako ústredný patofyziologický element. Vo všeobecnosti väčšina monogénnych porúch, narúšajúcich homeostázu krvného tlaku zahŕňa gény pre zložky renín-angiotenzín-aldosterónového systému a tiež pre dráhy iónového transportu. Detailné objasnenie príslušných patogenetických dráh môže následne viesť k odhaleniu ďalších génov a ich variácií, ktoré sa podieľajú na expresii polygénnych chorôb kardiovaskulárneho systému.

Genetické markery polygénnych foriem kardiovaskulárnych ochorení

Progres v definovaní genetického základu komplexných patologických znakov ako je hypertenzia, dyslipidémia a ateroskleróza je značne brzdený jednak komplexným charakterom ich patobiológie, jednak relatívne slabou výťažnosťou metód, využívaných v súčasnosti v klasickej genetike na identifikáciu monogénnych fenotypov. Ako už bolo spomenuté, vo svetovej literatúre je dostupných viac než tisíc publikovaných asociácií 1 - 2 SNP v 1 - 2 kandidátnych génoch s klinickými korelátmi kardiovaskulárnych ochorení (ICHS), ako aj s ich rizikovými faktormi ako je hypertenzia, parametre lipidového profilu, komorová hypertrofia. Dizajn väčšiny týchto štúdií však má viacero závažných nedostatkov, postrádajú adekvátnu štatistickú silu a pomerne často zlyháva ich potvrdenie v následných konformačných štúdiách [148]. Pri snahách detekovať signifikantnú koreláciu medzi konkrétnym SNP a špecifickým chorobným stavom existuje niekoľko obmedzení. Asociácia musí vykazovať dostatočnú silu a/alebo sa sledovaná alela musí byť v populácii s dostatočnou frekvenciou. Zriedkavé SNP na detekciu vyžadujú veľmi silnú prediktívnu hodnotu vo vzťahu k riziku rozvoja ochorenia, aj keď tieto alely sú v typickom prípade už identifikované prostredníctvom väzbovej analýzy [58]. SNP výrazne rozšírené v populácii sú preto užitočnejšie pri výskume kandidátnych génov, čo je však spojené s opomenutím vysoko rizikových variácií s nízkou frekvenciou výskytu. Navyše mnoho štúdií, ktoré uprednostnili 1 - 2 SNP pred analýzou haplotypov, definovaných na základe väzbovej nerovnováhy, nedokázalo adekvátne zhodnotiť význam sledovaného lokusu kandidátneho génu v roli rizikového faktora toho-ktorého ochorenia. Pri takých komplexných znakoch ako je aterotrombóza sa predpokladá len mierny resp. aditívny podiel každého zo setu zainteresovaných genetických markerov na náchylnosti k ochoreniu, čo len potvrdzuje inkonzistencia výsledkov ukončených projektov [143].

S postupným vývojom budú investigátori pravdepodobne opäť najviac profitovať z poznatkov, získaných v prvej generácii asociačných štúdií komplexných znakov. Do blízkej budúcnosti sú naplánované štúdie, zahŕňajúce klinické investigátorské siete a operujúce s jednotnými, štandardnými protokolmi fenotypov. Tento prístup má umožniť štandardizáciu dizajnovania rozsiahlych štúdií typu „case-control“, s dobre definovanou populáciou a použitím nových, vysoko efektívnych technológií genotypizácie. Vývoj databáz haplotypov pre kandidátne lokusy po celom genóme a značkovaných pomocou „tag-SNPs“, popri pokrokoch dosiahnutých v bioštatistike a bioinformatike uľahčí kvantifikáciu relatívneho podielu jednotlivých markerov na susceptibilite ku komplexným, multigénovým kardiovaskulárnym chorobám [89].

Novšie štúdie už započali implikáciu týchto postupov do kardiovaskulárnej medicíny. Ako príklad môže slúžiť projekt japonských investigátorov, ktorý u 2 819 pacientov s anamnézou IM a u 2 242 nepokrvných kontrol vybrali na genotypizáciu 112 polymorfizmov v 71 kandidátnych génoch. So zvýšeným rizikom IM boli asociované varianty v troch génoch: konexín-3, inhibitor plazminogénového aktivátora-1 a stromelyzín-3. Naznačuje to význam týchto variantov pre stratifikáciu rizika pacienta pred začatím preventívnych liečebných opatrení [174]. Iná štúdia analýzou variácií 62 kandidátnych génoch u pacientov s včasným rozvojom IM v osobnej anamnéze identifikovala ako silné rizikové markery polymorfizmy v génoch pre troch členov rodiny trombospondínu [152]. S postupnou kumuláciou reproducibilných dát budú môcť tieto markery nájsť uplatnenie aj pri stanovovaní kardiovaskulárneho rizika v bežnej klinickej praxi (viď tab. 1).

Farmakogenetika: terapia „šitá na mieru“?

Doteraz diskutované genetické markery boli zamerané na predikciu náchylnosti ku vzniku ochorenia. Farmakogenetika je veda, zaoberajúca sa výskumom genetických variant, ktoré ovplyvňujú odpoveď jedinca na farmakoterapiu. Funkčné varianty v génoch, kódujúcich enzýmy zodpovedné za metabolizmus liečiv, liekové transportéry a cieľové molekuly farmák, sú schopné modulovať farmakodynamiku a možno im pripísať značnú časť klinicky evidentnej interindividuálnej variability účinnosti/tolerancie preparátov u exponovaných pacientov. Genetické varianty môžu tiež vplyvom na expresné profily a/alebo funkčnosť proteínov, modulujúcich priebeh samotného chorobného procesu, modifikovať pomer terapeutického a potenciálne nežiaduceho efektu sledovanej intervencie v získaných podskupinách pacientov. Tak napríklad varianty adrenergných receptorov môžu mať vplyv na rozsah neurohumorálnej aktivácie sympatiku počas srdcového zlyhania [134]. V minulosti bola pozornosť farmakogenetiky venovaná predovšetkým liekovej toxicite. Súčasným hlavným cieľom je identifikácia genetických podkladov diverzity terapeutickej výťažnosti liečiv s následnou racionálnou selekciou pacientov, vhodných pre tú-ktorú intervenciu. Na potencionálny význam tejto vedy poukazuje aj neustále vzrastajúca prevalencia kardiovaskulárnych ochorení na podklade aterosklerózy v západných krajinách. Poznatky farmakogenetiky majú už teraz potenciál poskytnúť vyšší benefit kardiovaskulárnej terapie u miliónov ohrozených probandov prostredníctvom maximalizácie účinnosti preparátov a/alebo minimalizácie liekmi podmienenej morbidity.

Za posledné roky bolo zrealizovaných niekoľko štúdií, zameraných na farmakogenetiku kardiovaskulárnych ochorení na podklade aterosklerózy a modifikácie rizikových faktorov. Príkladom je interindividuálna variabilita účinnosti terapie statínmi na hladiny lipidov. Taq1 polymorfizmus v intróne 1 génu pre cholesterol-ester transferový proteín, je spojený s alteráciou koronarografiou detegovanej odpovede na pravastatín [77]. The Lipoprotein and Coronary Atherosclerosis Study demonštrovala u nositeľov delečnej alely D polymorfizmu inzercia/delécia (I/D) v géne pre angiotenzín I konvertujúci enzým (ACE) výraznejšiu odpoveď na terapiu fluvastatínom v podobe angiograficky dokumentovanej regresie koronárnej aterosklerózy [92]. V ďalšej štúdii bola homozygotnosť delečnej alely tohto polymorfizmu asociovaná s lepšou antihypertenzívnou odozvou na terapiu inhibítormi ACE [139]. Rovnako sa ukázal vplyv daného polymorfizmu na antihypertenzívny efekt hydrochlorotiazidu [133]. Iným príkladom je gén estrogénového receptora α. Jeden z intrónových polymorfizmov tohto génu bol spojený s vplyvom na hladiny HDL a E-selektínu v krvi, čo sú dva faktory s významným uplatnením v procese aterogenézy [48,49]. Niekoľko štúdií tiež potvrdilo účinok polymorfizmov apolipoproteínu E na citlivosť hladín lipidov voči liečivám [47,112]. V nasledujúcom období sa očakáva vzostup významu prediktívnych genetických markerov rizika ochorenia resp. účinnosti terapie v procese prevencie a liečby kardiovaskulárnych ochorení na podklade aterosklerózy, ako integrálna súčasť kardiovaskulárnej medicíny.

Závery

Výskum genetických markerov ochorení smeruje ku genomike (veda, zaoberajúca sa interakciami medzi génmi a prostredím, resp. génmi navzájom) a proteomike (veda o proteínových produktoch génov). Použitím nových metodík (napr. expressed sequenced tag - EST, metóda značkujúcich sekvencii expresie) sa získali informácie o množstve génov prekladaných do bielkovín v kardiovaskulárnom systéme za rôznych patologických podmienok [61]. V kardiovaskulárnom systéme bola zistená expresia asi 27 000 rôznych RNA, ktorých gény sú podľa umiestnenia na chromozóme zoskupené do tzv. klastrov [10,25]. V súčasnosti je tiež dostupný celý rad metód na kvantifikáciu a analýzu stupňa expresie RNA na úrovni celého genómu (DNA mikročipy, sériová analýza génovej expresie - SAGE). Expresia kódujúcich sekvencií celého genómu človeka môže byť vyšetrená na čipe rozsahu kreditnej pomocou rýchlej, efektívnej a finančne čoraz viac dostupnej metodiky. Ide o globálnu analýzu, ktorá predstavuje skok oproti tradičnému prístupu separátneho výskumu génov a umožní objasniť, ako proteínové produkty vytvárajú interaktívne siete, regulujúce najkomplexnejšie procesy v živom organizme [9,73,176].

Vyššie spomenuté technológie sľubujú detailnú identifikáciu molekulových dráh, zakomponovaných v patogenéze kardiovaskulárnych chorôb, upresnenie cieľov existujúcich liečiv a objavy cieľov pre nové liekové preparáty. Predpokladá sa napríklad, že angiotenzín II aktivuje niekoľko signálnych dráh, ktoré urýchľujú aterotrombózu a finálne štádiá ICHS. Uplatnením genomiky je možné tieto dráhy detailne popísať s identifikáciou nových cieľových génov, ktoré sú zodpovedné za kardiotoxicitu angiotenzínu [19]. Nedávno ukončené štúdie použili genomický prístup pri odlíšení rôznych foriem srdcového zlyhania, ako aj na detekciu molekulárnych zmien, vznikajúcich pri restenóze koronárnej artérie [60,95]. V inej štúdii boli použité mikročipy, ktoré porovnávali profil expresie prevažne „kardiovaskulárnych génov” v rôznych štádiách embryonálneho vývinu alebo v podmienkach hypoxie [153,154].

V prípade paralelného monitoringu množstva génov je možné detegovať expresné profily ako biomarkery určitého ochorenia resp. jeho štádia (niektoré klastre génov sú exprimované nadmerne a iné tlmene). Použité mikročipy môžu sledovať genóm v celku alebo sú prispôsobené na detekciu génov istej podskupiny (napr. génov pre apoptózu). Najnovšie boli tieto postupy použité pri detekcii chorobných profilov expresie v cirkulujúcich zápalových krvných elementoch, ktoré sú v kontakte so všetkými tkanivami a prenášajú v genóme informácie o ich patofyziologickom stave. Je známe, že zápalové bunky majú kľúčový význam v procese ruptúry AS plaku a reparácie tkanív v rámci akútnych ischemických syndrómov. Logicky tak reprezentujú telesný barometer homeostázy, ako aj odpovede organizmu na environmentálne noxy. Stratégia genomiky imunokompetentných buniek by teda mala priblížiť príslušné pochody aterotrombózy s odhalením ešte hodnotnejších markerov prognózy kardiovaskulárnych ochorení na podklade aterosklerózy [6,26,94,90,108,171].

Napriek veľkému záujmu o genóm a jeho funkčnú charakteristiku, vlastné uplatnenie genetickej informácie prebieha až na úrovni proteínu. Už dnes je dokázané, že z asi 30 000 génov sa v našich telách exprimuje viac do než 120 000 rôznych bielkovín a funkčnosť každej z nich môže byť dramaticky alterovaná posttranslačnými úpravami ako je fosforylácia, oxidácia, glykozylácia, ubikvitinylácia alebo nitrozylácia. Funkčnosť proteínov je ďalej dolaďovaná ich vzájomnými interakciami a lokalizáciou v bunke. Proteomika sa zaoberá vyššie spomínanými pochodmi a predstavuje ďalší zlom v molekulárnom výskume. Napriek relatívne mladej histórii tejto vedy už bola započatá analýza proteómu aj z pohľadu medicíny. Integrácia výkonných DNA mikročipov a proteomiky s doterajšími medicínskymi metódami (berúc do úvahy aj finančné hľadisko) a s vysoko senzitívnymi zobrazovacími metódami predpovedá ich veľký potenciál pre manažment pacienta v kardiovaskulárnej medicíne 21. storočia.

MUDr. Andrej Teren

II. interná klinika LF UK a FNsP

Mickiewiczova 13

813 69 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: ateren@hotmail.com

Doručeno do redakce: 23. 10. 2005

Přijato po recenzi: 17. 1. 2007