Koagulační aktivita a doba účinku rekombinantního faktoru IX po vazbě s Fc fragmentem imunoglobulinu

Recyklace vlastních protilátek

Hemofilie B je dědičné onemocnění vázané na chromozom X. Nemocní s deficitem funkčního koagulačního faktoru IX (FIX) jsou ohroženi krvácením spontánním nebo po běžných poraněních, zejména u těžké hemofilie s aktivitou FIX < 1 %. Léčba spočívá v parenterální aplikaci purifikovaného plazmatického nebo rekombinantního FIX. Profylaxe vyžaduje infuze 2−3× týdně, léčba závažného krvácení i každodenní aplikaci.

Jednou z možností, jak prodloužit biologický poločas FIX a tím interval mezi infuzemi, je rekombinantní fúzní protein rFIXFc. Jedná se o rekombinantní faktor IX (rFIX) kovalentně vázaný s Fc fragmentem lidského imunoglobulinu G (IgG). Fc doména IgG se váže na tzv. neonatální Fc receptor. Ten v placentě zajišťuje transfer IgG matky do krevního oběhu plodu. Postnatálně exprimovaný endotelovými buňkami či monocyty Fc receptor chrání IgG před degradací intracelulárně v lysozomech a zajišťuje jejich návrat extracelulárně. rFIXFc tak využívá mechanismus, který „recykluje“ tělu vlastní protilátky. V klinických studiích fáze III byl průměrný poločas rFIXFc prodloužen na 82,1 hodiny oproti 33,8 hodiny u rFIX (p < 0,001).

Práce z roku 2016 odpovídá na otázku, zda vazba na Fc fragment ovlivňuje funkce FIX v koagulační kaskádě, nebo koagulační efekt in vivo.

Aktivace a enzymatická aktivita FIX

Za aktivaci je zodpovědný faktor XIa nebo komplex faktoru VIIa a tkáňového faktoru (FVIIa/TF). Působením některé z těchto proteáz proběhne dvojí štěpení FIX za vzniku aktivovaného faktoru IXa (FIXa). Následně na fosfolipidech membrány trombocytů vytváří FIXa komplex s faktorem VIIIa. Takto vzniklá proteáza má schopnost štěpit faktor X za vzniku aktivovaného faktoru Xa.

Autoři studie uspořádali několik in vitro testů zaměřených na jednotlivé kroky uvedeného procesu:

• aktivace FIX faktorem XIa,
• aktivace FIX komplexem FVIIa/TF,
• interakce FIXa s fosfolipidy,
• „ochota“ k tvorbě komplexu s faktorem VIIIa,
• rychlost štěpení faktoru X,
• inhibice FIXa antitrombinem.

Ve všech testech, včetně kinetiky aktivace faktoru X a inhibice FIXa antitrombinem, vykazoval rFIXFc zcela srovnatelné výsledky s rFIX.

Přítomnost aktivované složky v rFIXFc

Léčiva obsahující rFIX obsahují vždy určité množství aktivovaného rFIXa. Další test byl proto zaměřen na stanovení aktivovaného faktoru IX v preparátu rFIXFc.

Přípravek s neaktivovaným rFIXFc má dle provedeného testu asi 35–40× nižší schopnost štěpení faktoru X ve srovnání s rFIX. To je dáno vyšší příměsí aktivované složky v běžně používaném roztoku rFIX, dle literatury se jedná o 0,11 %. Přípravek s rFIXFc obsahuje pouze 0,013 % aktivované složky.

Tvorba trombinu

V plazmě s deficitem faktoru IX, doplněné o tkáňový faktor a fosfolipid, rFIX nastartoval rychlejší tvorbu trombinu ve srovnání s rFIXFc. Také výsledná hladina trombinu byla při použití rFIX asi 2× vyšší.

Test byl zopakován s použitím rFIX, který byl zbaven nežádoucí příměsi aktivovaného faktoru IX. Rychlost tvorby trombinu se pak nelišila u rFIX a rFIXFc, stejně tak i celkové množství trombinu.

Prodloužená aktivita rFIXFc

K ověření, zda se delší biologický poločas odrazí i v prodloužené účinnosti rFIXFc, byl myším s hemofilií B podán rFIX a rFIXFc v různých koncentracích. Koagulační poměry byly hodnoceny v čase pomocí tromboelastometrie. V čase 5 minut a 24 hodin byly hodnoty srovnatelné. Následoval prudký pokles měřitelného účinku u rFIX, a to i při zdvojnásobení dávky, zatímco u rFIXFc přetrvával významně déle a efekt byl měřitelný ještě v čase 240 hodin.

In vivo bylo traumatické krvácení u myší s hemofilií B simulováno incizí ocasní žíly. Myším byl podán intravenózně faktor IX ve 4 různých dávkách, od 4 IU/kg do 120 IU/kg. Po aplikaci rFIX byla incize provedena za 24 hodin, zatímco po podání rFIXFc až za 72 hodin – k ověření hypotézy o trojnásobném prodloužení profylaktického efektu rFIXFc.

Přežití myší bylo v obou skupinách obdobné. Srovnatelná byla i efektivní dávka (ED₅₀): 17,8 IU/kg u rFIXFc vs. 15,4 IU/kg u rFIX.

Léčba akutního krvácení u myší s hemofilií B

Závažné tepenné krvácení či krvácení při chirurgickém výkonu vyžaduje vysoké dávky FIX. U myší je simulováno zastřižením ocasu. rFIX a rFIXFc byl aplikován před výkonem v dávkách od 40 do 720 IU/kg. Podáním rFIX i rFIXFc byla statisticky významně snížena krevní ztráta ve srovnání s neléčenými jedinci. Ztráta krve a procento přeživších myší po aplikaci rFIX byly zcela srovnatelné s aplikací rFIXFc.

Závěr

Navázání imunoglobulinového Fc fragmentu na rekombinantní faktor IX vede k prodloužení biologického poločasu a tomu odpovídajícímu prodloužení profylaktického efektu. Přitom fúze s Fc fragmentem nijak nesnižuje celkovou aktivitu rekombinantního faktoru IX ani neovlivňuje dílčí funkce v koagulační kaskádě.

(thr)

Zdroj: Toby G. G., Liu T., Buyue Y. et al. Recombinant factor IX Fc fusion protein maintains full procoagulant properties and exhibits prolonged efficacy in hemophilia B mice. PLoS One 2016; 11 (2): e0148255, doi: 10.1371/journal.pone.0148255.