Srovnávací analýza ztráty heterozygozity (LOH) a profilu exprese v normální tkáni, DCIS a v tkáni invazivního karcinomu prsu

Súhrn

Cíl studie:
Charakterizovat rozdíly v molekulárních parametrech (expresi genů a LOH) u DCIS a invazivního karcinomu prsu.

Typ studie:
Originální práce.

Název a sídlo pracoviště:
Onkogynekologické centrum, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha.

Materiál a metodika:
Analyzována byla ztráta heterozygozity (LOH) ve třech genech: BRCA1, BRCA2 a p53; a exprese genů VEGF a Bcl-2 ve vzorcích DCIS a invazivního karcinomu prsu. K analýze byla použita čerstvě zmražená tkáň po evaluaci patologem.

Výsledky:
Analýza molekulárně-genetického profilu byla provedena ve vzorcích tří typů tkání: zdravé mléčné žlázy (65 vzorků), DCIS (25 vzorků) a invazivního karcinomu prsu (42 vzorků). U vzorků invazivních karcinomů prsu byl LOH v genu BRCA1 přítomen ve 22,3 %, v genu BRCA2 ve 32,1 % a v genu p53 ve 35,6 %. U DCIS byl LOH v genu BRCA1 ve 13,4 %, v genu BRCA2 ve 14,1 % a v genu p53 ve 33,2 %. VEGF byl zvýšeně exprimován u 15,3 % invazivních nádorů a u 8,3 % DCIS. Zvýšená exprese Bcl-2 byla pozorována u 13,2 % invazivních nádorů a u 7,1 % DCIS.

Závěr:
V této práci jsme potvrdili, že určitá část DCIS má molekulární vlastnosti schodné s invazivním karcinomem. Tyto molekulární změny by mohly sloužit jako potenciální markery možnosti vývoje DCIS v invazivní karcinom, nebo identifikovat skupinu DCIS s latentní invazí.

Klíčová slova:
karcinom prsu, DCIS, LCIS, p53, BRCA1, BRCA2, Bcl-2, VEGF.

ÚVOD

Žena s diagnózou duktálního carcinoma in situ je považována za rizikovou ve vztahu k vývoji invazivního karcinomu prsu. Takováto progrese však nastává pouze u určité části pacientek (literární údaje se výrazně rozcházejí v rozmezí 25-75 %) [2, 5]. Neznalost přesných prognostických a prediktivních faktorů vedla v minulosti, ale i v současnosti, k široké variabilitě léčebných postupů od prosté observace až k doporučení mastektomie.

Cílem molekulárně biologického výzkumu charakteristik preinvazivních lézí prsu a srovnání s normální tkání a tkání invazivního karcinomu je pomocí dostupných laboratorních metod identifikovat konkrétní pacientky, jejichž riziko vývoje invazivního nádoru na základě již zjištěné preinvazivní léze je vysoké, a ovlivnit tak klinické rozhodování. U žen s vysokým rizikem vývoje karcinomu z preinvazivní léze pak připadá v úvahu kromě pečlivé dispenzarizace provedení profylaktických operací nebo chemoprofylaxe.

Výtěžnou informaci o potenciálu malignizace preinvazivní léze nelze zřejmě v budoucnu očekávat od jednoho nebo několika málo molekulárních markerů. Bude třeba vždy kombinovat detekci imunohistochemickou a FISH (tedy morfologickou) s analýzou molekulární (LOH, CGH, proteomika) a funkční (expresní profil, microarrays) [4, 10].

V oblasti terapie ukazuje molekulárně biologická analýza nádorů, že spíše než ovlivnění jednotlivých proteinů nebo struktur v buňce, bude efektivnější ovlivňovat jednotlivé kaskády [1, 3, 15].

V naší práci jsme se zaměřili na pět parametrů charakterizujících odlišné cesty buněčných pochodů (signalizace, stimulace růstu a dělení a apoptózy). Studovali jsme inaktivaci tumorsupresorových genů p53 (spuštění extrinsické cesty apoptózy), BRCA1 (spuštění intrinsické cesty apoptózy) a BRCA2 (reparace poškozené DNA); a expresi genů Bcl-2 (antiapoptotický faktor) a VEGF (vaskulární endoteliální růstový faktor).

Gen p53

Gen p53 je tumorsupresorový gen lokalizovaný na krátkém raménku 17. chromozomu. Protein p53 je klíčovým regulátorem buněčného cyklu a apoptózy. Alterace genu p53 jsou popisovány téměř u všech solidních nádorů. Předpokládá se, že výpadek funkce genu p53 nastává časně v procesu kancerogeneze.

Mutace genu p53 se objevují již u atypické duktální hyperplazie. Jejich výskyt v tkáni DCIS, zvláště komedo typu, přesahuje 20 %. Nejistý však stále zůstává klinický význam této alterace – zřejmě proto, že se nebude jednat o nezávislý predikční faktor, ale jeho význam bude signifikatní až ve spojení s poruchou dalších proapoptotických nebo protiapoptotických drah [8].

Geny BRCA1 a BRCA2

Tumorsupresory, jejichž proteinové produkty se účastní kontroly buněčného cyklu, kontroly integrity genomu a procesů reparace poškozené DNA.

Prevalence hereditárních mutací genů BRCA1 a BRCA2 v populaci pacientek s DCIS a LCIS se pohybuje mezi 4-6 %, tj. na dolní hranici rozmezí odhadovaného pro ženy s invazivním karcinomem (5-8 %). U žen s mutací se DCIS vyskytuje stejně jako invazivní karcinom v signifikantně nižším věku než v normální populaci (o 10-15 let dříve). Výskyt preinvazivních lézí byl však téměř výlučně pozorován v rodinách s výskytem hereditárního karcinomu prsu. V rodinách, kde se vyskytoval karcinom prsu i vaječníků, nebylo zaznamenáno signifikantní zvýšení výskytu DCIS nebo LCIS.

Proteinový produkt genu BRCA1 hraje významnou roli ve spuštění vnitřní, intrinsické, kaskády apoptózy, především rozeznáním neopravitelného poškození DNA nebo mitotického vřeténka.

Proteinový produkt genu BRCA2 je významnou součástí komplexů, které se vážou na dvouvláknové zlomy DNA a opravují je mechanismem homologní reparace, tzn. že přesně vytvoří poškozený řetězec DNA podle komplementárního vlákna. Jde o poměrně přesný mechanismu (na rozdíl například od nehomologního spojování zlomených konců, nonhomologous end joining – NHEJ), který brání vniku mutací v řetězci DNA [12].

Gen Bcl-2

Gen Bcl-2 je lokalizován na dlouhém raménku 18. chromozomu. Jeho proteinový produkt patří do rodiny faktorů regulujících apoptózu; Bcl-2 působí antiapoptoticky. Při vývoji maligní léze z premaligní je právě dysregulace apoptózy velmi významným krokem. Zvýšená exprese Bcl-2 spolu s inaktivací p53 je ukazatelem poruchy spouštění apoptózy a je nacházena v různé míře u všech preinvazivních i invazivních lézí prsu [6, 11].

Gen pro vaskulární endoteliální růstový faktor (vascular endothelial growth factor - VEGF)

VEGF je významný růstový faktor. Hraje důležitou úlohu v tumorem indukované angiogenezi. Receptor tohoto růstového faktoru je cílem biologické léčby pomocí monoklonální protilátky bevacizumabu.

Hladina VEGF v tkáni koreluje právě s mírou vaskularizace, a právě míra vaskularizace roste u duktálních lézí s jejich závažností. Podle některých autorů by tak VEGF mohl predikovat biologické chování DCIS a mohl by umožnit identifikovat agresivnější podtypy nádoru [7, 13].

MATERIÁL A METODY

DNA pro analýzu ztráty heterozygozity a RNA pro analýzu exprese byly izolovány z čerstvě zmrazené tkáně uchované v roztoku RNA-later pomocí standardních komečních kitů (QiaAmp, Qiagene, NSR). Genetický materiál byl izolován jak z částky nádoru (patologem provedena kontrola, že vzorek obsahuje více než 50 % nádorových buněk), tak ze zdravé tkáně (část žlázy nepostižená nádorem).

Analýza ztráta heterozygosity byla prováděna metodou fragmentační analýzy na přístroji ABI 310 s fluorescenčně značenými primery. Ztráta heterozygozity (LOH – loss of heterozygosity) v nádoru byla posuzována vzájemným srovnáním intenzity alel ve zdravé a nádorové tkáni podle vzorce (At x Bn)/(Bt x An) – A a B jsou alely, t… tumor, n… normální tkáň. LOH byl přítomen, pokud byla intenzita předpokládané deletované alely snížena na méně než 50 % (posuzováno podle plochy pod křivkou ve standardním softwarovém zpracování).

Analýza exprese probíhala metodou real-time PCR s barvivem SYBRgreen. Jako house-keeping (referenční) gen byl použit kolagen 2A (COL2A).

VÝSLEDKY

Za využití dvou přístupů – analýzy ztráty heterozygosity a real-time PCR – jsme provedli srovnávací studii molekulárně-genetického profilu tří tkání: zdravé mléčné žlázy (65 vzorků), DCIS (25 vzorků) a invazivního karcinomu prsu (42 vzorků).

Analyzována byla ztráta heterozygozity (LOH) ve třech genech: BRCA1, BRCA2 a p53; a exprese genů VEGF a Bcl-2.

U vzorků invazivních karcinomů prsu byl LOH v genu BRCA1 přítomen ve 22,3 % (38 informativních vzorků), v genu BRCA2 ve 32,1 % (40 informativních vzorků) a v genu p53 ve 35,6 % (40 informativních vzorků). U duktálního carcinoma in situ (DCIS) byl LOH v genu BRCA1 zaznamenán ve 13,4 % (23 informativních vzorků), v genu BRCA2 ve 14,1 % (21 informativních vzorků) a v genu p53 ve 33,2 % (22 informativních vzorků).

U vzorků normální tkáně mléčné žlázy nebyl LOH pozorován (59 informativní vzorků pro gen BRCA1, 61 pro gen BRCA2 a 60 pro gen p53). Zastoupení informativních vzorků odpovídá očekávané a popsané populační frekvenci heterozygozity pro dané mikrosatelitární markery.

Výsledky analýzy exprese ukázaly změnu tvorby genového produktu u obou studovaných genů v určité části vzorků invazivních i preinvazivních lézí: VEGF byl zvýšeně exprimován u 15,3 % invazivních nádorů a u 8,3% DCIS. Zvýšená exprese Bcl-2 byla pozorována u 13,2 % invazivních nádorů a u 7,1 % DCIS.

DISKUSE

Ztráta kontroly integrity genomu, ztráta schopnosti spustit apoptózu a zvýšení angiogeneze jsou považovány za významné faktory predikce invazivity nádoru.

Pro umožnění vzniku mutací a jiných alterací genomu, které způsobí transformaci buňky v buňku preinvazivní a posléze i invazivní léze, je nutná ztráta kontroly integrity genomu a ztráta schopnosti aparátu buněčného jádra opravovat poškození DNA. V těchto procesech hrají významnou roli proteinové produkty genů BRCA1 a BRCA2. BRCA1 dokáže dokonce spustit apoptózu mechanismem nezávislým na p53 interakcí s proapoptotickými faktory ležícími v kaskádě pod proteinem p53 (Bax, Bak). Inaktivace genů BRCA1 a BRCA2 (nejčastěji mechanismem delece jedné alely a somatickou mutací, nebo hypermetylací promotoru alely druhé) vede pak ke ztrátě schopnosti kontrolovat integritu DNA (BRCA1) a opravovat chyby vzniklé při replikaci DNA nejpřesnějším mechanismem homologní rekombinace (BRCA2) [6].

Klíčovým faktorem při spuštění apoptózy je proapoptotický proteinový produkt genu p53. U mnoha solidních nádorů je nacházena jeho inaktivace právě v souvislosti v výskytem invazivní složky. Defektní a nepracující p53 znamená významné poškození mechanismů aktivace vnitřní (intrinzické) cesty apoptózy, což může buňce dovolit uniknout kontrolním mechanismům při závažném poškození integrity genomu nebo např. při hypoxii. Podobný efekt má i zvýšení produkce antiapoptotických faktorů, především Bcl-2 [9].

Růst a vývoj nádoru je podmíněn také dostatečným zásobením živinami, tedy dostatečnou novotvorbou cév ve vznikající nádorové tkáni. Angiogenezi může stimulovat nádor sám, a to především tvorbou vaskulárního endoteliálního růstového faktoru (VEGF) [14].

Výše uvedené procesy vyřazení jednotlivých buněčných kontrolních a řídicích mechanismů jsou nezbytné pro úspěšný růst nádorové populace a získání dalších vlastností spojených s progresí nádoru (schopnost invazivního růstu, metastazování). Analýza těchto molekulárních vlastností nádoru pak může ukazovat na jeho potenciál vývoje v invazivní, nebo dokonce metastazující nádor.

ZÁVĚR

V této práci jsme potvrdili, že určitá část DCIS má molekulární vlastnosti schodné s invazivním karcinomem. Pečlivá analýza větší skupiny nádorů a korelace s klinickými daty by mohla vést k odhalení takovýchto molekulárních změn jako potenciálních markerů potenciálu vývoje DCIS v invazivní karcinom, nebo identifikovat skupinu DCIS s latentní invazí. Tento přístup by tak umožnil upravit klinický management definované rizikové podskupiny DCIS.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR/8807-3.

MUDr. Michal Zikán, Ph.D.

Gynekologicko-porodnická klinika

1. LF UK a VFN

Apolinářská 18

128 00 Praha 2

e-mail: michal.zikan@lf1.cuni.cz