IgG protilátky namířené proti lamininu-1 v séru a v peritoneální tekutině u pacientek se sníženou plodností

Súhrn

Cíl studie:
Sledování hladin IgG protilátek proti lamininu-1 u pacientek se sníženou plodností, především s endometriózou a syndromem polycystických ovarií.

Typ studie:
Perspektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Poradna pro imunologii reprodukce a Výzkumné laboratoře pro imunologii reprodukce, Gynekologicko-porodnické kliniky LF UK a FN v Plzni.

Metodika:
Komerční ELISA metoda k určování protilátek proti laminu-1 v IgG v séru a peritoneální tekutině u 120 pacientek po diagnostické laparoskopii, a v 277 sérech pacientek po neúspěšných 2-3 in vitro fertilizacích a s anamnestickým údajem o endometrióze.

Výsledky:
Ze souboru 120 laparoskopovaných pacientek jsme zjistili pouze 16 významně pozitivních hodnot a-Ln-1 IgG (více než 15 IU/ml) v sérech a v peritoneální tekutině.

Ze souboru 277 pacientek po 2-3 neúspěšných IVF a s endometriózou v anamnéze jsme nedetekovali v séru ani jednu pozitivitu.

Závěr:
Zvýšený titr protilátek proti lamininu-1 v IgG se u našich pacientek váže především k endometrióze Iľ-IIľ a k diagnóze polycystická ovaria, k ženským onemocněním majícím vztah i k autoimunitním procesům.

Klíčová slova:
neplodnost, endometrióza, polycystická ovaria, protilátky proti lamininu-1, IVF.

ÚVOD

Lamininy jsou multifunkční glykoproteiny bazálních buněčných membrán, které obsahují kromě lamininu i fosfolipidy, nidogen, proteoglykany a kolagen IV. Lamininy podporují buněčnou adhezi, migraci, proliferaci, diferenciaci, ale i tvorbu podpůrné sítě bazálních membrán [3, 4, 6].

V současné době je známo minimálně 15 různých izoforem lamininu s odlišnou tkáňově specifickou expresivitou během různých stadií buněčného vývoje. Laminin byl poprvé izolován v roce 1979 z nádorových buněk jako heterotrimer složený z A1, B1 a B2 podjednotek [4, 11], které byly později přejmenovány na α1, β1 a γ1 [1].

Ukázalo se, že laminin-1 je klíčová molekula ve vývoji embryonálních bazálních membrán. Laminin-1 je v bazálních membránách nezbytný pro vývoj tkání u všech živočichů. Zajišťuje mechanickou stabilitu, funguje jako bariéra mezi odlišnými buněčnými typy a je prakticky rozhodujícím způsobem zahrnut do tzv. buněčné diferenciace, přežití a migrace buněk [17].

Laminin-1 je produkován již před implantačním obdobím a zvyšuje produkci kolagenózy IV, která by mohla souviset s degradací kolagenu bazálních membrán během implantace. Trofoblastický laminin-1 hraje důležitou roli v adhezi a migraci buněk trofoblastu do mateřské deciduy [18]. Protilátky proti lamininu byly nalezeny u žen s preeklampsií nebo eklampsií. IgG a IgM protilátky reagují s bazální membránou placenty a ledvin. Protilátky proti lamininu mohou tedy hrát důležitou roli v patogenezi především těžké preeklampsie tím, že narušují vazbu buněk trofoblastu k placentální bazální membráně a mění permeabilitu placentálních klků [3, 4].

Porovnání bioptických vzorků endometria luteální fáze u plodných a neplodných žen ukazuje rozdílnou distribuci glykoproteinů extracelulární matrix (kolagenu IV, fibronektinu a lamininu). U plodných žen se glykoproteiny nacházejí v bazálních membránách endometriálních žláz a cév, kdežto u neplodných žen se v této lokalitě vůbec neprokážou [4]. Absence α 4 a β 3 integrinové exprese v endometriu u infertilních žen uprostřed luteální fáze může být spojena s poruchami děložní funkce. Porucha lokální receptorové funkce je považována za nepoznanou příčinu neplodnosti [13].

Laminin jako složka extracelulární matrix se ukázal také jako důležitá molekula v patogenezi endometriózy [14, 15]. Distribuce lamininu-1 a jeho receptorů byla identická jak v endometriu, tak v ložiscích endometriózy [4].

Cílem naší studie bylo vyšetřit IgG protilátky proti lamininu-1 (a-Ln-1) v séru a peritoneální tekutině u pacientek po bezprostřední diagnostické laparoskopii a u pacientek jen ze sér s již dříve diagnostikovanou, tedy anamnestickou endometriózou.

SOUBOR ŽEN

Do studie jsme po předchozím informovaném souhlasu zařadili 120 pacientek ve věku 22-43 let z Poradny imunologie reprodukce při Gynekologicko-porodnické klinice LF UK a FN Plzeň. Sledovali jsme koncentrace anti-lamininu-1 (a-Ln-1) v IgG v séru (S) a peritoneální tekutině (PT) u pacientek po diagnostické laparoskopii z let 2003-2008. Tento soubor pacientek jsme rozdělili do 5 skupin podle nálezů z laparoskopie:

• 1. skupina – 36 pacientek s EI°- II°.
• 2. skupina – 3 pacientky s E III°.
• 3. skupina – 5 pacientek s PCO.
• 4. skupina – 37 pacientek s nálezem jen blanitých adhezí v malé pánvi.
• 5. skupina – 33 pacientek s diagnózou uterus myomatosus.

Z anamnestických údajů 120 pacientek jsme u pěti z nich zjistili přítomnost onemocnění s autoimunitním podkladem (1 - Bechtěrevova choroba, 2 - revmatoidní artritida, 1 - hypo– nebo 1 - hyperfunkce štítné žlázy), dále 3 pacientky jsou po apendektomii, 3 pacientky se léčí ambulantně z důvodu deprese, 4 pacientky jsou sledovány pro asthma bronchiale.

Dále jsme vyšetřili jen séra u 277 pacientek ve věku 23-43 let s již dříve diagnostikovanou endometriózou. U těchto žen jsme neměli k dispozici peritoneální tekutiny, neboť se jednalo o pacientky z různých míst ČR a zahraničí.

Kontrolní skupinu jsme vytvořili z 11 zdravých žen, u nichž byla provedena diagnostická laparoskopie z důvodu plánovaných inseminací, a u nichž byl zjištěn fyziologický stav v malé pánvi.

METODIKA

K vyšetřování protilátek proti lamininu-1 v IgG jsme použili komerční ELISA metodu (AESKULISA Laminin. DIAGNOSTICS GMBH, SRN), při které se jako základ využívá vysoce purifikovaný nativní lidský laminin-1. Konvenční metoda uvádí pozitivitu sérového výsledku nad 15 IU/ml. Stanovili jsme tedy pro každou skupinu průměrnou hodnotu IgG anti-laminu-1 v séru a v peritoneální tekutině a následně pak porovnali s průměrnou hodnotou anti-lamininu-1 kontrolní skupiny.

Pro statistická hodnocení jsme použili t-test, který porovnává průměrnou hodnotu v dané skupině s průměrnou hodnotou kontrolní skupiny, a ANOVA test, který poukazuje na případný statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými diagnózami.

VÝSLEDKY

U každé skupiny pacientek po laparoskopii jsme nejdříve stanovili nejnižší a nejvyšší a-Ln-1 IgG protilátek v séru a v peritoneální tekutině. V rámci každé skupiny jsme pak zjišťovali průměrnou hodnotu a-Ln-1 a následně ji porovnali s průměrnou hodnotou kontrolní skupiny (tab. 1). Zjistili jsme, že podstatně významné hladiny IgG a-Ln-1 jsou přítomné u pacientek s E I°– II° (p = 0,0485, α = 10 %) v sérech a žen s PCO (p = 0,0631, α = 5 %), naopak nižší koncentrace IgG a-Ln-1 v séru i v peritoneální tekutině jsme zjistili u pacientek s E III° (graf 1).

V souboru 277 pacientek s již dříve diagnostikovanou endometriózou jsme neprokázali v séru ani jeden pozitivní výsledek IgG a-Ln-1.

Ze statistické analýzy pomocí t- testu vyplývá, že pro hodnoty protilátek a-Ln-1 v IgG v séru existuje statisticky významný rozdíl na hladině významnosti alfa 5 % mezi skupinou s E III° a skupinou s PCO, na hladině významnosti 10 % statisticky významný rozdíl mezi skupinou s E I° – II° a skupinou E III°.

T-test dále prokázal pro hodnoty protilátek a-Ln-1 v IgG v peritoneální tekutině statisticky významný rozdíl na hladině významnosti 5 % mezi kontrolní skupinou a skupinou s E III°, dále pak mezi skupinou s E I° – II° a skupinou s E III°, na hladině významnosti 10 % pak mezi skupinou s E III° a pacientkami s adhezemi.

Podle výsledků ANOVA-testu neexistuje statisticky významný rozdíl mezi jednotlivými skupinami, a to jak pro hodnoty a-Ln-1 IgG protilátek v séru, tak ani v peritoneální tekutině (viz tab. 1).

DISKUSE

Protilátky proti lamininu-1 byly poprvé detekovány v séru opic s anamnézou opakovaných reprodukčních ztrát. Působením těchto opičích protilátek proti a-Ln-1 na kultivovaná krysí embrya vznikaly defekty neurální trubice u krysích zárodků [2]. Později bylo zjištěno, že imunizace opic myším lamininem-1 nebo jeho peptidy způsobovala embryotoxicitu a spontánní potrácivost [5].

IgG a-Ln-1 protilátky jsou také spojovány s opakovanými potraty v prvním trimestru [9]. Výsledky výzkumu ukazují, že hladiny a-Ln-1 v IgG jsou znatelně vyšší u žen s habituálními potraty než u žen zdravých či žen s fyziologickým těhotenstvím [14, 15].

Pravděpodobnost fyziologického porodu u pacientek s vysokými hladinami a-Ln-1 v IgG s anamnézou samovolných potratů je signifikantně nižší než u pacientek s negativními a-Ln-1 také s anamnézou samovolných potratů [4, 6]. Sami jsme prokázali [4] přítomnost sérových IgG a-Ln-1 protilátek u pacientek bezprostředně po potratu, lokální výskyt v ovulačním sekretu jsme nikdy nenanašli. Zřejmě protilátky proti této adhezivní molekule lamininu-1 se budou aktivovat v procesu potrácení a při dysregulaci neuro-endokrinně-imunitní.

Endometrióza může být také jednou z příčin neplodnosti. Mnohé studie [5, 10, 12, 18, 19] prokázaly souvislost mezi endometriózou a zvýšenou hladinou autoprotilátek specifických k endometriu, ovariu, nukleárním antigenům, fosfolipidům. Protilátky proti lamininu-1 jsou novým klinicky významným markerem u gynekologických onemocnění – jako je např. zánět, endometrióza, habituální potrat [6].

Přítomnost anti-lamininu-1 u pacientek po opakovaných IVF je podstatně vyšší u žen s endometriózou než u žen bez endometriózy. Hladiny anti-lamininu-1 u neplodných pacientek s E I° a II° jsou znatelně vyšší než u E III° [6].

V naší studii jsme chtěli prokázat přítomnost IgG anti-lamininových-1 protilátek u pacientek s prokázanou a doposud neléčenou endometriózou a dokázat určitou souvislost mezi pozitivními hodnotami a-Ln-1, laparoskopickým nálezem a anamnestickými daty (autoimunitní podklad např. morbus Bechtěrev, revmatoidní artritida, autoimunitní onemocnění štítné žlázy, asthma bronchiale). U jednotlivých pacientek jsme nalezli zvýšené hladiny IgG a-Ln-l protilátek jak v sérech, tak v peritoneálních tekutinách.

Naše výsledky potvrdily skutečnost, že zvýšené hladiny protilátek proti lamininu-1 se více vyskytují u pacientek s E I° a II° než u pacientek s E III°. Endometrióza III° a IV° je imunologicky méně aktivní než E I° a II°, což jsme už několikrát prokázali [např. 19]. Tato významná skutečnost může nejednou ovlivnit výsledek in vitro fertilizace. V jedné z naší posledních studiích [20] např. poukazujeme i na to, že i v andrologické části zvýšená přídatná zánětlivá buněčnost seminální plazmy je doprovázena vyššími hladinami IgG- a –Ln -1 v ejakulátu, což opět může snížit fertilizační schopnost mužských pohlavních buněk.

V souboru 277 pacientek s již dříve diagnostikovanou endometriózou a po 2-3 neúspěšných cyklech IVF jsme nedetekovali v séru ani jeden pozitivní výsledek IgG a‑Ln-1. Nabízí se úvaha o eventuálním celkovém „imunologickém útlumu“ endometriózy v rámci komplexního, především hormonálního léčení neplodnosti. Lokální výskyt v oblasti peritoneální tekutiny jsme neměli možnost vyšetřovat.

Právě z posledního výsledku naší studie také vyplývá nevhodnost paušálního vyšetřování protilátek proti lamininu -1 u všech pacientek se sníženou plodností. Navrhujeme indikaci tohoto vyšetření v přísně individuálních případech s předností u žen s autoimunitním onemocněním.

ZÁVĚR

Protilátky proti adhezivní molekule lamininu-1 v IgG jsme prokázali především u pacientek s E I° – II°, PCO, u žen s adhezemi a s autoimunitním onemocněním. Patologický titr těchto protilátek můžeme považovat za jeden z laboratorních diagnostických markerů. Avšak z našich výsledků vyplývá, že není žádoucí, aby se stanovení hladiny IgG a-Ln-1 stalo rutinním vyšetřením, ale naopak vyšetřením přísně individuálním.

Poděkování za vzornou spolupráci patří lékařům, sestrám a ostatnímu zdravotnickému personálu Gynekologicko-porodnické kliniky v Plzni při zajišťování biologického materiálu.

Práce vznikla s podporou grantu VZ LF UK v Plzni MSM 002 162 0812.

Prof. MUDr. Zdenka Ulčová-Gallová, DrSc.

Gynekologicko-porodnická klinika FN

Alej svobody 80

304 60 Plzeň – Lochotín

e-mail: Ulcova@fnplzen.cz