Proteomika a biomarkery karcinomu ovaria

Souhrn

Cíl studie:
Popis nových biomarkerů karcinomu ovaria a současných technologií k hledání a validaci těchto biomarkerů, zejména s využitím proteomických technik.

Typ studie:
Přehled.

Název a sídlo pracoviště:
Lékařská fakulta Hradec Králové, Univerzita Karlova Praha. Porodnická a gynekologická klinika FN Hradec Králové. Ústav molekulární patologie, Fakulta vojenského zdravotnictví Univerzity obrany Hradec Králové.

Metodika:
Shrnutí literárních údajů o nových biomarkerech karcinomu ovaria a nových technologiích jejich objevu a validace. Přehled základních proteomických metod užívaných k detekci biomarkerů.

Závěr:
Práce sumarizuje výsledky klinických a vědeckých prací zaměřených na biomarkery karcinomu ovaria.

Klíčová slova:
proteomika, ovariální karcinom, biomarker.

ÚVOD

Karcinom ovaria (CAO) je jeden z nejagresivnějších nádorů. Má nejvyšší mortalitu mezi nádory ženského genitálního ústrojí a patří mezi pět nejčastějšíchpříčin úmrtí žen v souvislosti s malignitami [24]. Každoročně je celosvětově diagnostikováno kolem 205 000 nových případů karcinomu ovaria a zaznamenáno zhruba 125 000 úmrtí žen na jeho podkladě [42]. Epiteliální karcinom ovaria je jednou z vedoucích příčin úmrtí žen na gynekologické nádory v USA a Velké Británii [10]. Pětileté přežití žen s karcinomem ovaria je 30%. Silně závisí na stadiu onemocnění a včasnosti diagnostiky (viz tabulku 1) [31]. V současné době jsou dostupné desítky studií referujících o markerech tohoto karcinomu, neboť zejména pro obtížnou diagnostiku jeho časných stadií je aktuální výzvou nalezení nových biomarkerů. Pro klinickou praxi je nutné získat marker s pozitivní prediktivní hodnotou (PPV) kolem 10 % (tj. jeden nádor na deset operací), neboť karcinom ovaria není relativně časté onemocnění v průměrné populaci žen; tj. prevalence 40 případů na 100 000 žen starších 50 let. K dosažení PPV 10 % je nutná specificita markeru 99,7 % a senzitivita 67 % [5].

V oblasti biomedicínského výzkumu došlo na přelomu tisíciletí k několika významným počinům. K těm nejvýznamnějším patří určitě i dokončení sekvenace kompletního lidského genomu, což otevírá spoustu nových možností v oblasti genové terapie, prenatální diagnostiky apod. Další výzvou je identifikace proteinů kódovaných jednotlivými geny, struktura těchto bílkovin a vztahy z ní vyplývající. Současné pokroky v genomických a proteomických technologiích vedou k nalezení nových cest zjištění genových změn, rozdílné exprese proteinových profilů a jejich spojení s karcinomem ovaria. V tomto kontextu je nezbytné zdůraznit, že již bylo, a také jistě bude zjištěno mnoho proteinů či polypeptidů, které jsou exprimovány v souvislosti s onkologickým onemocněním a skýtají možnost klinického využití. Navzdory tomu je stále nedostatek klinicky užitečných a využitelných markerů pro diagnostiku karcinomu ovaria. Přes úspěchy a pokroky v protinádorové terapii úmrtnost na karcinom ovaria zůstává v posledních dvou desetiletích beze změn. To jistě odráží nejen obtížnost časné diagnostiky [48].

BIOMARKER

Včasné rozpoznání nádorového onemocnění je zcela zásadní faktor dramaticky ovlivňující šance pacientů na úspěšné vyléčení. Podle definice FDA je biomarker charakteristika, jež je objektivně měřitelná, použitelná jako indikátor normálního biologického procesu, patologického procesu, nebo odpovědi na farmakologickou intervenci [57]. Z biologického hlediska je biomarker molekula (velká část má povahu proteinů), jejíž přítomnost, event. kvantitativní charakteristika je stanovitelná nejčastěji pomocí specifických monoklonálních protilátek automatizovanými systémy ELISA, RIA apod. Ideální biomarker by měl splňovat několik bazálních předpokladů: vysokou specifičnost k danému onemocnění, velkou orgánovou/tkáňovou specifičnost a dostatečnou míru citlivosti. Další důležitý faktor je korelace laboratorního parametru s rozsahem poškození tkáně či orgánu, jeho přijatelná dynamika v čase a stanovení cut off hodnoty. V neposlední řadě i možnost standardizace jeho stanovení, snadná interpretace lékařem i pacientem, a také ekonomické hledisko.

TRADIČNÍ MARKER KARCINOMU OVARIA

Sérový nádorový antigen 125 (CA-125) je v současné době zlatým standardem detekce epiteliálních ovariálních nádorů u žen po menopauze. Přestože nebyl původně určen ani plánován jako ovariální nádorový marker, zůstává stále nejlepším klinickým markerem pro CAO po menopauze. Bohužel, pro časná stadia ovariálního karcinomu není příliš dobrým diagnostickým markerem [30]. Jeho hladina je zvýšena u zhruba 80 % pacientek s pokročilým, ale jen u 50 % pacientek s časným stadiem CAO [4]. Elevace CA-125 není specifická jen pro CAO, ale je přítomna i u jiných malignit (např. nádorů pankreatu a prsu) [3] a také u některých nezhoubných onemocnění (např. endometrióza či zánětlivá pánevní nemoc) [12]. I přes nízkou senzitivitu a specificitu je CA-125 stále užitečným markerem monitorace efektu chemoterapie a rekurence nádorového onemocnění [23].

SLIBNÉ MARKERY CAO

Komplexní porozumění fyziologii a patofyziologii nádorových onemocnění společně s aplikací nových tzv. „-omic“ platforem je klíčem k nalezení nových nádorových markerů. Aktuální výzkum se zaměřuje na zejména na využití molekulárních technologií ke studiu změn v DNA , exprese RNA a proteinů.

Kalikreiny jako sérové markery CAO

Kalikreiny (KLKs) jsou jedním z nejlépe prozkoumaných markerů CAO. Lze je detekovat v tkáních a tělních tekutinách [44]. KLKs patří do rodiny secernovaných serinových proteáz, kódovaných patnácti geny, které jsou lokalizované tandemově na chromozomu 19q13.4 [42]. S karcinomem ovaria jsou spojeny kalikreiny 4, 5, 7, 8, 9, 11, 13, 14 a 15 [8]. Tyto markery lze použít k monitoringu diseminace buněk CAO v krvi a v ascitu. KLK 6 a KLK 10 jsou zvýšené v nádorových buňkách, séru a ascitu pacientek s CAO a korelují s prognózou onemocnění [44]. PCR vyšetření na KLK 6 mRNA z diseminovaných nádorových buněk v krvi 24 pacientek s CAO bylo v 75 % pozitivní. KLK 10 mRNA byla pozitivní v 40 % případů. Ascites těchto žen vykazoval 90% pozitivitu pro KLK 6 a KLK 10 mRNA ve srovnání s 33% pozitivitou pro ostatní typy karcinomů. KLK 8 lze použít jako nezávislý marker příznivé prognózy CAO [8]. Ženy s KLK 8 pozitivním tumorem mají nižší grading (G1), nulové nádorové reziduum po operaci, signifikantně delší období bez progrese, a také vyšší celkové přežití než ženy s KLK 8 negativními tumory [8].

Interleukiny

Interleukiny (ILs) jsou leukocyty produkované cytokiny působící zejména na další bílé krevní elementy. Studie potvrzují roli ILs jako nové skupiny nádorových markerů CAO. Podobně jako u proteinových markerů nejde o izolované užití, ale o panel řady cytokinů. Ten má na rozdíl od hladin jednotlivých ILs silný diagnostický potenciál [17]. Koncentrace 24 cytokinů (cytokiny / chemokiny, růstové a angiogenní faktory) v kombinaci s CA-125 byly stanovené v séru 44 pacientek s časným stadiem CAO, dále 45 zdravých žen a 37 pacientek s benigními nádory malé pánve. Šest markerů: IL–6, IL-8, epidermální růstový faktor (EGF) a vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), MCP-1 protein a CA-125 vykazovaly rozdíly v sérových koncentrací mezi pacientkami s CAO a ostatními. Senzitivita byla 84 % a specificita 95 % [17]. V další studii byly testovány tři markery (IL-18, FGF-2 a CA-125), které vykazovaly podobnou senzitivitu (35/45 pacientek) ve srovnání se samotným CA-125 (37/45) a signifikantně zvýšenou specificitu detekce (20/25) ve srovnání s izolovaným hodnocením markerů (15/25 u CA-125, 18/25 FGF-2 a 16/25 u IL 18) [33].

Osteoponin

Osteoponin (OPN) je glykoprotein (extracelulární strukturální protein) identifikovaný poprvé v osteoblastech. OPN se zdá možným klinicky využitelným přídatným markerem CA-125 k detekci rekurentního CAO [36]. Při úspěšné léčbě CAO jeho hladina v séru klesá. V případě rekurence základního onemocnění dochází k opětovnému vzestupu OPN časněji než v případě CA-125 [49].

Nádorové antigeny

V diagnostických a terapeutických možnostech maligních a autoimunitních onemocnění nachází své místo i globální přístup k antigennímu profilu, tzv. epitomika [36]. Malaynkar ve své recentní studii charakterizující peptidové antigeny ovariálního karcinomu, popisuje 15 nádorových antigenů v 11 buněčných liniích [36]. Imunologický profil rozdílných buněčných linií CAO napomáhá identifikaci peptidových antigenů, které jsou rozpoznávány specifickými cytotoxickými lymfocyty (CTL). Každá z 11 linií buněk CAO byla charakterizována unikátním vzorcem epiteliálních a fibroblastových markerů, nádorových antigenů, imunosupresivních cytokinů a jiných [36].

Protinádorové protilátky

Protinádorové protilátky (PP) jsou také potenciální nádorové biomarkery [34]. Zatím jsou dostupné jen velmi omezené informace o prevalenci těchto protilátek u pacientek s CAO. Protilátky k diferenciačnímu antigenu HOXA7, mají u ovariálního karcinomu prevalenci 67 %. Protilátky proti běžným antigenům, jako např. NY‑ESO-1, adhezivní molekule epiteliálních buněk (Ep‑CAM) a heat shock proteinu 90 (HSP-90) byly také identifikovány u CAO [34].

NOVÉ TRENDY A BIOMARKERY CAO

Metabolomika

Jedna z technologií úzce spojená s hmotnostní spektrometrií je detekce metabolitů. Ty jsou konečnými produkty buněčných regulačních procesů. Jejich hladiny lze pokládat za terminální odpověď biologických systémů na změny genetické či environmentální.Vyšetření metabolitového profilu s následnou kvantifikací primárních metabolitů lze využít k charakteristice molekulárních změn nádorové ovariální tkáně. Denkert a kol. ze zmrazených vzorků ovariálních tumoru užitím technologie GC-TOF-MS stanovil širokou škálu metabolitových profilů [14]. Potvrdil rozdíl v metabolitových profilech invazivního ovariálního karcinomu a borderline tumoru [14]. Detekoval 291 metabolitů, z nichž 114 bylo označeno za známé. Mezi karcinomem a borderline tumorem nalezl rozdílných 51 metabolitů. Mezi metabolity lipidové třídy patří také kyselina lyzofosfatidová (LPA). Zdá se, že stimuluje proliferaci buněk CAO. Vyskytuje se také v ascitu u pacientek s CAO. Pacientky s CAO mají signifikantně vyšší plazmatickou hladinu LPA než zdravé pacientky [52] Může být potenciálním markerem karcinomu, a to nejen ovariálního, ale i ostatních gynekologických karcinomů.

Nanotechnologie

Technologie pracující se submikroskopickými objekty má velký potenciál k detekci časných stadií karcinomu ovaria [41]. Využití technologie LabMAP umožňuje detekci velkého množství proteinů z jedné kapky krve či séra získané od pacientek s CAO [17]. Přes 450 vzorků séra bylo testováno na 46 biomarkerů souvisejících s CAO. Potvrzeno bylo 20 proteinů ve více než 98 % vzorků séra žen s CAO.

Lab on a chip (LOC) technologie

Chemická laboratoř na mikročipu (LOC) je technologie stará pouhých deset let. Jde o složitý systém kanálků o rozměrech několika desítek mikrometrů, ve kterém se vzorek míchá s reakčním činidlem, dále následuje dělení látek a posléze detekce. To vše se děje v několika desítkách vteřin, maximálně minutách. Kapalina se v mikročipu nepohybuje pomocí mikropump, ale pomocí jevu zvaného elektroosmóza, kdy se kapalina dá sama do pohybu při aplikaci elektrického pole. Tato technologie byla úspěšně využita při detekci hladin IL-1ß, C-reaktivního proteinu a matrix metalloproteináz 8 ve slinách jako biomarkerů přítomnosti a závažnosti postižení periodontitidou [21]. Získané hladiny se shodovaly hodnotami naměřený standardně používanou ELISOU.

Nové možnosti potenciace CA-125

Zatímco většina existujících markerů postrádá dostatečnou senzitivitu či specificitu, mnohonásobné sérové markery jsou vhodné ke screeningu žen na časná stadia CAO [7]. Je testováno něco přes 30 sérových markerů buď v kombinaci s CA–125, či izolovaně [6]. Některé z nich se zdají být velmi slibné (např. HE4, mesothelin, M-CSF, OPN, KLK(s) a solubilní EGF receptor). Další markery, jako je NB 70K, IAP, PLAP, CA 15-3, a TAG 72, jsou aktuálně ve fázi klinického hodnocení, především však v kombinaci s CA-125. Markery jsou uspořádány ve většině případů do multiplexních platforem usnadňujících simultánní stanovení jejich většího počtu z malého vzorku séra. S nárůstem objemu získaných dat je nezbytné využití sofistikovaných matematických a statistických metod k analýze hladin markerů se snahou najít kombinaci s nejlepší senzitivitou a specificitou. Další studie používají CA-125, CA 15-3, CA 19-9, CA 54-61, CEA, HMFG2, IL-6, IL-10, LSA, M-CSF, NB70K, OVX1, PLAP, TAG72, TNF, TPA a UGFT hodnocené izolovaně, nebo v kombinaci [16]. Potvrzují, že pokud se použije sériové hodnocení CA-125 druhé generace (CA-125 v kombinaci s ostatními markery), tedy iniciální „záchytné“ hladiny a další s časovým odstupem, lze tohoto rozdílu využít k rozlišení nálezů maligních od benigních a normálních. Sériové hodnocení CA-125 druhé generace má 83% senzitivitu, 99,7% specificitu a 16% PPV pro časnou detekci ovariálního karcinomu. Woolas a kol. ve své studii úspěšně použil s extrémně vysokou senzitivitou a velmi dobrou specificitou panel tří markerů (CA-125, M-CSF a OVX1) k identifikaci časného stadia CAO. Minimálně jeden marker byl zvýšen u 98 % pacientek s I. stadiem CAO (CA-125 bylo zvýšené u 67 % z nich) [56]. V tabulce 2 jsou uvedené nejvíce nadějné samostatné či kombinované biomarkery karcinomu ovaria.

PROTEOMICKÉ PŘÍSTUPY K ODHALENÍ NOVÉHO BIOMARKERU

1. Definovat ze souhrnu identifikovaných proteinů ty, jež mají prokazatelný vztah k dané chorobě (kandidátní proteiny).
2. Porovnání kandidátních proteinů a určení toho, který v co největší míře splňuje požadavky na ideální biomarker.
3. Vytvoření soupravy pro stanovení biomarkeru, a klinické ověření.

Bohužel většina používaných, event. potenciálních markerů výše uvedené podmínky zcela nesplňuje. Ačkoli zdroje možných proteinových markerů jsou velmi pestré, nejperspektivnější je krev (plazma nebo sérum). Ta přichází do styku s většinou buněk těla a komunikuje i s buňkami patologicky postiženými. Z těchto buněk se důsledkem jejich odumírání, nespecifického, či specifického uvolňování dostávají do cirkulující krve proteiny charakteristické pro daný patologický stav. Vzhledem k velkému objemu krve je konečná koncentrace těchto diagnosticky zajímavých proteinů velmi nízká (řádově ng/ml). Lidská plazma je velmi složitá směs proteinů a peptidů, milionů různých imunoglobulinových sekvencí a také proteinů pocházejících z bakterií virů, či jiných patogenů. Velmi zásadním limitujícím aspektem je široký rozsah koncentrací proteinů v plazmě, odhadovaný na více než deset dekadických řádů, což v konečném důsledku vede k zastření diagnosticky zajímavých proteinů několika málo velmi vysoce zastoupenými proteiny (albumin, imunoglobuliny, transferin, antitrypsin a jiné), které dohromady tvoří až 95 % celkového proteinu plazmy. U tak heterogenního onemocnění, jakým je zhoubný nádor, nelze očekávat, že bude snadno diagnostikovatelný díky jednomu specifickému proteinu. Poškozené buňky v drtivé většině případů neposkytují unikátní protein, ale tvoří široké spektrum, spíše však panel, up- a down-regulovaných nebo posttranslačně modifikovaných proteinů, lišících se od normálního fyziologického stavu organismu. Mezi další potenciální zdroje bimarkerů patří plodová voda, sliny, moč, mozkomíšní mok a další. Tyto zdroje neposkytují tak komplexní proteinový profil jako krev, ale jejich vypovídací hodnota oproti krvi rapidně vzrůstá, pokud se onemocnění týká regionu jejich působení.

PROTEOMICKÉ TECHNOLOGIE VYUŽÍVANÉ K NALEZENÍ NOVÝCH BIOMARKERŮ

A. Gelová dvourozměrná elektroforéza

Historicky první a stále převládající efektivní proteomickou technologií je dvojrozměrná polyakrylamidová elektroforéza (2D-PAGE) rozdělující směs proteinů v gelové matrici na základě jejich izoelektrických bodů (pI) a molekulových hmotností (MW) v kolmém směru [56]. Tato kombinace umožňuje separaci s velmi vysokým rozlišením. Směs proteinů je rozdělena izoelektrickou fokuzací v závislosti na hodnotě izoelektrických bodů. Dnes se provádí na komerčně dodávaných gelových proužcích s imobilizovaným pH gradientem. Následně jsou proteiny v kolmém směru elektroforézou rozděleny v závislosti na své velikosti, nejčastěji pomocí systémů pufrů podle Laemmliho [32]. Výsledkem je dvojrozměrná proteinová mapa, na které jsou proteiny detekovány za pomoci různých metod barvení. Velmi výhodné je rozdílné fluorescenční barvení DIGE (Differential Gel Electrophoresis), které je založeno na kovalentní modifikaci proteinů barvivy Cy2, Cy2, Cy5. Po smísení mohou být různě označené vzorky analyzovány na jednom gelu díky rozdílným vlnovým délkám excitačních a emisních záření [32]. Identifikace proteinů separovaných na 2D‑PAGE se provádí na hmotnostních spektrometrech. Vybrané proteinové skvrny „spoty“ jsou z gelu vyříznuty, štěpeny proteolyticky a chemicky. Výsledné peptidy jsou analyzovány hmotnostní spektrometrií (MS – Mass Spectrometry) s cílem identifikovat původní protein. Výhodou je vynikající rozlišení směsných proteinových komplexů, kdy může být separováno až několik tisíc proteinů. Nevýhodou je velká pracnost, nízká citlivost běžných barvicích technik a neschopnost odlišit proteiny s extrémně nízkými a vysokými molekulovými hmotnostmi. Největším přínosem pro tuto technologii byl vývoj sofistikovaného softwaru pro analýzu komplexních dat z 2D PAGE [19, 25].

B. Proteinové profilování

MALDI –TOF-MS (matrix assisted laser desorption/ionization–time of flight–mass spectrometry)

Hmotnostní spektrometrie je založena na rozdělení nabitých částí podle jejich molekulových hmotností v elektrickém či magnetickém poli. K ionizaci vzorku se využívá laser. Je třeba zajistit efektivní a kontrolovaný přenos energie na vzorek, ale na druhou stranu i zabránit jeho tepelnému rozkladu. Pokud jsou molekuly vzorku ionizovány laserem přímo, štěpí se většinou nežádoucím způsobem. Proto se využívá látky – matrice, jejímž prostřednictvím se ionizační energie laseru přenáší na molekulu vzorku, a tím brání jejímu štěpení. Směs matrice a vzorku na vhodném nosiči (např. nerezové destičce) je zasažena pulzem laseru. Matrice energii pulzu absorbuje a její rozklad ionizuje molekuly vzorku. Ionty analyzované látky jsou urychleny silným elektrickým polem a vstupují do vakua trubice detektoru letu, kde se pohybují rychlostí danou jejich hmotností a nábojem. Zde je měřena doba letu částice, z níž se vypočte poměr molekulové hmotnosti a náboje částice (m/z).

Dekker a kol. použil MALDI-TOF-MS k vyšetření mozkomíšního moku 106 pacientek s karcinomem prsu a 45 zdravých pacientek. Nalezli 164 rozdílně exprimovaných proteinů [64]. Byly také popsány proteomické nálezy v séru u pacientek s ovariálním karcinomem užitím této techniky [11].

SELDI –TOF-MS (surface enhanced laser desorption/ionization – time of flight –mass spetrometry)

Spektra proteinů mohou někdy být příliš komplikovaná a není v nich snadné nalézt proteiny o velmi nízké koncentraci. Tyto obtíže se vyřešily implementací specifické prefrakcionace proteinů. Terčíky pro měření vzorků jsou pokryty specifickými chromatografickými sorbenty, které zachycují pouze cílové spektrum proteinů, přičemž vzorky v hmotnostním spektrometru jsou měřeny přímo z nich. Tato technologie je známa jako SELDI – TOF – MS. Univerzálnost této technologie spočívá v chemické interakci povrchu terčíku s analyzovaným materiálem. Tyto terčíky mohou být vyrobeny podle požadavku zákazníka, aby byly schopny vázat specifickou skupinu proteinu z analyzovaného vzorku. Následná analýza probíhá ve shodném principu s MALDI-TOF-MS. Velkou výhodou této technologie je skutečnost, že daný vzorek komplexní směsi proteinů je analyzován současně na několika různých sorbentech, aby se navázaly a analyzovaly veškeré proteiny ve studovaném vzorku.

V roce 2002 Petricoin poprvé použil SELDI technologii k analýze vzorků od 50 pacientek s CAO a 66 žen s nemaligním onemocněním. Získané výsledky měly 100% senzitivitu a 95% specificitu. Za pomoci rozdílných proteinových profilů odlišil všechny případy I. stadia [45]. Conrads a kol. správně predikoval všech 18 případů pacientek s I. stadiem CAO. V multicentrické studii za využití technologie SELDI-TOF-MS detekoval tři biomarkery [11]. Ty byly následně Zhangem a kol. identifikovány jako apolipoprotein A1, zkrácená forma transthyretinu a odštěpený fragment inter-trypsinového inhibitoru těžkého řetězce H4 [61]. Byly označeny za potenciální biomarkery časných stadií CAO. Wang a kolektiv ve své studii popsal proteinový profil obsahující 7 proteinových peaků odlišujících plazmu pacientek s pokročilým karcinomem ovaria od zdravých pacientek. Zjištěná senzitivita byla 93,94 % a specificita 93,55 %. Senzitivita tak významně převyšovala možnosti CA-125 (45,5 % pro časná a 84,8 % pro pozdní stadia CAO). Přestože profil (resp. peaky) byly stanoveny z plazmy pacientek s pokročilým karcinomem, také časná stadia CAO byla s pomocí proteomiky správně diagnostikována v 9 z 11 případů ( 81,82 %), což v případě CA-125 bylo jen v 5 z 11 (45,4 %) [55]. Bohužel, přestože bylo publikováno již několik studií, výsledky různých laboratoří se liší. I studie Wanga přinesla zcela odlišné výsledky. Důvody a příčiny mohou být rozmanité: rozdílné vzorky, odlišné bioinformatické nástroje k analýze dat z MS, rozdíly v proteinových čipech, složitá vnitřní komplexita ovariálního karcinomu, rasové rozdíly a jiné. Nelze opomíjet fakt, že v některých studiích bylo užito sérum a v dalších plazma. Přestože použití séra je běžnější, vyšetření plazmy se zdá vhodnější.

C. „Shotgun“ proteomika

S rozvojem tandemové hmotnostní spektrometrie je spojen tzv.„shotgun“ přístup [53]. Tandemovou spektrometrii si lze představit jako dva spektrometry sériově spojené kolizní celou, ve které dochází k fragmentacím. Při shotgun technice je směs proteinů o různé komplexitě štěpena specifickou proteázou. Vzniklé peptidy jsou nejprve separovány a následně analyzovány tandemovým hmotnostním spektrometrem. Tyto dva systémy mohou být spojeny jak on-line, kdy kapilára z kapalinové chromatografie přímo ústí do ionizačního zdroje typu ESI (elektrosprej), nebo off-line pomocí sběrače frakcí. Technologii s vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a ionizačním zdrojem typu ESI a následnou analýzu peptidů pomocí MS využil k vyšetření lyzátu buněk ovariálního karcinomu Kachman a kol. Nalezl 50 unikátních proteinů z ovariálního karcinomu a dále velký počet proteinů ze vzorku nádorové tkáně, které byly down regulované v porovnání s normálními buňkami [26]. Tandemové uspořádání spektrometrů dovoluje nejprve změřit MS spektrum intaktních peptidů. V případě detekce peptidu splňujícího určité požadované parametry se tento peptidový prekurzor v hmotnostním spektrometru izoluje, v kolizní cele je podroben fragmentaci a vzniklé fragmenty poskytují MS/MS spektrum [1]. Na základě dat získaných z MS a MS/MS spekter probíhá identifikace jednotlivých složek původní směsi proteinů [43]. Hlavním cílem dřívějších proteomických studií byla především identifikace proteinů. Dnes se však stále více zaměřují na kvantitativní a komparativní analýzy, u kterých je potřeba určit a porovnat vzájemnou koncentraci proteinů v jednotlivých vzorcích. Dominují zde dva přístupy. Kvantifikace label free (bez značení) a pomocí značení stabilními izotopy. Ta prvá je založena na přímém porovnání intenzit MS signálů mezi jednotlivými experimenty [9]. Mezi značícími technikami získávají dnes převahu postupy umožňující analyzovat více vzorků v jednom experimentu. Sem patří např. technika iTRAQ (Isobaric Tag Relative and Absolute Quantification), která umožňuje analýzu až čtyř až osmi vzorků v jednom experimentu [46].

VERIFIKAČNÍ (POTVRZOVACÍ) METODY

Bez ohledu na užitou metodu v prvním kroku procesu hledání biomarkeru musí být výsledné kandidátní markery intenzivně testovány a potvrzeny. To je několikastupňový proces, kdy na začátku stojí velká skupina potenciálních kandidátních markerů, která se pozvolna zeštíhluje procesem eliminace nízce senzitivních a specifických markerů. Výsledkem je nepočetná cílová skupina kandidátních molekul. Počet kandidátních markerů ubývá s nárůstem testovaných vzorků a cenou projektu [47]. Tato ověřovací fáze je zaměřena především na specificitu kandidátů. Ta samozřejmě vyžaduje ve srovnání s první fází velké počty testovaných vzorků. Závěrečným krokem je fáze validační, tedy testování na klinických vzorcích. Zde je také již nutné vytvoření vhodných komerčních kitů. Metodou volby stále zůstává RIA, či ELISA.

Pomocí protilátek – Western blot a ELISA

Western blot funguje na bázi elektroforézy a enzymatické reakce. První část procesu se skládá z klasické elektroforézy, kdy je antigen nanesen do polyakrylamidového gelu a separován v elektrickém poli podle molekulární hmotnosti antigenu. Na gelu se vytvoří tzv. bandy (proužky). Gel se následně přiloží na membránu a na blotovacím zařízení působením elektrického proudu dojde k přeblotování proteinů z gelu do membrány. Na membráně vzniknou jakoby „kopie“ proteinů separovaných na gelu. Po nastříhání na potřebný počet proužků se každý proužek s proteiny nechá inkubovat s testovaným sérem (protilátkami). Poté se přidá konjugát, tj. protilátky proti druhově specifickým protilátkám, značené enzymy. Bandy, na něž se specifické protilátky nenavázaly, se obarví. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci protilátek. Metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a lze s ní rovněž detekovat i antigen. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Za prvé je to jejich schopnost vázat se na povrch umělých hmot (např. polystyrenu) a za druhé pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty imunoglobulinových molekul.

TMA technologie – imunohistochemický panel

Tento termín byl poprvé použit v roce 1998 v souvislosti s popisem sady obsahující velký počet (až 1000) vzorků tkáně v jednom parafinovém bločku [29]. TMA byl vyvinut k řešení rostoucí potřeby vysokorychlostních metod genových validací. Velmi usnadňuje retrospektivní studie s velkými soubory tkáňových vzorků fixovaných v parafínu, event. formalinu. TMA umožňuje simultánní analýzu až 1000 tkáňových vzorků při jednom experimentu využitím všech typů „in situ“ analýz včetně metod imunohistochemických, FISH (fluorescence in situ hybridization) a RNA in situ hybridizace. Zásadní je, že místo stovek samostatných tkáňových bločků se použije jeden blok zahrnující všechny vzorky.

Proteinové mikrosady

Proteinové mikrosady umožňují vyšetření až stovek cílových proteinů v jednom experimentu. Pomocí této techniky byla zjišťována hladina 169 kandidátních proteinů v séru 28 zdravých žen, 18 žen s časným stadiem CAO a 40 žen s rekurentním onemocněním [40]. Byly verifikovány tyto čtyři kandidátní proteiny: leptin, prolaktin, OPN a insulin like growth factor II. Studie s vysokou efektivitou (95 %) odlišila zdravé pacientky od pacientek s časným stadiem (FIGO I a II ) CAO. Kombinace těchto čtyř proteinů má 95% senzitivitu, 95% specificitu a 94% negativní prediktivní hodnotu.

MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Všechny nově nalezené biomarkery potřebují striktní a přesné ověření před jejich možným vstupem do klinického využití. Konvenční techniky s použitím protilátek jsou sice účinné, ale mají více limitací a omezení,než benefitu. K usnadnění a zrychlení tohoto procesu byla navržena MRM technologie využívající výhod hmotnostního spektrofotometru [22].

ZÁVĚR

V budoucích letech můžeme očekávat změny v diagnostice časných stadií různých nádorových onemocnění. Těsné spojení vědy a výzkumu s klinickou medicínou nabídne nové biomarkery k lepší a přesnější detekci maligních onemocnění. Použité moderní technologie rozšiřují nejen počty biomarkerů, ale usnadňují a zkracují jejich validaci.

MUDr. Marian Kacerovský

Porodnická a gynekologická klinika

FN a LF Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové