Srovnání hladin prolaktinu, fT3 a fT4 ve folikulární tekutině žen s poruchou plodnosti a zdravých plodných dárkyň oocytů

Súhrn

Cíl studie:
Folikulární tekutina (FT) zajišťuje charakteristické a nezastupitelné mikroprostředí, které ovlivňuje vývoj oocytu. Biochemické složení FT má zásadní vliv na vývojový potenciál vajíčka. Cílem naší práce bylo srovnání hladin vybraných hormonů v FT žen s poruchou plodnosti a zdravých plodných dárkyň oocytů.

Typ studie:
Retrospektivní komparativní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Ústav histologie a embryologie, LF UK a FN v Plzni; Gynekologicko-porodnická klinika FN a LF UK v Plzni; Institut reprodukční medicíny a endokrinologie, IVF Centra Prof. Zech, Plzeň.

Metodika:
Hladiny prolaktinu, volného T3 (fT3) a volného T4 (fT4) hormonu byly analyzovány v FT u obou sledovaných skupin. Celkem jsme vyšetřili 146 žen – 74 pacientek léčených pro neplodnost (průměrný věk 31 let, SD = 4,65) a 72 zdravých plodných žen, dárkyň oocytů (průměrný věk 26 let, SD = 4,44). U každé ženy byly použity vzorky FT bez příměsi krve a ze všech folikulů dohromady, tedy ze společného poolu. Hladiny hormonů byly stanoveny pomocí metodiky ECLIA (elektrochemiluminiscenční imunoanalýza) na přístroji Cobas e411.

Výsledky:
Výsledky analýz prokázaly statisticky signifikantně vyšší hladiny prolaktinu (p = 0,0006) a volného T4 hormonu (p=0,0246) u žen s poruchou plodnosti oproti skupině zdravých plodných dárkyň oocytů.

Závěr:
Naše studie potvrzuje přítomnost prolaktinu a tyroideálních hormonů ve FT a naznačuje jejich klíčovou roli v regulaci reprodukčních procesů. Další studium dárkyň oocytů a jejich podrobnější srovnání s neplodnými pacientkami s různými gynekologickými příčinami poruch plodnosti bude přínosem pro objasnění patofyziologických mechanismů regulujících plodnost.

Klíčová slova:
folikulární tekutina, prolaktin, volný T4, neplodnost, dárkyně ovocytů.

ÚVOD

V současné době trpí neplodností 10–15 % párů v reprodukčním věku. Ačkoli se metody léčby neustále zdokonalují, přibližně 10 % párů nepomůže k otěhotnění žádná z metod asistované reprodukce. Dokonalejší pochopení regulačních procesů reprodukce umožní v budoucnu zvyšování úspěšnosti léčby neplodnosti, a to nejen metodami asistované reprodukce. Z toho důvodu je jednou z cest snaha o lepší pochopení a identifikaci faktorů, jež regulují vývojový potenciál oocytu.

Folikulární tekutina (FT) zajišťuje charakteristické a nezastupitelné mikroprostředí, ve kterém dochází k vývoji oocytu. Na jejím vzniku se podílí jednak přestup složek krevní plazmy přes folikulární bariéru a zároveň sekreční aktivita buněk téky a granulózy [7]. Biochemické složení FT hraje zásadní roli pro kvalitu oocytu, zvláště pro jeho schopnost fertilizace a následný vývoj embrya.

Ačkoliv hodnocení kvality oocytu při léčbě neplodnosti metodami asistované reprodukce dnes nejčastěji probíhá metodami založenými na morfologické klasifikaci folikulu, komplexu cumulus – oocyt, polárního tělíska nebo dělicího vřeténka [19], experimentálně (a také mnohými retrospektivními studiemi) bylo prokázáno, že pro stanovení vývojového potenciálu bude možno využívat nejrůznější biochemické a molekulárně biologické markery. Mezi vhodné indikátory kvality oocytu byly v literatuře v minulosti zařazeny některé tzv. vnitřní markery – charakter mitochondrií oocytu či aktivita glukóza-6-fosfátdehydrogenázy 1 v cytoplazmě, ale také faktory zevní (apoptóza folikulárních buněk či hodnoty některých působků v séru – např. rodiny TGFß, anti-mülleriánského hormonu, inhibinu B atd.) [1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 13, 17, 18, 20, 21].

V ose hypotalamus-hypofýza-gonády / štítná žláza probíhají vzájemné interakce před otěhotněním i v průběhu těhotenství – jednak přímým působením tyroidních hormonů na ovaria a dále nepřímo skrze vliv na sex hormon-binding globulin (SHBG), prolaktin a gonadotropin-releasing hormon.

Prolaktin je hormon syntetizovaný adenohypofýzou a k jeho vylučování do oběhu dochází intermitentně. Cílovým orgánem pro jeho působení je mléčná žláza. Je tvořen 198 aminokyselinami, jeho molekulová hmotnost je přibližně 22–23 kDa a v séru se vyskytuje ve třech různých formách. Biologicky a imunologicky aktivní monomerická forma převažuje (asi 80 %), 5–20 % tvoří biologicky neaktivní forma dimeru a 0,5–5 % je přítomno jako tetramer, který má slabou biologickou aktivitu. Zvýšené hladiny prolaktinu mají inhibiční účinky na steroidogenezi ovarií a rovněž na produkci a sekreci hypofyzálních gonadotropinů. Během těhotenství narůstá koncentrace prolaktinu pod vlivem zvyšující se produkce estrogenu a progesteronu.

Hyperprolaktinémie může být příčinou poruch fertility u mužů i žen. Stanovení prolaktinu je užíváno při diagnostice anovulárního cyklu, hyperprolaktinemické amenorey a galaktorey, gynekomastie a azoospermie. Prolaktin je také stanovován při podezření na karcinom prsu a podvěsku mozkového.

Trijodtyronin je jedním z hormonů štítné žlázy přítomným v séru. Hlavní část celkového trijodtyroninu je vázána na transportní proteiny (tyroxin vázající protein, TBG), prealbumin, albumin) a aktivní formou je pak volný trijodtyronin (fT3). Hormon štítné žlázy tetrajodtyronin (tyroxin, T4) je fyziologickou částí regulační smyčky štítné žlázy s vlivem na celý metabolismus.

Sérové hladiny prolaktinu i hormonů tyroideálních prokazatelně ovlivňují ovariální funkce, nicméně v literatuře není zatím popsáno, jak souvisí hladiny těchto hormonů v FT s ovariální činností, či dokonce plodností ženy.

Obě formy, volný trijodtyronin i tetrajodtyronin, byly detekovány ve FT [21], ale jejich význam pro vývoj a kvalitu oocytu nebyl zatím objasněn.

SOUBOR ŽEN A METODIKA

Studovaný soubor tvořilo 146 žen, z toho bylo 74 pacientek (průměrný věk 31 let, SD = 4,65) léčených pro neplodnost v Institutu reprodukční medicíny a endokrinologie – IVF Centra Prof. Zech. Kontrolní skupinu tvořilo 72 zdravých plodných žen, dárkyň oocytů (průměrný věk byl 26 let, SD = 4,44). Všechny sledované ženy měly normální hladiny prolaktinu i hormonů štítné žlázy v krvi. Po detailním seznámení s problematikou a po podpisu informovaného souhlasu byla ženám odebírána FT v době odběru oocytů v průběhu jejich léčby neplodnosti metodami asistované reprodukce. Vyšetřovány byly tzv. pooly FT, tedy směs ze všech folikulů, u nichž nedošlo ke kontaminaci krví v průběhu odběru oocytů. Ve FT byly stanoveny hladiny prolaktinu, volného T3 a volného T4. Metoda stanovení hormonů prolaktinu a volného T3 a T4 byla založena na sendvičovém principu elektrochemiluminiscenční imunoanalýzy (ECLIA) s využitím kitů Prolactine II, kitem FT3 a FT4 (ROCHE Diagnostics, ČR) na přístroji Cobas e411.

Stanovení Elecsys Prolactin II využívá dvě monoklonální protilátky, speciálně směrované proti lidskému prolaktinu a metoda stanovení volného T3 i volného T4 využívající testu Elecsys FT3 a FT4 je založena na využití specifické protilátky proti T3 a T4, které jsou obě značené ruteniovým komplexem.

Tato studie byla schválena etickou komisí LF UK v Plzni a všechny pacientky podepsaly informovaný souhlas.

Statistické hodnocení

Výsledky byly statisticky hodnoceny pomocí Wilcoxonova neparametrického testu (nepárová varianta) a dále analýzou rozptylu (ANOVA, post hoc analýza pomocí Tukeyovy metody mnohonásobného porovnávání). Hodnoty p < 0,05 byly považovány za statisticky signifikantní.

VÝSLEDKY

Porovnávány byly hladiny prolaktinu, volného T3 a volného T4 ve skupinách žen léčených pro neplodnost a kontrolních plodných dárkyň oocytů. Z tabulky 1 a grafů 1 a 3 je zřejmé, že u neplodných žen byly naměřeny signifikantně vyšší hladiny prolaktinu (p = 0,0006) i fT4 hormonu (p = 0,0246), avšak koncentrace fT3 se mezi skupinami významně nelišily (graf 2).

Protože plodnost žen je silně ovlivněna věkem a protože naše skupiny plodných a neplodných se liší věkovým složením, porovnali jsme hladiny hormonů mezi plodnými a neplodnými ženami ve stejných věkových obdobích. Mezi skupinami plodných a neplodných žen ve věkovém rozmezí 20 až 29 let je statisticky signifikantní rozdíl v hladinách prolaktinu v FT (p = 0,026*) a mezi skupinami ve věkovém rozmezí 30-39 let je statisticky signifikantní rozdíl v hladinách prolaktinu (p = 0,0256) i fT4 (p = 0,0175). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Dále jsme porovnali hladiny hormonů uvnitř obou skupin v závislosti na věku, ty se však již signifikantně neliší – výsledky jsou shrnuty v tabulkách 3 a 4.

DISKUSE

Role prolaktinu v FT nebyla plně vysvětlena a v literatuře neexistují ani dostatečná data o vztahu k hladinám prolaktinu v séru [10, 11]. Skutečnost, že zdravé plodné dárkyně mají signifikantně nižší hladiny prolaktinu v FT, nehledě na věkovou skupinu, v níž hladiny sledujeme, naznačuje, že prolaktin bude pravděpodobně významným regulačním faktorem pro vývojový potenciál oocytu. Poznání patofyziologického mechanismu, kterým prolaktin k regulaci přispívá, opět může vést ke zvýšení individualizace léčby neplodnosti.

Náš překvapivý nález statisticky signifikantně vyšších hladin fT4 hormonu u neplodných žen se podle našeho mínění odvíjí od faktu, že mnoho našich pacientek, jež byly léčeny pro neplodnost a analyzovány v této studii, mělo podle anamnestických údajů diagnostikovánu subklinickou hypotyreózu a užívalo substituční terapii. V našich podmínkách je screening tyroideálních dysfunkcí doporučován široké škále pacientek léčených pro neplodnost – všem s anamnézou hyper- či hypotyroideální poruchy, ženám s diabetem typu 1 či s jakoukoliv jinou autoimunitní poruchou, ženám po léčbě maligního onemocnění s prodělanou radioterapií v oblasti hlavy či krku atd. Tyroideální onemocnění před otěhotněním i v průběhu těhotenství vyžaduje speciální management s ohledem na změny tyroideálních funkcí v těhotenství [16]. Ačkoliv se v současné době endokrinology doporučený postup pravděpodobně velmi blíží optimálnímu nastavení substituční terapie, další poznání toho, jak se hladiny fT4 promítají ze séra do FT a jak pak tyto hladiny ovlivňují vývojový potenciál oocytu, jistě může přispět k ještě citlivějšímu a více personalizovanému způsobu léčby.

Vztahy sérových hormonálních hladin a hladin hormonů v FT jsou komplexní a jejich regulace i role jsou doposud ne zcela jasné [5, 9, 14]. Další studium dárkyň oocytů a jejich podrobnější srovnání s neplodnými pacientkami s různými gynekologickými příčinami poruch plodnosti bude přínosem pro objasnění patofyziologických mechanismů regulujících plodnost a také ovlivňujících úspěšnost při léčbě neplodnosti.

ZÁVĚR

Naše studie potvrzuje přítomnost prolaktinu a tyroideálních hormonů v FT a naznačuje jejich klíčovou roli v regulaci reprodukčních procesů. Neplodné ženy mají statisticky významně vyšší hladiny PRL v FT. Hormonální složka FT hraje významnou úlohu ve vývoji oocytu, a proto kompletní znalost biochemického složení FT a poznání role jednotlivých složek bude v budoucnu hrát roli v poznání zatím nejasných patofyziologických mechanismů neplodnosti i faktorů, jež ovlivňují úspěšnost její léčby.

Naše předložené výsledky jsou založeny na analýzách poolů FT, hodláme je ale dále zpřesnit sledováním hladin prolaktinu v monofolikulárních vzorcích. Hladiny prolaktinu budeme dále kolerovat s dosaženými pregrancy rate, čímž by se prolaktin ve FT mohl stát jedním z prognostických markerů.

Tato studie je podporována projektem OP VaVpI PO 2 Biomedicínské centrum CZ.1.05/2.1.00/03.0076, grantem GA UK 696212 a projekty specifického vysokoškolského výzkumu (SVV 264 808 a 264 804).

MUDr. Miroslava Čedíková

Ústav histologie a embryologie LF UK

Karlovarská 48

301 00 Plzeň

e-mail: miroslava.cedikova@lfp.cuni.cz