Směrnice ke správné laboratorní praxi při asistované reprodukci – čistota prostředí

Souhrn

Směrnice jsou doporučením ke správné laboratorní praxi v embryologických laboratořích. V této první části jsou popsány požadavky na čistotu prostředí z hlediska ochrany oocytů, spermií a embryí před infekcí a z hlediska ochrany zdraví pracovníků embryologické laboratoře.

Klíčová slova:
směrnice, správná laboratorní praxe, klinická embryologie, embryologická laboratoř

ÚVOD

Tyto směrnice mají sloužit jako doporučení ke správné laboratorní praxi v embryologických laboratořích pracovišť reprodukční medicíny v České republice. Tato doporučení opíráme o Revised guidelines for good practice in IVF laboratories [19], publikované odborné poznatky a vlastní dlouholetou praxi. Ve článku se snažíme objasnit smysl jednotlivých doporučení.

Dodržování čistoty prostředí v embryologické laboratoři má zabránit mikrobiologické kontaminaci reprodukčních buněk. Z hlediska biologické podstaty a možných důsledků kontaminace je třeba rozlišit jednak kontaminaci mikroorganismy, které se mohou v kultivačním prostředí množit a které jsou ubikvitární (většina bakterií a houby) od mikroorganismů, které se v kultivačním prostředí nemnoží a jejichž zdrojem může být výlučně biologický materiál pocházející od nosiče onemocnění (viry, některé bakterie, např. Treponema pallidum).

Konkrétní pozornost věnuje vyhláška [33] infekčním agens, která mohou vyvolat zvlášť závažné následky pro příjemce kontaminovaných reprodukčních buněk. Ochrana je předepsána u infekce HIV typu 1 a 2, hepatitid B a C a syfilis, u dárců pocházejících z endemických oblastí také HTLV I. Pracovníci embryologické laboratoře ovšem musí s ohledem na kvalitu výsledků a bezpečnost příjemců reprodukčních buněk přiměřeně chránit reprodukční buňky před jakoukoliv infekcí.

KONTAMINACE BAKTERIEMI A HOUBAMI

Bakteriální a mykotická kontaminace je v asistované reprodukci významná ze dvou důvodů. Jednak může způsobit růst bakterií nebo hub v kultivačním médiu a poškodit vyvíjející se embrya, jednak by mohla při transferu embrya způsobit infekční onemocnění ženských pohlavních orgánů. Mezi nejčastější prokázané kontaminanty patří Escherichia coli a Candida species [15]. Zvláštní skupinu tvoří infekční agens, která by mohla při jiném než autologním přenosu vyvolat systémové onemocnění příjemkyně, například Treponema pallidum. U těchto infekcí platí obdobná pravidla jako u infekcí viry přenášenými krví, kde jsou popsána.

Reprodukční buňky mohou být bakteriemi nebo houbami teoreticky kontaminovány v těle dárce, při odběru, při laboratorním zpracování a přenosu do těla příjemce. Pro účely asistované reprodukce jsou zpracovávány výchozí biologické materiály, a to folikulární tekutina obsahující kumulus s oocytem, ejakulát obsahující spermie nebo jsou spermie získávány z testikulární tkáně, popřípadě z aspirátu z nadvarlete.

Folikulární tekutina je primárně z hlediska kontaminace bakteriemi a houbami sterilní, může být s určitou malou pravděpodobností kontaminována při průchodu punkční jehly vaginálním prostředím [2, 20, 29, 31]. Folikulární tekutina je zpracovávána ve sterilním prostředí laminárního boxu a oocyt je z ní vyjímán s kumulem a minimálním množstvím tekutiny a je několikanásobně proprán sterilním roztokem, takže lze očekávat, že pravděpodobnost přenosu infekce komplexem kumulus-oocyt do kultivačního média je minimální.

Ejakulát není sterilní, bakterie jsou častou součástí spermatu i bez známek zánětlivého procesu [4, 10]. Kromě toho se setkáváme s přítomností původců sexuálně přenosných onemocnění (urea-plazmata, mykoplazmata, chlamydie). Spermie jsou pro oplození získávány buďto kombinací prosté centrifugace a metody vycestování (swimm up) nebo metodou gradientové centrifugace nebo kombinací gradientové centrifugace a swimm up. Naprosto nevhodné je použití pouhé centrifugace a následné resuspendace pelety v médiu, kdy zůstává materiál kontaminovaný [11]. Tyto metody výrazně snižují bakteriální a mykotickou kontaminaci, nicméně i přesto mohou být spermie zdrojem kontaminace kultivačního média [7, 15]. Při použití metody ICSI nebyla kontaminace kultivačního média prostřednictvím spermií prokázána [15].

Testikulární tkáň a aspirát z nadvarlete jsou získávány za sterilních podmínek, a pokud nejsou ve varleti nebo nadvarleti přítomny známky infekce, můžeme je považovat za sterilní.

K bakteriální a mykotické kontaminaci kultivačního média může kromě potenciálního přenosu reprodukčními buňkami dojít spadem kontaminovaného aerosolu nebo větších částic nebo kontaktem nesterilní ruky nebo nástroje s kultivačním médiem.

OPATŘENÍ K ZÁBRANĚ BAKTERIÁLNÍ A MYKOTICKÉ INFEKCI

Spadu kontaminovaného aerosolu nebo větších částic bráníme důsledným zakrýváním kultivačních nádobek víčkem, které odkrýváme jen při manipulaci s jejich obsahem. Manipulaci vždy, když je to možné a vhodné, provádíme v prostředí odpovídajícím co do počtu částic a mikrobních kolonií třídě čistoty A. V ostatních případech pracujeme v prostředí, odpovídajícím co do koncentrace částic a počtu bakteriálních kolonií třídě čistoty nejméně D.

Hodnoty koncentrace částic a mikrobního spadu jsou stanoveny v EU Guidelines [12].

Maximální dovolené množství částic velkých 0,5 µm v m3 vzduchu odpovídající třídě A je v klidovém i pracovním režimu rovno nebo menší než 3520 částic velkých 5 µm rovno nebo menší než 20. Mikrobiální spad na misku o průměru 90 mmza 4 hodiny je menší než 1 kolonie.

Maximální dovolené množství částic velkých 0,5 µm v m3 vzduchu odpovídající třídě D je v klidovém režimu (pro pracovní režim není definováno) rovno nebo menší než 3520 000, částic velkých 5 µm rovno nebo menší než 29 000. Mikrobiální spad na misku o průměru 90 mm za 4 hodiny je menší než 100 kolonií.

V prostředí odpovídajícím třídě čistoty D můžeme očekávat maximální spad nejvýše 0,3 bakterie na centimetr čtvereční za 1 hodinu. Z toho vyplývá, že pravděpodobnost kontaminace kultivačního média je i při práci s odkrytou miskou naprosto zanedbatelná. Bezpečnost se ještě zvyšuje překrytím kultivačního média parafinovým olejem a obsahem antibiotika ve většině komerčních médií.

Dodržování prostředí odpovídajícího co do počtu částic a mikrobních kolonií třídě čistoty A vyžaduje práci v laminárním proudění sterilního vzduchu. Tato vyšší intenzita proudění vzduchu vyvolává nežádoucí vedlejší efekty, jako je například ochlazování kultivačních médií, změna jejich složení v důsledku zvýšeného odpařování, změna v koncentraci rozpuštěných plynů, vlnění hladiny a vibrace. Z toho důvodu je třeba minimalizovat expozici odkrytých misek s kultivačním médiem a reprodukčními buňkami tomuto prostředí.

Práce v proudícím vzduchu není vhodná zejména při mikromanipulaci a vitrifikaci oocytů a embryí, kdy dostatečnou ochranu před kontaminací poskytuje prostředí odpovídající co do koncentrace částic a mikrobních kolonií třídě D.

Při kultivaci reprodukčních buněk a manipulaci s nimi používáme výlučně jednorázový sterilní materiál, určený pro IVF nebo pro tento účel validovaný.

Důsledně myjeme a dezinfikujeme ruce, které při práci v embryologické laboratoři musí být prosté prstenů, náramků a podobných předmětů. Používáme ochranný oděv a obuv, určené jen pro práci v laboratoři.

Důležitým opatřením pro bezpečnost reprodukčních buněk, a to nejen mikrobiologickou, je zákaz vstupu do prostor embryologické laboratoře pro všechny osoby s výjimkou jejích pracovníků. Pokud vstupují v odůvodněných případech do embryologické laboratoře jiné osoby, vyžaduje se převlečení do ochranného oděvu, včetně čepice a roušky. Tyto osoby musejí být předem poučeny o chování v embryologické laboratoři a mohou v jejích prostorách pobývat jen za nepřetržité přítomnosti pracovníka embryologické laboratoře.

Je dodržován zákaz jídla, pití a kouření v prostorách embryologické laboratoře. Je třeba maximálně omezit práci s papírovými dokumenty v laboratoři. Pracovníci by neměli v prostorách laboratoře setrvávat v době, kdy zde právě nepracují.

Při práci s odkrytou miskou musíme zabránit kontaminaci kapénkami z úst a nosu a vlasy nebo šupinami kůže pracovníka manipulujícího s kulturou reprodukčních buněk. To zajišťujeme bezvýhradným používáním ochranné roušky a čepice.

Možné kontaminaci z pipet bráníme užíváním sterilních špiček s filtrem, které bezprostředně po použití odhazujeme. Možné kontaminaci dotykem ruky nebo nesterilního předmětu předcházíme důsledným nácvikem jednotlivých úkonů, analýzou pohybů a pečlivou organizací práce.

Úklid v embryologické laboratoři

Denně před započetím práce v embryologické laboratoři se provádí vlhký úklid podlah, parapetů a dalších povrchů s použitím určených dezinfekčních prostředků. Důsledně myjeme a dezinfikujeme pracovní plochy. Úklid se provádí rovněž bezodkladně, pokud dojde ke kontaminaci pracovních ploch, povrchů nebo podlahy biologickým materiálem.

Pracovní plochy, na nichž přímo manipulujeme s oocyty a embryi, omýváme 60% ethanolem. Pokud použijeme jiný dezinfekční prostředek, omyjeme tyto plochy po dezinfekci destilovanou vodou.

Vnitřní povrchy inkubátorů čistíme v nepřítomnosti embryí. Inkubátory nevybavené možností tepelné sterilizace omýváme 60% ethanolem. Pokud použijeme jiný dezinfekční prostředek, omyjeme vnitřní plochy po dezinfekci destilovanou vodou. Inkubátory s možností tepelné sterilizace před sterilizací pouze mechanicky očistíme.

Dezinfekční prostředky

K dezinfekci používáme výlučně prostředky, které nejsou mutagenní, kancerogenní, cytotoxické nebo reprodukčně toxické. Složení dezinfekčních prostředků ověřujeme podle jejich bezpečnostních listů.

Za vhodné složky dezinfekčních prostředků jsou obecně považovány alifatické alkoholy (ethanol, propanol, isopropanol), ethoxylované alkoholy, ethoxylované alkylaminy, hydrogenperoxosíran draselný, kvartérní amoniové sloučeniny, peroxid vodíku a peruhličitan sodný.

K dezinfekci kryokonzervačních kontejnerů prováděné mimo prostory embryologické laboratoře je vhodná kyselina peroctová. Kontejnery je možno vrátit zpět až po odvětrání zbytků dezinfekčního prostředku.

Za dezinfekční prostředky nevhodné pro použití v embryologické laboratoři považujeme všechny aldehydy, fenoly, chlorové preparáty (s výjimkou 5% chlornanu na otírání malých ploch) a chlorované uhlovodíky.

Známky bakteriální a mykotické kontaminace kultivačního média

Známkou bakteriální a mykotické kontaminace kultivačního média je především mikroskopický průkaz přítomnosti kontaminujících mikroorganismů. Makroskopicky se kontaminace projevuje zákalem [15], případně i změnou barvy indikátoru, přítomného v médiu. Při zjištění známek kontaminace je vhodné odebrat vzorek pro ověření typu mikroorganismu a neprovádět transfer kontaminovaných embryí [15].

Frekvence a důsledky bakteriální a mykotické kontaminace

Infekční komplikace se vyskytují u 0,02–0,3 % cyklů asistované reprodukce s transferem embrya [3, 17, 24]. Z toho převážná většina jde na vrub zavlečení infekce do malé pánve při vaginální punkci, ne při transferu embrya [2, 20, 29, 31]. Navíc poševní prostředí, přes které provádíme transfer embrya, není sterilní [28]. Lze tedy konstatovat, že pravděpodobnost kontaminace děložní dutiny přenášenými embryi nebo médiem, v němž jsou transferována, je ve srovnání s možností zavlečení infekce z pochvy naprosto zanedbatelná.

Důvodem pro dodržování sterilních postupů je tedy zejména ochrana embryí před poškozením bakteriemi nebo houbami rostoucími v kultivačním médiu, jehož důsledkem by byla zástava vývoje embrya nebo jeho zánik. Kontaminace se v kultivačním médiu vyskytuje v 0,69 % [1], 0,35 % [8], respektive 0,68 % [15]. Prakticky všechny kontaminace lze přičíst na vrub ejakulátu [7, 15] a byly zjištěny jen při oplození bez mikromanipulace, při použití ICSI nebyly kontaminace prokázány vůbec [15].

Kontaminace viry přenášenými krví a Treponema pallidum

Infekce krví přenášenými viry (a analogicky některými dalšími infekčními agens, jako je např. Treponema pallidum) může způsobovat vysoce závažná onemocnění. Od běžných bakteriálních a mykotických agens se liší tím, že kontaminace cestou laboratorního prostředí je vysoce nepravděpodobná, vzhledem k neschopnosti těchto agens množit se in vitro mimo vhodné buňky. Pozornost proto musíme věnovat přímému přenosu biologickým materiálem z infekčního dárce a možné zkřížené kontaminaci. Infekčním materiálem může být folikulární tekutina, kumulus s oocytem, spermie, seminální plazma nebo testikulární tkáň, ev. aspirát z nadvarlete.

Reálných případů infekce způsobené iatrogenně při asistované reprodukci je málo. V literatuře popsané případy iatrogenní virové infekce po ART připadaly na vrub technicky špatně provedené intrauterinní inseminaci [11].

Virus hepatitidy B

Virus hepatitidy B (HBV) je lidský DNA virus (Hepadnaviridae, Orthohepadnavirus), způsobující hepatitidu B. Virus se přenáší infikovanou krví a tělními tekutinami, včetně spermatu a vaginálního sekretu. Prevalence nosičů HBV kolísá od 0,1 % do 2 % v USA, Kanadě, západní Evropě, Austrálii a Novém Zélandu, od 3 % do 5 % ve Středozemí, Japonsku, Střední Asii, Středním východě, a Latinské a Jižní Americe, od 10 % do 20 % v jihovýchodní Asii, Číně a subsaharské Africe [30]. Proti infekci HBV existuje účinné očkování.

Virus hepatitidy C

Virus hepatitidy C (HCV) je malý lidský RNA virus (Flaviviridae, Hepacivirus), způsobující hepatitidu C. Přenáší se převážně krví, přenos sexuálním stykem je sporný. Perzistuje v játrech u 85 % infikovaných. Prevalence nosičů HCV je vysoká (> 3,5 %) ve střední a východní Asii a severní Africe. Na Středním východě, jižní a jihovýchodní Asii, subsaharské Africe, střední a jižní Latinské Americe, Karibiku, Oceánii, Austrálii, a Evropě je střední prevalence (1,5–3,5 %). V Tichomoří, tropické Latinské Americe a Severní Americe je nízká (< 1,5 %) [21]. Proti infekci HBC dosud neexistuje účinné očkování.

Virus lidské imunodeficience

Virus lidské imunodeficience (HIV 1 a 2) je RNA virus, lentivirus (pomalu replikující retrovirus, Retroviridae, Lentivirus), je to původce AIDS. Vyskytuje se jako volné částice i v infikovaných imunocytech (CD4+ T buňky, makrofágy, buňky mikroglie) v krvi, spermatu, vaginálním sekretu, sekretu močové trubice a mateřském mléce. Přenáší se pohlavním stykem a krví. Prevalence nosičů HIV je velmi vysoká v subsaharské Africe (8–10 %). V severní Africe a na Středním východě je 0,2 %, v jižní a jihovýchodní Asii 0,7 % s výjimkou Kambodže, Myanmaru a Thajska, kde se pohybuje od 2 % do 4 %. Ve východní Asii a Tichomoří je 0,07 %. V Latinské Americe má vysokou prevalenci v Belize, Guatemale, Hondurasu, Panamě, Guyaně, Surinamu, Dominikánské republice (1,5–3 %), a zejména na Bahamách a Haiti(až 5 %). Východní Evropa a Střední Asie mají výskyt nízký s výjimkou Ukrajiny, Běloruska, Moldavska a Ruské federace. Západní Evropa, USA a Austrálie mají výskyt nízký [22]. Proti infekci HIV neexistuje účinné očkování.

Lidský T-lymfotropní virus

Lidský T-lymfotropní virus typ I (HTLV-1) je lidský RNA retrovirus (Retroviridae, Orthoretrovirinae, Deltaretrovirus), který způsobuje T-buněčnou leukemii dospělých, lymfom a demyelinizační chorobu HTLV-I asociovanou myelopatii/tropickou spastickou paraparézu. Je sexuálně přenosný, přenosný krví a může být přenesen i kojením. Je endemický v Karibiku, Japonsku, Jižní Americe a v některých částech Afriky [27]. Očkování je ve stadiu výzkumu.

Treponema pallidum

Treponema pallidum je bakterie (Spirochaetes, Spirochaetales, Spirochaetaceae, Treponema), způsobující syfilis. Přenáší se sexuálním stykem, krví, sekretem ze syfilitických afekcí a z matky na plod. Prochází neporušenou sliznicí a oděrkami v kůži. Vysoký výskyt byl zaznamenán v subsaharské Africe, zvyšuje se výskyt v Číně a Rusku [36]. Proti infekci neexistuje účinné očkování.

PŘÍMÁ KONTAMINACE

K přenosu infekce do kultivačního prostředí a následně embrya může dojít infikovanými reprodukčními buňkami a s nimi spojeným biologickým materiálem, popřípadě krevním sérem nebo jinými komponentami biologického původu (albumin, růstové faktory apod.), pokud by byly přidány ke kultivačnímu médiu. Literární údaje o reálné možnosti přetrvávání virové infekce v kultivačním prostředí jsou rozporné a uvádí se, že oplachování oocytů a embryí významně snižuje obsah virových částic [9].

Analýza na přítomnost HCV u pacientek pozitivních na HCV v krvi prokázala jeho přítomnost ve folikulární tekutině. Virus byl zjištěn v 89 % folikulárních tekutin, v 25 % kultivačních médií v den 1, v den transferu nebyl zjištěn v žádném vzorku [9]. HCV byl přítomen v zona intaktních oocytech u 70,8 % séropozitivních žen [26]. Cobo a kol. [6] uvádějí, že 30 % pacientek séropozitivních na HIV, HBV nebo HCV mělo virové částice v krvi. Při analýze kultivačního média použitého ke kultivaci embryí pocházejících od těchto pa-cientek a dusíku, v němž byla provedena vitrifikace, nebyly virové částice nalezeny. Nie a kol. [23] našli virové částice HBV přímo v 15 % embryí, kde muž byl HBsAg pozitivní a žena negativní a v 21 % oocytů a embryí, u párů, kde žena byla pozitivní a muž negativní. Hu a kol. [14] našli virovou DNA HBV v 9,6 % oocytů od séropozitivních žen a ve 14,4 % embryí u páru, kde alespoň jeden partner byl séropozitivní. Výskyt pozitivních oocytů a embryí byl mnohem vyšší u párů s vysokou koncentrací virových částic v krvi. Jejich práce však byla kritizována pro metodické nedostatky, které by mohly vést k falešně pozitivním výsledkům [13].

Z výše uvedených citací vyplývá, že pokud jsou přítomny virové částice v krvi, je třeba považovat krev, folikulární tekutinu a sperma za vysoce infekční materiál. Dále z nich plyne, že i když dalším zpracováním se přítomnost virových částic výrazně snižuje, je třeba považovat přenos virových infekcí reprodukčními buňkami za možný. Přímé kontaminaci bráníme důsledným vyšetřováním dárců reprodukčních buněk a používáním bezpečných komponent biologického původu. Pravděpodobnost přenosu infekce u partnerského darování se výrazně sníží vhodným propráním reprodukčních buněk.

Z hlediska možného přenosu virové infekce není vhodné použití resuspendované pelety vzniklé po centrifugaci ejakulátu bez oddělení spermií od ostatních buněk [9].

KŘÍŽOVÁ KONTAMINACE

Ke křížové kontaminaci by mohlo dojít při kontaktu reprodukčních buněk s infikovaným biologickým materiálem, a to přímo nebo prostřednictvím kontaminovaného laboratorního materiálu do kultivačního média [34].

Kryolahvičky uzavřené šroubovacím víčkem, ať už s těsněním, nebo bez něj, umožnují proudění kapalného dusíku dovnitř a ven. Pokud jsou používány, je nezbytné je chránit pomocí sekundárního obalu („second skin“ Cryoflex) nebo uchovávat je místo v kapalném dusíku v dusíkových parách [5]. Povrch pejet před jejich otevřením dezinfikujeme otřením 5% chlornanem [5] nebo jodisolem (Povidonum iodinatum) [16, 18, 35] nebo přípravkem s kvartérními amoniovými sloučeninami [25] (Oosave). Po aplikaci dezinfekčního prostředku je třeba povrch pejety otřít 60% ethanolem, který doplní dezinfekční účinek kvartérních amoniových sloučenin a odstraní zbytky dezinfekčních látek.

Při použití bezpečných primárních obalů nebyla křížová kontaminace viry HIV, HCV ani HBV nikdy zjištěna [34].

Křížové kontaminaci bezpečně zabráníme důsledným časovým a prostorovým oddělením manipulace s reprodukčními buňkami různých párů, abychom zabránili teoretické možnosti přenosu kapkami nebo aerosolem při rozptýlení biologického materiálu nebo kontaminovaných médií ve vzduchu. Používáme výlučně pipetovací špičky s filtrem. Ihned po použití odhazujeme použitý materiál do příslušných nádob tak, aby nemohl kontaminovat ruce nebo pracovní plochy.

Při kryokonzervaci/vitrifikaci používáme takové postupy, aby nemohlo dojít k přenosu virových částic mezi vzorky. Pokud dochází k přímému kontaktu vzorku s kapalným dusíkem, musí být kapalný dusík sterilizovaný a pro každého dárce individuální.

Při kryokonzervaci/vitrifikaci používáme primární obaly uzavřené svárem. Pokud používáme mechanické uzávěry primárních obalů, musí být použit i těsný sekundární obal. Suspektní nebo infekční reprodukční buňky uchováváme odděleně v karanténních kontejnerech.

Křížové kontaminaci předcházíme i pozornou a soustředěnou manipulací s reprodukčními buňkami.

OCHRANA PRACOVNÍKŮ PŘED INFEKCÍ

Z hlediska ochrany pracovníků před profe-sionální infekcí je třeba považovat veškerý lidský biologický materiál za infekční. Základní metodou ochrany pracovníků je správná manipulace s ostrým odpadem, průběžná dezinfekce pracovních ploch, používání ochranného oděvu a ústní roušky.

Při práci s folikulární tekutinou a spermatem je povinné používání rukavic z materiálu nepropustného pro viry a nealergizujícího. Pracovníci embryologické laboratoře jsou povinně očkováni proti hepatitidě typu B [31].

Poskytovatel zdravotních služeb je povinen bezodkladně oznámit příslušnému orgánu ochrany veřejného zdraví každé poranění zdravotnického nebo jiného odborného pracovníka, které vzniklo při manipulaci s ostrým kontaminovaným předmětem nebo nástrojem použitým k provádění zdravotních výkonů během poskytování zdravotní péče, v jehož důsledku by mohlo dojít ke vzniku infekčního onemocnění přenosného krví [31].

Prof. MUDr. Pavel Trávník, DrSc.

REPROMEDA s.r.o.

Viniční 235

615 00 Brno

e-mail: pavel.travnik@email.cz