NK buňky nejen v endometriu, ale i v ovulačním cervikálním sekretu u žen se sníženou plodností

NK cells not only in endometrium but also in ovulatory cervical mucus in patients with decreased fertility

Objective: An increased number of NK cells is associated with autoimmune disorder and is known to play a role in infertility. The aim of our research was to monitor the density of NK cells CD56+ and CD16+ in ovulatory cervical mucus (OCM) and in endometrium in infertile women as well as in connection with the actual status of antibodies against phospholipids, sperm and HHV-6 antibodies.

Type of study: Original aticle.

Setting: Genetika – Plzeň.

Methods: Seventy-two randomly selected women aged 20–39 (mean age: 32.3) years old resulted in fifty-seven patients with repeated unexplained miscarriages, and fifteen fertile healthy women. The hormonal status was studied including ovulation, the humoral autoimmune responses to eight phospholipids, trombophilia, karyotyping, hysteroscopy, and endometrium immunohistology. Patients were without any clinical and laboratory symptoms of vaginitis at the time of OCM sampling and endometrium study. In one patient antiphospholipid syndrome was present, and in one woman diabetes mellitus was identified. Uterine NK cells CD56+ , CD16+ and NK cells in OCM were identified by immunocytochemistry, antiphospholipid antiboides by ELISA. We used indirect MAR-test for study of local spermagglutinating antibodies in OCM. Indirect immunofluorescent method was used for detection of serum and OCM IgM, IgG antibodies against HHV-6 levels at the time of ovulation.

Results: We found both high density of NK cells CD56+ and CD16+ in OCM and in endometrium in only two infertile women with repeated abortions. NK cells in OCM were missing in other samples of patients. The prevalence of high density of NK cells CD56+ in the endometrium was seen in twenty three (40%), NK cells CD16+ in eleven (19%), NK cells 56+ and NK cells 16+ together in eight (14%). Levels of serum and OCM IgG against HHV-6 in all examined patients were not elevated, no cervical sperm antibodies were found.

Conclusion: We compared density of NK cells CD56+ and CD16+ in OCM and secretory endometrium in all infertile patients. Our results show that cell mucosal activity in the cervical area at the time of ovulation in two infertile patients was evident. We excluded the abnormal number of NK cells owing to local and general viral infection (HHV-6). But our question still remains – are cervical NK cells fixed or still migrating from endometrium into OCM? New research is planned.

Keywords:

endometrium – infertility – NK cells – ovulatory cervical mucus – HHV-6

Autoři: Z. Ulčová-Gallová ^1,2; P. Mukenšnabl ³; M. Haschová ⁴; M. Pešek ⁵; P. Chaloupka ⁵; P. Lošan ¹; K. Bibková ¹; Z. Mičanová ¹; J. Cibulka ¹; M. Švecová ⁶
Působiště autorů: Reprodukční imunologie, Genetika – Plzeň, přednosta MUDr. P. Lošan ¹; Gynekologicko-porodnická klinika LF UK a FN, Plzeň, přednosta doc. MUDr. Z. Novotný, CSc. ²; Šiklův anatomicko-patologický ústav LF UK, Plzeň, přednosta prof. MUDr. M. Michal ³; Oddělení klinické biochemie a imunologie, Nemocnice Privamed, Plzeň, přednosta Ing. Z. Jeřábek ⁴; Gynekologicko-porodnické oddělení, Nemocnice Privamed, Plzeň, přednosta MUDr. Z. Knaizl ⁵; Oddělení mikrobiologie a virologie, FN Plzeň, přednostka MUDr. M. Švecová ⁶
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2019; 84(3): 184-189
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Cíl studie: Je známo, že zvýšený počet NK buněk bývá spojován s autoimunitními poruchami a že hraje svoji úlohu i v neplodnosti. Cílem našeho výzkumu bylo sledování denzity NK buněk CD56+ a CD16+ v ovulačním cervikálním sekretu a v endometriu u žen se sníženou plodností i v souvislosti s aktuálním stavem protilátek proti fosfolipidům, spermiím i proti HHV-6.

Typ studie: Původní práce.

Název a sídlo pracoviště: Poradna pro imunologii reprodukce, Genetika – Plzeň.

Metodika: Sedmdesát dva náhodně vybraných žen ve věku 20–39 (průměrný věk 32,3) let jsme rozdělili na padesát sedm pacientek s opakovanými doposud nevysvětlitelnými potraty a patnáct zdravých fertilních žen. Sledovali jsme hormonální stav, včetně ovulace, humorální autoimunitní odpovědi ve screeningu reprodukční imunologie, trombofilní stavy, karyotypizaci, hysteroskopické nálezy a imunohistologicky i endometrium. V období odběrů ovulačních cervikálních sekretů (OCM) a endometria pacientky neměly žádné klinické ani laboratorní nálezy vaginitidy. U jedné z pacientek byl diagnostikován antifosfolipidový syndrom, jedna žena má diabetes mellitus I. Uterinní NK buňky CD56+ a CD16+ a NK buňky v OCM jsme idetifikovali imunochemicky, antifosfolipidové protilátky klasickou ELISA metodou. Použili jsme také nepřímý MAR-test ke sledování lokálních protilátek proti spermiím, dále nepřímou imunofluorescenci k detekci serových a OCM IgM, IgG protilátek proti HHV-6 v době ovulace.

Výsledky: Vysokou denzitu NK buněk CD56+ a CD16 v OCM a endometriu jsme nalezli pouze u dvou žen s opakovanými potraty. NK buňky v OCM v jiných vzorcích pacientek nenalezli. U dvaceti tří (40 %) pacientek jsme zjistili prevalenci vysoké denzity NK buněk CD56+, NK CD16+ u jedenácti (19 %), pozitivitu u obou společně, tedy NK buněk CD 56+ a CD 16+ u osmi (14 %). Aktuální sérové hladiny a v OCM v IgG proti HHV-6 byly u všech vyšetřovaných žen nezvýšené. U žádné ženy nebyly přítomny cervikální spermaglutinační protilátky.

Závěr: Srovnávali jsme denzitu NK buněk CD56+ a CD16+ v ovulačním sekretu a v sekrečním endometriu u infertilních pacientek. Naše výsledky prokázali slizniční buněčnou aktivitu v cervikální oblasti v období ovulace jen u dvou infertilních žen. Vyloučili jsme abnormální počet NK buněk z důvodu celkové nebo lokální infekce. Otázka ale zůstává otevřená pro další plánovaný výzkum – jsou cervikální NK buňky fixované, nebo migrují z endometria do OCM?

Klíčová slova:

endometrium – snížená plodnost – NK buňky – ovulační cervikální sekret – HHV-6

ÚVOD

NK buňky představují celkem asi 15 % periferních krevních lymfocytů, v endometriu však tvoří přibližně 70% většinu buněk imunitního systému, při čemž největší koncentrace bývá v období prvního trimestru těhotenství [1, 2, 8]. Deciduální NK buňky produkují cytokiny, které napomáhají trofoblastické invazi, růstu a angiogenezi. Zvýšené množství endometriálních NK buněk ale vede k těhotenským patogenezím, jako jsou např. missed abortion, v důsledku zvýšeného působení embryocytotoxických cytokinů redukujících např. angiogenezi, vaskulární růst trofoblastu [11, 12, 16]. Již dříve jsme sledovali a porovnávali krevní (průtokovou cytometrií ) a endometriální NK buňky CD56+ a CD16+ klidového sekrečního endometria (imunohistologicky) u pacientek s opakovanými doposud nevysvětlitelnými těhotenskými ztrátami. U opakovaně potrácejících žen jsme nenašli zvýšenou denzitu NK buněk v krvi na rozdíl od vysoké denzity těchto buněk v endometriu [15]. U žen se selháváním spontánní nebo asistované reprodukce sledujeme rutinně i podrobný screening antifosfolipidových protilátek, jejichž patologický titr se aktivně zapojuje do těhotenských nezdarů.

Ovulační cervikální sekret (OCM) je produkován sekrečními buňkami cervikálních žlázek a krypt v děložním hrdle, stává se hormonálně i imunologicky aktivním orgánem ženského reprodukčního traktu. OCM obsahuje hlen, rozpustné proteiny, vodu, ionty, jednoduché cukry, enzymy a imunoglobuliny. Jeho kvalita a kvantita závisí na hormonální souhře estrogenů a gestagenů. V období ovulace má charakteristické vlastnosti, které vedou k usnadnění průniku spermie skrz děložní hrdlo [13, 14]. Cervikální oblast chrání vnitřní genitální trakt před různými infekčními bakteriálními invazemi [6, 7, 10].

Výzkum jsme tentokrát nasměrovali na analýzu denzity NK buněk CD56+ a CD16+ v OCM u fertilních žen a u žen se sníženou plodností s pravidelným menstruačním cyklem a ovulací. Zaměřili jsme se na porovnání denzity NK buněk v OCM (nikdy nebyl tento problém předtím studován) a v endometriu. Po konzultaci s prof. Coulamovou [3, 4] jsme se zaměřili i na diagnostiku protilátek HHV-6 v sérech a v ovulačních sekretech.

SOUBOR PACIENTEK

V Poradně pro imunologii reprodukce v Genetice – Plzeň jsme vyšetřili soubor 72 náhodně vybraných pacientek ve věku od 20 do 39 let (průměr 32,3 roky), z nichž bylo 57 pacientek s doposud nevysvětlitelnými těhotenskými ztrátami (většinou missed abortion v 1. trimestru) a 15 zdravých fertilních žen tvořilo kontrolní skupinu. Všechny ženy měly pravidelné cykly s ovulací, partnery s normálním spermiogramem. Soubor žen předem podepsal informovaný souhlas k rozšířenému imunologickému vyšetření. V období odběru OCM měly všechny ženy fyziologický mikrobní poševní obraz (neprokázali jsme nákazu mykoplasmaty, chlamydiemi, trichomoniázami, vyloučili jsme mykotickou invazi, ale také přítomnost antispermiových protilátek v ovulačním sekretu). Vybrané ženy tedy neměly žádné klinické ani laboratorní symptomy vaginitidy.

V jejich anamnézách jsme se zaměřili i na délku hormonální antikoncepce před rozhodnutím otěhotnět, nikotinismus a stres. Vyšetřili jsme ostatní screeningové genetické a imunologické parametry.

METODIKA

Odběr OCM

Nezbytnou podmínkou pro odběr ovulačního sekretu je chráněný pohlavní styk (coitus condomatus) od ukončení poslední menstruace do vyšetření (omezit kontaminaci čípku a jeho kanálku děložního hrdla ejakulátem). Ektocervix lehce sterilně otřeme a z oblasti endocervixu opatrně aspirujeme OCM do sterilních kapilár a na sklíčka k analýzám.

Analýza antifosfolipidových protilátek

Krev jsme odebírali současně na analýzu screeningu IgG a IgM antifosfolipidových protilátek (protilátky proti fosfatidyl-serinu, fosfatidyl-inositolu, fosfatidyl-ethanolaminu, fosfatidil-glycerolu, kyselině fosfatidové, beta 2-glykoproteinu I, kardiolipinu, annexinu V), která byla provedena klasickou metodou ELISA.

Protilátky proti HHV-6

Použili jsme nepřímou imunofluorescenční metodu pro identifikaci IgM a IgG protilátek proti HHV-6 infekci v séru a v OCM (IF Viditest fy Vidia).

Spermaglutinační protilátky

Nepřímý MAR-test (indirect mixed anti-immunoglobulin reaction test) jsme užili k vyšetření ovulačního sekretu na přítomnost (nepřítomnost) spermaglutinačních protilátek.

Vyšetření NK CD56+ a CD16+ v endometriu [15] a v OCM

Endometrium infertilních pacientek jsme získali hysteroskopicky 22.–24. den cyklu. Z etických důvodů jsme endometrium nevyšetřovali v kontrolní skupině zdravých fertilních žen. OCM jsme odebírali všem ženám v období ovulace.

NK buňky jsme vyšetřovali v biologických materiálech pomocí značení anti CD56+ a anti CD16 (Human CD56, Anti Human CD16, DAKO, Leica Microsystems GmbH, UK) a odečítali pod mikroskopem (Olympus, zvětšení 10×20).

VÝSLEDKY

Tabulky 1 a 2 obsahují základní anamnestické i dosažené výsledky u obou skupin žen. Ovulační cervikální sekret u fertilních žen neobsahoval sledované NK buňky. Avšak vysokou denzitu NK CD56+ a CD16+ v OCM a současně i v endometriu jsme nalezli u dvou pacientek (3,5 %), které prodělaly 4–6 spontánních potratů (obr. 1–4). V endometriu pak celkově převažovala vysoká hustota NK CD 56+ u 23 pacientek (40 %), NK 16+ u 11 (19 %), společně pak NK 56+ a NK 16+ u osmi (14 %) z 57 náhodně vyšetřovaných pacientek.

**Obr. 1. Obrázek vyjadřuje denzitu NK buněk CD56+ v endometriu (negativní a pozitivní)**

**Obr. 2. Na obrázku jsou vyjádřeny denzity endometriálních NK buněk CD 16 negativní a pozitivních**

**Obr. 3. Cervikální ovulační sekret a denzita NK buněk CD 16+**

**Obr. 4. Hustota NK buněk CD 56+ v ovulačním cervikálním sekretu**

V žádném ovulačním vzorku nebyly přítomné spermaglutinační protilátky ani protilátky proti HHV-6.

Antifosfolipidový syndrom byl v tomto souboru prokázán u jedné pacientky, u jiné pak i diabetes mellitus I. Bylo zajímavé, že u těchto žen jsme neshledali žádnou zvýšenou denzitu NK buněk ani v OCM ani v endometriu (tab. 1 a 2).

Kontrolní skupina 15 zdravých fertilních žen se základní
anamnézou a výsledky NK buněk 56+ a 16+ v OCM — **Tab. 1. Kontrolní skupina 15 zdravých fertilních žen se základní anamnézou a výsledky NK buněk 56+ a 16+ v OCM**

Celkem 57 pacientek s opakovanými spontánními potraty,
jejich základní anamnestické údaje a výsledky vyšetření včetně NK
CD56+ a CD 16+ v OCM a v sekrečním endometrium — **Tab. 2. Celkem 57 pacientek s opakovanými spontánními potraty, jejich základní anamnestické údaje a výsledky vyšetření včetně NK CD56+ a CD 16+ v OCM a v sekrečním endometrium**

DISKUSE

V současné době se některá zahraniční i česká centra [2, 5] soustřeďují na výzkum děložního mikrobiomu. Lymfocyty v endometriu, především NK buňky, jsou plastické a mohou svými působky paralyzovat patologické mikroorganismy, což je žádoucí, a tím zlepšovat výsledky implantace a později i placentace. Fyziologická gravidita u zdravé ženy je exponovaná celou řadou auto- a aloimunních antigenů, které ovlivňují celý proces tolerance matka – plod. Mnoho prací se zabývá i imunologickými mechanismy těhotenských ztrát [např. 8, 9, 11, 12]. Také naše centrum zabývající se reprodukční imunologií již od roku 1985 hledá nové diagnostické a léčebné možnosti především u těch pacientek, které mají doposud určenou diagnózu – nevysvětlitelná snížená plodnost především v podobě opakovaných spontánních potratů nebo opakovaných missed abortions. Pacientky uvedené v tomto sdělení do této skupiny patří, neboť jsme vyloučili ostatní příčiny infertility.

Již dříve [15] jsme sledovali NK buňky CD56+ a CD16+ v endometriu. V tomto sdělení jsme se soustředili i na ovulační cervikální sekret a porovnávali hustotu NK CD56+ a CD 16+ s nálezy v sekreční sliznici děložní. Předpokládali jsme nález vyššího počtu pacientek s vyšší denzitou těchto buněk i v OCM. Přítomnost NK buněk v obou biologických materiálech byla zachycena jen u dvou pacientek. Položili jsme si otázku, zda tyto lymfycyty obsažené v OCM pocházejí z endometria, nebo z imunologicky aktivního děložního hrdla. Diskuse proběhla v reakci na přednášku korespondujícího autora ve Varně 2018, kdy prof. Coulamová navrhla podívat se ještě na protilátky proti HHV-6 a hledat tak souvislost mezi virovou nákazou a buněčnou odezvou. Učinili jsme tak v séru a OCM, ale prokázali jsme jen u některých žen sérové anamnestické titry. Coulam et al. [3] ale upozorňuje na prevalenci HHV-6 v endometriu u žen s opakovaným implantačním selháváním.

V této práci jsme se zaměřili na identifikaci a denzitu uterinních NK buněk a NK buněk v OCM. Víme, že obecně NK buňky s různými svými znaky mají jiné vlastnosti na periferii, jiné v oblasti stále se trasformujícího fyziologického nebo těhotensky změněného endometria. V každém případě NK buňky produkují celou řadu cytokinů nezbytných pro různé imunologické reakce fyziologické nebo přispívají k prohloubení patologického stavu např. implantačního selhávání. Zdá se, že z hlediska reprodukční imunologie jsou nejvýznamnější právě NK buňky CD56+ a CD16+ [15].

I když opakovaná potrácivost může mít celou řadu příčin a my je postupným prekoncepčním (u některých i postkoncepčním vyšetřováním) pacientek vylučujeme a vyloučíme, včetně lokální infekce, přesto z našich dílčích výsledků vyplývá, že vysoká denzita NK buněk na endometriu může vést k nerovnováze lokální, endometriální buněčné imunity směřující k poruše imunologické tolerance, ke zvýšené fagocytární aktivitě, k nepoměru Th1/Th17, ke zvyšování embryocytotoxických cytokinů, především TNF-α a INF-γ a úplně v konečné podobě k těhotenské ztrátě [11].

Sledování NK buněk v OCM je zcela nové, žádná literatura tento nález doposud nepopsala. Prokázali jsme NK buňky jen u dvou pacientek. Je to náhoda, nebo závažný, z hlediska dalšího výzkumu zajímavý nález? Pokusili jsme se objasnit přítomnost těchto buněk v nezvyklé lokalitě ženského reprodukčního traktu i tím, že jsme vyloučili mikrobiální infekci v této oblasti. Jsou NK buňky v oblasti cervixu fixované, nebo migrují z oblasti endometria? Jakou úlohu mají i k opakované selhávající graviditě?

Průkaz těchto buněk v OCM napovídá, že děložní hrdlo patří mezi imunologicky aktivní orgány [13, 14] a že otevírá další možnost výzkumu i v oblasti reprodukční imunologie – buněčné imunity.

ZÁVĚR

Nález NK CD56+ a CD16+ v ovulačním cervikálním sekretu u pacientek s opakovanými potraty je zřejmě velmi vzácný. U opakovaně potrácejících žen převažuje ale vysoká denzita NK buněk v sekrečním endometriu.

Prof. MUDr. Zdenka Ulčová-Gallová, DrSc.

Poradna pro reprodukční imunologii

Genetika-Plzeň

Gynekologicko-porodnická klinika LF UK

Parková 1254/11a

326 00 Plzeň – Černice

ulcova-gallova@email.cz

Zdroje

1. Bulmer, JN., Morrison, L., Longfellow, M., et al. Granulated lymphocytes in human endometrium: histochemical and imunohistochemical studies. Hum Reprod, 1991, 6, p. 791–798.

2. Crha, I., Ventruba, P., Žáková, J., et al. Děložní mikrobiom jako faktor receptivity endometria. Čes Gynek, 2019, 84(1), s. 49–54.

3. Coulam, CB., Bilal, M., Salazar Garcia, MD., et al. Prevalence of HHV-6 in endometrium from women with recurrent implantation failure. Am J Reprod Immunol, 2018, 80(1):e12862. doi: 10.1111/aji.12862. Epub 2018 Apr 17.

4. Coulam, C. Recurrent Implantation Failure. 15th International Symposium for Immunology of Reproduction, Varna, Bulgaria, 2018, June 15–17, abstr.p. 17.

5. Dvořan, M., Vodička, J., Dostál, J., et al. Implantace a diagnostika receptivity endometria. Čes Gynek, 2018, 83(4), s. 291–299.

6. Eggert-Kruse, W., Botz, I., Pohl, S., et al. Antimicrobial activity of human cervical mucus. Hum Reprod, 2000, 15, p. 778–784.

7. Hansen, LK., Becher, N., Glavind, J., et al. The cervical mucus plug inhibits, but does not block, the passage of ascending bacteria from vagina during pregnancy. Acta Obstet Gynecol Scand, 2014, 93, p. 102–108.

8. Kuon, RJ., Vomstein, K., Weber, M., et al. The „killer cell story“ in recurrent miscarriage: Association between activated peripheral lymphocytes and uterine natural killer cells. J Reprod Immunol, 2017, 119, p. 9–14.

9. Kwak-Kim, J., Bao, S., Lee, SK., et al. Immunological modes of pregnancy loss: inflammation, immune effectors, and stress. Am J Reprod Immunol, 2014, 72, p. 129–140.

10. Mirmonsef, P., Gilbert, D., Zariffard, MR., et al. Effect of commensal bacteria on innate immune responses in the female genital tract. Am J Reprod Immunol, 2011, 65, p. 190–195.

11. Seshadri, S., Sunkara, SK. Natural killer cells in female infertility and recurrent miscarriage: a systematic review and metaanalysis. Hum Reprod Update, 2014, 20, p. 429–438.

12. Tang, AW., Alfirevic, Z., Quenby, S. Natural killer cells and pregnancy outcomes in women with recurrent miscarriages and infertility: a systemic review. Hum Reprod, 2011, 26, p. 1971–1980.

13. Ulcova-Gallova, Z. Immunological and physicochemical properties of cervical ovulatory mucus. J Reprod Immunol, 2010, 86(2), p. 115–121.

14. Ulcova-Gallova, Z. Ten-years experience with antispermatozoal activity in ovulatory cervical mucus and local hydrocortisone treatment. Am J Reprod Immunol, 1997, 38(3), p. 231–234.

15. Ulcova-Gallova, Z., Pesek, M., Mukensnabl, P., et al. [Screening of endometrial NK cells in selected infertile patients. First part - Methods and current results.] Ces Gynek, 2017, 82(5), p. 366 –371.

16. Vassiliadou, N., Searle, RF., Bulmer, JN. Elevated expression of activation molecules by decidual lymphocytes in women suffering spontaneous early pregnancy loss. Hum Reprod, 1999, 14(5), p. 1194–2000.