Azathioprin v terapii idiopatických střevních zánětů u dětí – díl II: farmakodynamika, farmakokinetika a možnosti klinického využití stanovení metabolitů thiopurinů

Súhrn

Východiska: V pediatrii jsou k udržení remise idiopatických střevních zánětů nejčastěji užívána léčiva ze skupiny thiopurinů (především azathioprin a jeho metabolit merkaptopurin). Azathioprin je po absorpci z GIT přeměněn na 6-merkaptopurin. Na jeho dalším metabolizmu se podílí několik enzymů, pomocí nichž vznikají neaktivní metylované metabolity (6-metylmerkaptopurin) a kyselina thiomočová (KTM) a aktivní 6-thioguaninnukleotid, který je zodpovědný za terapeutický efekt. Koncentrace thiopurinových metabolitů v erytrocytech je možné laboratorně stanovit. Cíl: Zmapovat výhody a možnosti přímého stanovení thiopurinových metabolitů u pacientů s idiopatickými střevními záněty. Závěr: Přímé stanovení aktivních i neaktivních metabolitů zhodnotí bio­logickou dostupnost léku, může pomoci v odhalení důvodu ně­kte­rých nežádoucích účinků terapie a navíc odhalí non-adherentní pacienty.

Klíčová slova:

pediatrie – ulcerózní kolitida – Crohnova choroba – merkaptopurin – thiopuriny

Úvod

Thiopuriny mají své stálé místo v terapii idiopatických střevních zánětů (IBD), a to ve fázi udržení remise Crohnovy choroby (CD) i ulcerózní kolitidy (UC) u dospělých i dětských pacientů (blíže viz část I).

Farmakokinetika a farmakodynamika

Azathioprin (AZA) je proléčivo, z nějž je po absorpci z gastrointestinálního traktu (GIT) neenzymatickou reakcí s glutationem či jiným peptidem nebo proteinem obsahujícím sulfhydrylovou skupinu glutationu nebo cysteinu odštěpeno imidazolové jádro (přesněji nitrometylimidazol) za vzniku 6-merkaptopurinu (6-MP) [1]. Takto je rychle přeměněno na 6-MP přibližně 88 % perorálně podaného AZA [2,3].

Dále je 6-MP relativně rychle metabolizován třemi různými cestami – za vzniku kyseliny thiomočové (KTM), 6-metylmerkaptopurinu (6-mMP) a 6-thioguaninové nukleotidy (6-TGN) (obr. 1). Thiopurinmetyltransferáza (TMPT) snižuje bio­logickou dostupnost 6-TGN ve prospěch tvorby metylovaných produktů [3–9].

Xantinoxidáza (XO) je kromě jater přítomna i ve střevní mukóze, a podílí se tak na katabolizmu 6-MP v případě, že je užívána přímo jeho perorální forma (a 6-MP nevzniká až po vstřebání z GIT přeměnou AZA) [2]. Pro dosažení dostatečných plazmatických koncentrací 6-MP je důležité, aby byl AZA podáván perorálně ve formě standardních tablet. Bylo zjištěno, že systémová bio­logická dostupnost 6-MP je výrazně nižší, pokud je AZA podáván rektálně či v kapslích s pozdním (kolickým) uvolňováním. Zda se jedná o zvýšenou absorpci léčiva v horních partiích GIT či zvýšený katabolizmus kolickou sliznicí není známo [1,10,11]. Biologická dostupnost AZA po jeho perorálním podání se pohybuje mezi 27 a 83 %, zatímco u perorálního 6-MP je bio­logická dostupnost nižší – pouze 5 až 37 % [5,12]. V několika studiích u dospělých pacientů s těžkým průběhem CD i UC bylo zkoušeno podání nasycovací dávky léčiva formou intravenózní infuze. Tento postup měl za cíl zkrácení doby nástupu účinku léčiva a dosažení stabilních koncentrací thiopurinových metabolitů, předpokládaná hypotéza však nebyla potvrzena [13–15].

Mechanizmus účinku

Mechanizmus účinku thiopurinů není dosud plně objasněn, thiopuriny pravděpodobně ovlivňují několik metabolických cest způsobujících imunosupresivní a cytotoxický efekt těchto léčiv. Původně byla za hlavní mechanizmus účinku považována inhibice proliferace lymfocytů způsobená inkorporací 6-TGN do jejich nukleových kyselin vedoucí k destrukci vlákna DNA při replikaci a poruše proteosyntézy [12,16,17]. V roce 2003 byla publikována práce poukazující na možný efekt terapie spočívající v aktivaci (resp. supresi suprese) mitochondriální cesty apoptózy stimulovaných CD4+ T-lymfocytů zapříčiněné vazbou 6-TGTP na guanintrifosfatázu Rac1 namísto 6-guanintrifosfátu (6-GTP) [3,18]. Dle práce pub­likované v posledních letech thiopurinová léčba navíc zvyšuje oxidativní stres a způsobuje mitochondriální dysfunkci v T-lymfocytech cestou dysregulace aktivity antioxidačních činidel [19].

Role metylovaných metabolitů, přesněji 6-mMP ve formě nukleotidů, v cytotoxicitě thiopurinů není plně objasněna, dle publikace z roku 2001 se však zdá, že i ony mají na účinku thiopurinových léčiv svůj podíl – pravděpodobně v podobě inhibice syntézy purinových bází de novo [9]. Protože však zatím chybí dostatečné důkazy o jejich roli in vivo, jsou považovány spíše za odpadní produkty syntézy 6-TGN [2].

TPMT

Aktivita TPMT, která je zodpovědná za metylaci merkaptopurinových metabolitů, je zčásti dána geneticky a zčásti funkci tohoto enzymu ovlivňují i faktory prostředí – především lékové interakce. Genetická predispozice je v tomto případě děděna autozomálně dominantně, kdy 90 % jedinců nese dvě dominantní alely vedoucí k normální (nepřesněji vysoké) aktivitě TPMT, přibližně 10 % tvoří skupina heterozygotů s intermediální aktivitou enzymu a pouze 0,3 % (1 ze 300) osob jsou recesivní homozygoti s nízkou až nedetekovatelnou aktivitou TPMT [20,21]. Aktivitu TPMT lze stanovit i přímo pomocí bio­chemických laboratorních metod (stanovení fenotypu) – popsáno bylo využití vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC), případně tandemové hmotnostní spektrometrie [22].

Již v roce 1997 byl navržen způsob vyšetření genetické predispozice (stanovení genotypu) včetně publikace tří nejčastějších mutovaných alel: TPMT*3A, TPMT*2 a TPMT*3C [23]. Od té doby však bylo popsáno více než 20 různých alel [21,24]. TPMT*1 a TPMT*1S jsou značeny divoké (wild-type) alely. TPMT*3A je nejčastější mutací u kavkazské populace a jihozápadních Asiatů, oproti tomu mezi Afričany, Afroameričany a obyvateli jihovýchodní Asie se z mutovaných alel nejčastěji vyskytuje TPMT*3C [23–26]. Výsledky fenotypového stanovení aktivity TPMT pomocí bio­chemických metod jsou na rozdíl od genetického vyšetření ovlivněny transfundovanými erytrocyty, pokud byla erymasa podána pacientovi méně než 3 měsíce před vyšetřením [23,27]. Genetickým vyšetřením jsou v ČR běžně stanovovány alely TPMT*2 (c.238 G>C), TPMT*3B (c.460 G>A), TPMT*3C (c.719 A>G) a kombinace předchozích – označována jako alela TPMT*3A (c.460G>A a c.719A>G), vzácnější alely pak mohou detekci uniknout.

Kromě genetických faktorů ovlivňují výslednou aktivitu TPMT i vlivy další. Bylo popsáno, že již samotné pravidelné podávání 6-MP nebo AZA vede ke zvýšení aktivity enzymu, která po přerušení léčby opět klesá [28]. Další studie však tento způsob ovlivnění TPMT vyvrací, a naopak popisuje sníženou expresi genu pro TPMT po podání thiopurinů, přestože aktivita TPMT zůstala nezměněna [6]. U mužů byla zaznamenána vyšší aktivita TPMT než u žen, u kuřáků vyšší než u nekuřáků [21,29]. Podobně též u dětí mladších 6 let věku byla popsána vyšší aktivita TPMT ve srovnání se staršími pacienty [30–32].

Mezi léky ovlivňující aktivitu TPMT patří v první řadě 5-aminosalicylová kyselina (5-ASA) a její deriváty ze skupiny aminosalicylátů (olsalazin, balsalazid apod.), často podávané především u pacientů s UC. Nekompetitivní inhibice TPMT aminosalicyláty byla popsána in vitro [33–35]. In vivo byl popsán případ thiopuriny indukované myelosuprese u pacientky s normálním TPMT genotypem léčené kombinací 6-MP a olsalazin, následně byla laboratorně prokázána nižší aktivita enzymu TPMT [35]. Ovlivnění metabolizmu thiopurinů aminosalicyláty podporuje i studie, v níž byl pozorován pokles průměrné koncentrace 6-TGN (aktivního produktu TPMT) po přerušení konkomitantní terapie 5-ASA, aktivita TPMT těchto pacientů však zůstala nezměněna, a mechanizmus této interakce tak zůstává nejasný [36]. Furosemid pravděpodobně interaguje s metabolizmem thiopurinů inhibicí TPMT, ale klinický význam této interakce není zatím objasněn [37,38].

Ze skupiny dominantních homozygotů nesoucích dvě divoké (nemutované) alely kódující TPMT lze vyčlenit pacienty s velmi vysokou (tedy vyšší než normální) aktivitou TPMT, u nichž léčba thiopuriny nedosahuje dostatečného efektu [21,39,40]. Tito pacienti (ve své podstatě hypermetylátoři, tzv. shunters) produkují více 6-mMP na úkor 6-TGN [41]. Zřejmě i v těchto případech hraje určitou roli genetická predispozice [42]. Na druhou stranu se však zdá, že až u 10 % pacientů s 6-mMP preferujícím metabolizmem vzniká tento jev pozdně a je odhalen i měsíce až roky od zahájení thiopurinové terapie [43].

Další enzymy podílející se na metabolizmu thiopurinů

Oxidací XO je 6-MP z části přeměněn na KTM, která je vylučována močí jako odpadní metabolit [4,5,9]. V případě konkomitantního podávání inhibitorů XO (alopurinol) je nutno redukovat dávku AZA. Zdá se však, že alopurinol není pouze inhibitorem XO, ale ovlivňuje i aktivitu TPMT [44]. Byla vyslovena hypotéza, že se tak děje kompetitivní inhibicí TPMT alopurinolovým metabolitem oxypurinolribosidmonofosfátem, což je analog 6-TIMP – substrátu TPMT [45]. U pacientů léčených kombinací obou léčiv stoupá tvorba thioxantinu, dalšího z možných inhibitorů TPMT [46].

V normální zdravé thiopuriny neléčené buňce vzniká přeměnou katalyzovanou HGPRT z hypoxantinu a guaninu inosinmonofosfát a guanosinmonofosfát. Při úplném deficitu tohoto enzymu byl u lidí popsán syndrom Lesh-Nyhan, při neúplném deficitu pak syndrom Kelley-Seemiller. 6-MP je v thiopurinovém metabolizmu přeměněn za pomoci HGPRT na 6-TIPM, z nějž postupně vzniká konečný produkt přeměny 6-TGN. Pokud je funkce tohoto enzymu zvýšená, lze předpokládat zvýšenou tvorbu 6-TGN, na což bylo poukázáno v asijské studii z roku 2012, která popsala pozitivní korelaci mezi aktivitou HGPRT a koncentrací 6-TGN v erytrocytech pacientů s IBD léčených thiopuriny [24].

Dalším enzymem ovlivňujícím metabolizmus thiopurinů je inosintrifosfát pyrofosfohydroláza nebo též inosintrifosfatáza (ITPáza). V purinovém metabolizmu neovlivněném terapií thiopuriny vzniká fosforylací inosinmonofosfátu (IMP) inosintrifosfát (ITP). ITPáza je poté zodpovědná za odštěpení pyrofosfátu z ITP za opětovného vzniku IMP. V dalším metabolizmu z IMP vznikají adeninové a guaninové nukleotidy. Snížená funkce ITPázy vede k akumulaci ITP, která se u osob neléčených thiopuriny jeví jako klinicky bezvýznamná. V průběhu metabolizmu AZA/6-MP vzniká jako dílčí produkt 6-TIMP, jehož fosforylací vzniká 6-thioinosintrifosfát (6-TITP), který je též substrátem ITPázy. V případě, že je tento enzym deficientní, dochází k akumulaci 6-TITP. V genu IPTA je známo několik polymorfizmů, které jsou zodpovědné za sníženou funkci ITPázy [22,47,48]. Klinický dopad poruch funkce ITPázy však není prozatím plně objasněn [49].

Metabolity AZA

Pomocí HPLC lze stanovit koncentraci metabolitů AZA v erytrocytech pacienta, přesněji 6-MP, 6-mMP, KTM, 6-TGN a thioxantinu [8,50]. Tyto metabolity pak mohou vypovědět více o individuálním metabolizmu AZA u konkrétního pacienta – zajímají nás především koncentrace 6-TGN a 6-mMP, jejichž vztah není lineární a vysoké koncentrace jednoho metabolitu neznačí vždy vysoké nebo nízké koncentrace druhého [5,8]. Přestože je možné stanovit koncentrace těchto metabolitů i v plazmě, stanovení jejich intracelulárních koncentrací v erytrocytech je vzhledem k farmakokinetice i mechanizmu účinku považováno za více vypovídající [8]. Stanovení thiopurinových metabolitů je možné též v periferních lymfocytech, využitelnost v klinické praxi ale není zatím objasněna [51].

Byla popsána asociace mezi klinickou odpovědí na terapii AZA a koncentrací 6-TGN v erytrocytech – tedy těch metabolitů, které jsou považovány za hlavní efektory terapie [5,27,41]. Ve studii z roku 2001 bylo vypozorováno, že pouze 5 z 37 pacientů s CD neodpovídajících na terapii (hodnoceno klinicky – skóre aktivity onemocnění, možnost vysazení kortikosteroidní léčby) mělo hladiny 6-TGN > 250 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů a pouze 1 z 11 pacientů s koncentracemi 6-TGN > 250 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů neodpověděl na terapii [52]. S podobnými závěry byla publikována i metaanalýza z roku 2006 – pokud byly detekovány koncentrace metabolitů > 230–260 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů, byla větší pravděpodobnost, že je pacient v klinické remisi onemocnění (62 %), zatímco pod touto hranicí je více pravděpodobné, že v remisi choroby není [53]. Pozdější metaanalýza v roce 2014 potvrdila asociaci mezi koncentracemi 6-TGN a větší pravděpodobností klinické remise onemocnění [54]. Vyšší koncentrace 6-TGN u pacientů v klinické remisi onemocnění oproti pacientům s aktivním onemocněním byly pozorovány i u dětí, popsaný rozdíl byl větší u pacientů s CD než s UC [55,56]. V případě IBD je za „terapeutickou“ považována koncentrace 6-TGN v rozmezí přibližně 230–450 pmol/8 × 10⁸ erytrocytů. Při vyšších hodnotách výrazně stoupá riziko leukopenie [27,57,58].

U vyšších hodnot koncentrací druhého metabolitu, který stojí v popředí našeho zájmu, tedy 6-mMP, byla popsána korelace s hepatotoxicitou. Dle publikovaných dat stoupá riziko alterace transamináz při koncentracích 6-mMP > 5 700 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů. Asociace tohoto metabolitu s terapeutickým účinkem nebyla pozorována [59].

Dosažení stabilních hladin thiopurinových metabolitů v erytrocytech trvá cca 55 dní (střední doba od podání první dávky do doby dosažení stabilních koncentrací) [7]. Efekt terapie nelze tedy hodnotit po jednorázovém nebo krátkodobém podání léčiva, ale pro dosažení dostatečného účinku terapie je nutné AZA nebo 6-MP pravidelně užívat po dobu alespoň 8–14 týdnů [27].

Vztah mezi již stabilními koncentracemi 6-TGN nebo 6-mMP a dávkami AZA vztaženými na kilogram tělesné hmotnosti není průkazný. Byla popsána pouze slabá nelineární korelace mezi koncentracemi těchto metabolitů a dávkou [59]. Jiné studie asociaci neprokázaly vůbec. Koncentrace metabolitů, jichž pacient dosáhne, jsou pravděpodobně ovlivněny mnoha jinými faktory – jedním z nich je i aktivita TPMT (viz výše). Dalším možným faktorem je obezita, která pravděpodobně negativně ovlivňuje výsledné koncentrace 6-TGN (a také poměr 6-TGN a 6-mMP) [29].

Pomocí detekce koncentrací obou popsaných metabolitů lze odlišit příčiny případné neefektivity terapie – poddávkování, non-compliance a rezistenci k léčbě (tab. 1) [2,27,41]. Někteří pacienti však zůstávají refrakterní k terapii i přes vysoké koncentrace 6-TGN (> 230 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů, někdy dokonce i vyšší než potenciálně toxických 450 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů) a důvod neefektivity terapie v tomto případě není způsoben nízkou dávkou léku či preferenčním metabolizmem ve směru 6-mMP, ale spíše nedostatečnou odpověděí pacienta na zvolenou léčbu [2,60].

Možnosti využití stanovení thiopurinových metabolitů v optimalizaci terapie IBD

Nebyl prokázán lepší efekt terapie, pokud byla striktně řízena dle koncentrací thiopurinových metabolitů, oproti standardnímu dávkování dle hmotnosti pacienta za předpokladu znalosti aktivity TPMT (fenotypu a/nebo genotypu) [61,62]. I přesto však může být znalost erytrocytárních koncentrací 6-TGN a 6-mMP v optimalizaci léčby nápomocná – především v případech, kdy pacient dostatečně nereaguje na standardní dávky AZA/6-MP nebo při podezření na non-adherenci. Z hlediska účinnosti terapie (zejména při monoterapii thiopuriny) lze považovat za optimální koncentrace 6-TGN > 230 pmol/8 × 10⁸ erytrocytů.

U pacientů, u nichž jsou zaznamenány zvýšené hodnoty transamináz na terapii thiopuriny, je vhodné vyšetřit koncentrace jejich metabolitů v erytrocytech [58]. Pokud je zjištěna velmi vysoká aktivita TPMT (hypermetylátoři, „shunters“), vysoké koncentrace 6-mMP a nízké aktivního 6-TGN (metabolizmus ve prospěch tvorby 6-mMP), můžeme zlepšit poměr těchto dvou metabolitů přidáním alopurinolu do kombinace. V takovém případě je nutné dávku AZA redukovat na 25–33 % doporučených dávek. Alopurinol podáváme u dítěte v dávce 50–75 mg/den. U dospělého je většinou podáváno jednotných 100 mg/den (při podávání pouze 50 mg/den byla zjištěna nižší stabilita hladin 6-TGN). Následně je nutná kontrola koncentrací thiopurinových metabolitů, event. úprava dávky thiopurinového léčiva. Cílem této intervence je udržet koncentrace 6-TGN v terapeutickém rozmezí (tj. 230–450 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů) a dosáhnout poklesu 6-mMP doprovázeného normalizací transamináz [2,27,44,58, 63–66]. Studie z roku 2012 odhalila, že rozdělení dávky léčiva do dvou denních dávek vede u pacientů s velmi vysokými koncentracemi 6-mMP k jejich poklesu (doprovázeném ústupem nežádoucích účinků), zatímco koncentrace 6-TGN zůstává téměř beze změny. Skupina, která tento jev popsala, vidí jako řešení „hypermetylace“ podávání AZA/6-MP ve dvou denních dávkách s následovnou kontrolou koncentrací thiopurinových metabolitů [67].

V případě kombinované léčby AZA a infliximabu (IFX) lze dle dostupných publikací považovat za dostatečný cut-off koncentrace 6-TGN 125 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů, což je méně než v případě monoterapie [68]. V roce 2015 byla v průřezové studii popsána asociace 6-TGN > 125 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů (zvolený cut-off) s vyššími hladinami IFX. Zároveň pak u pacientů s hladinami 6-TGN < 125 pmol/8 x 10⁸ erytrocytů byla pozorována signifikantně větší náchylnost k tvorbě protilátek proti IFX (antiIFX) [69]. Recentní česká studie však toto pozorování u dětí nepotvrdila. Zdá se však, že i v případě pediatrických pacientů lze považovat za dostatečné dávky AZA v případě kombinované terapie nižší než při AZA monoterapii [70].

Závěr

V terapii IBD má AZA/6-MP své místo nejen u dětí již desítky let. Přestože nebyla prokázána větší účinnost léčby řízené koncentracemi metabolitů thiopurinů v erytrocytech, může jejich stanovení k optimalizaci terapie přispívat – např. při podezření na non-adherenci k terapii nebo v identifikaci hypermetylátorů. Klinická zkušenost tak stojí v řízení terapie stále na prvním místě, a to nejen proto, že rutinní monitorace thiopurinových metabolitů není v České republice běžně dostupná.

ORCID autorů

K. Pospíšilová ORCID 0000-0002-6850-5588,

J. Bronský ORCID 0000-0002-2641-7280.

Doručeno/Submitted: 2. 8. 2021

Přijato/Accepted: 14. 11. 2021

MUDr. Kristýna Pospíšilová

Oddělení dětské gastroenterologie

Pediatrická klinika

2. LF UK v Praze a FN v Motole

V Úvalu 84/1

150 06 Praha 5

potuznikovakris@gmail.com