Role mikroRNA v patogenezi spinální muskulární atrofie

Súhrn

Spinální muskulární atrofie (SMA) je autozomálně recesivní neurodegenerativní onemocnění, jehož podkladem je selektivní apoptóza motoneuronů předních rohu míšních. Podstatou onemocnění je mutace v genu SMN1 (survival motor neuron 1) kódujícím SMN protein, který chrání motoneurony předních rohů míšních před apoptózou. Přežití motoneuronů je mimo jiné závislé také na motoneuron specifických mikroRNA (miRNA), které regulují jejich normální vývoj, diferenciaci, růst axonů, tvorbu synapsí a regulují jejích apoptózu. Hlavním úkolem miRNA je regulace post-transkripční genové exprese. Selektivní vulnerabilita motoneuronů předních rohů míšních u SMA je způsobená alterací exprese motoneuron specifických miRNA. Detekce těchto motoneuron specifických miRNA v mozkomíšním moku a/nebo krevní plazmě by mohla vést k objevení bio­markerů k časné dia­gnostice SMA, predikci závažnosti a rychlosti progrese onemocnění a monitoraci efektu léčby.

Klíčová slova:

mikroRNA – spinální muskulární atrofie – biomarkery

Spinální muskulární atrofie (SMA) je autozomálně recesivní progredující neurodegenerativní onemocnění, jehož podkladem je degenerace motoneuronů předních rohů míšních, případně motorických bulbárních jader. Klinicky se projevuje progresivní zejména proximální svalovou slabostí, areflexií, hypotonií a mohou se vyskytovat fascikulace jazyka [1].

Etiopatogeneticky se jedná o heterogenní skupinu onemocnění, až 95 % však tvoří proximální forma na podkladě mutace v genu kódujícím protein SMN (survival motor neuron), který se nachází na 5. chromozomu. Mutace v tomto genu – jedná se o deleci exonu 7 nebo 7 a 8 – vede k nedostatku proteinu SMN, který chrání motoneurony předních rohů míšních před apoptózou. Na 5. chromozomu se také nachází kopie genu SMN1, nazvaná SMN2. Gen SMN2 se liší pouze jednou bází, která ovlivňuje sestřih mRNA, a proto není schopen produkce plně funkčního proteinu SMN. Počet kopií genu SMN2 v genomu pacienta určuje závažnost klinické symptomatologie a dobu manifestace onemocnění. Nejzávažnější – časná forma SMA (SMA typu I) je asociovaná se 2 kopiemi genu SMN2, méně závažné formy (SMA typu II–IV) jsou spojeny s pozdějším nástupem příznaků a vícečetnými kopiemi genu SMN2 [2]. Definice bio­markerů k predikci progrese onemocnění se tak stává zcela zásadní.

Role proteinu SMN v patogenezi SMA a jeho funkce jsou nadále předmětem studií. Tento protein je exprimován v cytoplazmě i v jádru a mechanizmem, který dosud nebyl objasněn, vede k selektivní vulnerabilitě motoneuronů. SMN hraje také důležitou roli v regulaci funkcí axonů. Ztráta proteinu SMN proto vede k signifikantnímu defektu motoneuronů, ale také k narušení prodlužování axonů [3].

Mechanizmus, jakým dochází k selektivní vulnerabilitě motoneuronů, se vysvětluje mimo jiné změnou exprese tzv. motoneuron asociovaných mikroRNA (miRNA). Protein SMN se zapojuje do procesu bio­geneze miRNA, čímž může být vysvětleno současné postižení více kaskád při ztrátě SMN (jedna miRNA totiž reguluje desítky až stovky cílových genů, resp. jejich transkriptů, někdy se proto mluví o síti genů regulovaných jednou miRNA) [3–5].

SMN má rozhodující roli ve zpracování RNA, a to tím, že přímo váže proteiny důležité pro správnou tvorbu a funkci miRNA. V případě míšních motoneuronů je miRNA zásadní pro vývoj, diferenciaci, růst axonů, cytoskeletální struktury, tvorbu synapsí a celkovou aktivitu. miRNA je klíčovým elementem správné funkce a přežití motoneuronů. Dysregulace zpracování RNA a exprese miRNA proto může představovat mechanizmus podílející se na vzniku onemocnění motoneuronu. Objevuje se stále více důkazů, že určité specifické miRNA vedou k selektivní vulnerabilitě motoneuronů u SMA. Jejich přehled uvádí tab. 1 [3].

Společně se ztrátou SMN1 je v souvislosti s SMA tedy pozorována i dysregulace motoneuron asociovaných mikroRNA (motomiRNA) [6]. SMN1 hraje esenciální roli především v procesování mRNA, kdy se účastí sestřihu, kde je jednou ze stěžejních komponent SMN komplexu. V SMN komplexu se nachází řada dalších proteinů, jako jsou Gemin 3–7. Právě zde je možné spojení s bio­genezí miRNA, jelikož proteiny Gemin-3 a Gemin-4 asociují s mikroRNA a tvoří ribonukleoproteiny vázající miRNA (miRNP), tyto miRNP dále asociují s AGO2 a tvoří základ miRISC komplexu, hlavního efektoru celé miRNA mašinérie. Deficience SMN1 tak může přispívat k narušení miRNA bio­geneze několika způsoby, kdy prvním z nich může být narušení sestřihu esenciálních proteinů, nezbytných pro maturaci miRNA. Dále poškození funkce SMN komplexu může také pozměnit expresi proteinů Gemin-3 a Gemin-4, esenciálních pro tvorbu miRNP, což má také za následek nesprávnou maturaci řady mikroRNA. Možné je také přímé zapojení SMN1 do regulace tvorby ribonukleoproteinů vázajících mikroRNA [7–9].

Dysregulace miRNA se jeví jako zásadní krok v patogenezi SMA, jelikož tyto molekuly jsou stěžejními regulátory řady procesů. Zásadní roli hrají mimo jiné v přežívání post-mitotických spinálních motoneuronů [10]. Obecně se jedná o krátké nekódující RNA (sncRNA) o délce 22–25 nukleotidů. V rámci genomu jsou kódovány individuálně, případně jako klastry, které jsou překládány jako polycistronické transkripty [11]. Samotná transkripce je katalyzována RNA polymerázou II. Takto vzniklé primární transkripty (pri-miRNA) jsou obvykle delší než jedna kilobáze a jsou opatřeny 5‘ 7mG čepičkou a polyA koncem [12–13]. Dalšího zpracování se účastní endonukleáza Drosha a dsRNA vázající protein DGCR8, dochází ke štěpení pri-miRNA za vzniku vlásenkových struktur o délce přibližně 65 nukleotidů, známých jako pre-miRNA. Právě v kmeni těchto vlásenek se nachází budoucí sekvence samotné miRNA [12–13]. Pre-miRNA jsou následně transportovány do cytoplazmy pomocí Exportinu 5 [14], kde jsou štěpeny endonukleázou III Dicer, tímto způsobem jsou z vlásenek generovány krátké miRNA duplexy [15]. Následuje samotné nakládání těchto duplexů na AGO proteiny za vzniku RNA-indukovaného umlčovacího komplexu (RISC). V rámci tohoto komplexu dochází k odseparování řetězců v rámci duplexu, vedoucí řetězec zůstává obvykle navázán na RISC, zatímco pas­sanger řetězec je rozštěpen [16]. Kromě této kanonické dráhy miRNA bio­geneze ještě existuje i řada nekanonických způsobů jejich vzniku, nicméně takové miRNA tvoří asi jen 1% celkové miRNA populace [6].

Jak již bylo naznačeno, hlavním úkolem miRNA je regulace genové exprese. Toho je dosaženo skrze navádění komplexu RISC na sekvence komplementární ke specifické miRNA. Tyto sekvence se nachází na 3‘ nepřekládaných oblastech daných mRNA a největší nároky na komplementárnost jsou kladeny na tzv. seed sekvenci, nacházející se mezi 2.–8. nukleotidem na 5‘ konci miRNA. V případě komplementarity dochází k zastavení translace cílové mRNA a posléze také k rekrutaci komplexu, který je zodpovědný za odstranění 5‘ čepičky a následnou degradaci mRNA. Tímto je navozena posttranskripční kontrola genové exprese [6].

Jak již samotný mechanizmus napovídá, miRNA jsou výkonnou molekulární mašinérií umožňující vysokou míru kontroly nad expresí jednotlivých genů, jedna molekula miRNA je schopna regulovat expresi desítek až stovek různých genů. V případě narušení bio­geneze miRNA tak může dojít k dysregulaci exprese specifických genů, které mohou hrát signifikantní roli v rámci určitého onemocnění [17]. Taková dysregulace miRNA, která hraje významnou roli v rámci daného onemocnění, již byla popsána u řady neurologických onemocnění, např. u Alzheimerovy nemoci, epilepsie, či neuroonkologických nemocí. V případě bulbospinální muskulární atrofie je dysregulace miR-196a považována za pravděpodobně kauzální [7,18]. V rámci patologie SMA doposud taková miRNA identifikována nebyla, ale bylo popsáno již několik molekul, jejichž dysregulace může mít zásadní vliv na průběh a vývoj onemocnění. Kaifer et al [9] identifikovali 16 signifikantně dysregulovaných miRNA s více než dvojnásobně sníženou expresí, nicméně i tato malá kohorta je schopna signifikantně ovlivnit vlastnosti motoneuronů a navodit projevy SMA. Jednou z takovým miRNA je miR-23a zodpovědná za ochranu neuronů a prevenci atrofie svalových vláken. Znovunavození exprese miR-23a brání před degenerativním poškozením motoneuronů in vitro u motoneuronů odvozených z pacientských indukovaných kmenových buněk (induced pluripotent stem cells; iPSC). Právě dysregulace miR-23a je pravděpodobně způsobena narušením fungování SMN a následným poškozením bio­geneze miRNA [9].

Rovněž miR-9, jejíž funkce v rámci nervové soustavy jsou značně pleiotropní, byla popsána jako signifikantně dysregulovaná u řady neurodegenerativních onemocnění. U motoneuronů s mutací SMN1 dochází ke snížení exprese miR-9, která je zodpovědná za jejich regeneraci. Zároveň je také pozorována její pozměněná hladina v séru modelových SMA myší, a to již v prvních fázích onemocnění. Zároveň byly pozměněné hladiny miR-9 i miR-132, detekovány i v séru pacientů trpících SMA [19]. Rovněž snížená exprese miR-335-3p, zodpovědné za sebeobnovu neuronů, byla potvrzena na lidském buněčném modelu SMA [20]. Snížení exprese miR-375 dále vede k vyšší expresi proteinu p53, který je zodpovědný za navození apoptózy u neuronů. Ty jsou obecně náchylnější na indukci apoptózy vyvolanou stresem. Právě zvýšená exprese p53 je poměrně častým znakem řady neurodegenerativních onemocnění. Naopak zvýšením exprese miR-375 dochází ke snížení exprese p53, a tím k větší ochraně motoneuronů před aberantním působením tohoto proteinu [21].

Mezi SMA podporující miRNA lze zařadit miR-146a, která je exprimovaná v SMA buněčných kulturách, je produkována astrocyty a exozomálně sekretována. Její exogenní aplikace poté vede k depleci motoneuronů v purifikované kultuře. Při vyšší expresi miR-146a dochází k umlčení exprese cílových genů, mezi které patří i NOTCH zodpovědný za neurogenezi. Je usuzováno, že zvýšená exprese miR-146a výrazně ovlivňuje závažnost a progresi onemocnění [22].

V případě miR-461 nedochází ke snížení její exprese v důsledku deficience SMN1. Inhibice této miRNA vede u SMN1 deficientních buněk k záchraně neurálního fenotypu skrze vyšší aktivitu mTOR dráhy, která je touto mikroRNA inhibována. Vyšší aktivita mTOR dráhy poté vede k vyšší proteosyntéze u mutantů SMN1, a snižuje tak dopad této mutace [23]. Další miRNA podporující rozvoj SMA je miR-431 (obr. 1), jejíž inhibice vede ke zvýšenému růstu neuritů a motoneuronů u in vitro modelu ztráty SMN1, délky těchto neuritů a velikost motoneuronů poté dosahují podobných velikostí jako v případě wild-type. Dysregulace této miRNA byla také popsána u pacientů se SMA typu I [24].

Z výše uvedených studií vyplývá, že role mikroRNA v rámci patogeneze SMA je výrazná a doposud ne zcela prozkoumaná. Rovněž atraktivní je využití těchto mikroRNA pro sledování průběhu a stanovení prognózy onemocnění. V současné době jedinými molekulárními markery používanými u SMA jsou kvantifikace proteinů SMN, to ovšem nezbytně nemusí korelovat se závažností a progresí onemocnění. Dále těžké řetězce fosforylovaných neurofilament pNF-H, jehož problémem je specifita pro neurony a nevypovídá tak nic o stavu nervosvalových plotének či svalů. Navíc v případě SMA typu 2 a 3 není příliš spolehlivým bio­markerem, jelikož jeho exprese není v korelaci se stavem motoneuronů. Sérový kreatinin je dalším možným bio­markerem, nicméně poměrně nespecifickým – jeho hodnoty se mohou výrazně lišit mezi jednotlivci, což je značnou komplikací pro stanovení prognózy [7].

Vzhledem k absenci spolehlivých bio­markerů jsou zvláště atraktivní cirkulující mikroRNA vyznačující se vysokou stabilitou v tělních tekutinách. Jejich detekce v séru/plazmě, či mozkomíšním moku (cerebrospinal fluid; CSF) by poté mohla umožňovat méně invazivní a přesnější stanovení dia­gnózy a prognózy onemocnění. Mezi nejslibnější bio­markery v kontextu SMA patří výše zmíněné molekuly miR-9, miR-132 či miR-375. Nicméně stále je třeba přesně určit jejich roli v rámci patogeneze SMA [7,25].

Pro roli mikroRNA jako vhodných bio­markerů hovoří i jejich využití v rámci jiných patologií, vč. neurodegenerativních onemocnění [26–29]. Nicméně stále zbývá adresovat řadu problémů, které je třeba před zavedením jakýchkoliv bio­markerů do standardní terapie SMA vyřešit. Zejména jde tedy o nízké výtěžnosti RNA z CSF. Jelikož neexistují žádné dedikované kity pro izolaci z tohoto materiálu, jako nejlepší se jeví kity pro izolaci cirkulujících miRNA z plazmy/séra [30]. Dalším problémem je nejasnost ohledně výskytu daných miRNA v tělních tekutinách. V případě, že jejich přítomnost zde je regulována, mohou i jiné, jak fyziologické, tak patologické změny vést k její alteraci. Největším problémem je však nesourodost studií, která je ve velké míře daná variabilitou preanalytické fáze, rozdílnými způsoby izolace a také samotnou metodou stanovení [31]. Metody pro analýzu mikroRNA profilů lze rozdělit do dvou kategorií, na metody založené na polymerázové řetězové reakci (polymerase chain reaction; PCR) a metody založené na sekvenování nové generace (new generation sequencing; NGS). Zejména PCR metodika je značně limitována nízkým množstvím vstupního materiálu, kdy je často nutné provést preamplifikační krok, který zanáší další chybu. Dalším problémem je absence vhodné referenční molekuly. Pro tělní tekutiny jsou již popsány ně­kte­ré vhodné endogenní kontroly, nicméně jejich využitelnost pro analýzu CSF je otázkou [30,32,33]. Jako vhodnější se proto jeví metodika NGS, které neklade takové nároky na koncentraci vzorku a zároveň je schopné detekovat i jiné molekuly nekódujících RNA potenciálně zapojených do patologie SMA a také jejich izoformy [34]. Naopak výrazným problémem může být kvalita vstupního materiálu, která může být u vzorků o nízké koncentraci problematická [33].

miRNA jsou slibnými bio­markery, nicméně v případě jejich použití v rámci dia­gnostiky SMA vyvstává několik problémů, které jsou ve velké míře shodné s problémy využití cirkulujících miRNA u ostatních onemocnění, jako jsou bio­logická variabilita, nízké koncentrace a z nich plynoucí technologické limitace. Technologie NGS nicméně umožňuje část těchto problémů vyřešit, a skýtá tak skutečný potenciál pro využití těchto cirkulujících RNA jako schopných nástrojů pro časné stanovení dia­gnózy a prognózy u SMA, sledování průběhu onemocnění či terapie. Pravděpodobnost využití jednotlivých miRNA je však poměrně nízká, jak naznačují případy jiných onemocnění. Bude to pravděpodobně panel dia­gnostických miRNA, možná doplněný i o jiné sncRNA a případně i další molekuly, který by mohl přinést kýženou rozlišovací schopnost mezi jednotlivými podtypy SMA, stejně jako by mohl být univerzálním nástrojem pro sledování onemocnění či účinků terapie [35–37].

Závěr

Spinální muskulární atrofie je onemocněním motoneuronů předních rohů míšních. Přežití motoneuronů je mimo jiné závislé také na specifických miRNA, které regulují jejích normální vývoj, diferenciaci, růst axonů, tvorbu synapsí a regulují jejích apoptózu [5]. S rozvojem nových terapeutických možností v léčbě SMA (nusinersen, genová terapie) je cílem výzkumu identifikace dia­gnostických a prognostických bio­markerů, ale také bio­markerů, které umožní predikovat individuální odpověď pacienta na léčbu. Dysregulace v expresi miRNA je významná v patogenezi onemocnění motoneuronů. Selektivní vulnerabilita motoneuronů předních rohů míšních je způsobená alterací exprese motoneuron specifických miRNA. Detekce těchto motoneuron specifických miRNA v mozkomíšním moku a/anebo krevní plazmě by mohla vést k objevení bio­markerů k časné dia­gnostice SMA, predikci závažnosti a rychlosti progrese onemocnění a monitoraci efektu léčby.

Konflikt zájmů

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem práce nemají žádný konflikt zájmů.

Grantová podpora

Podpořeno projektem MZČR-RVO (FN Brno, 65269705).

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE “uniform requirements” for biomedical papers.

MUDr. Štefania Aulická, Ph.D.
Klinika dětské neurologie
LF MU a FN Brno
Jihlavská 340/20
625 00 Brno
e-mail: stefania.aulicka@gmail.com
Přijato k recenzi: 8. 2. 2021
Přijato do tisku: 29. 7. 2021