Aplikace autologního séra-očních kapek vede ke statisticky významnému zlepšení stavu spojivky pacientů se syndromem suchého oka – pilotní studie

Súhrn

Cíl:
Zjistit objektivní stav spojivky a míru subjektivních obtíží pacientů se syndromem suchého oka před a po aplikaci autologního séra-očních kapek.

Soubor pacientů a metody:
Osmi pacientům s těžkým syndromem suchého oka bylo aplikováno autologní sérum-oční kapky po dobu 3 měsíců, a to úměrně počtu aplikací umělých slz, maximálně však 8krát denně. Klinické testy (Schirmerův test, čas potřebný k roztržení slzného filmu, barvení bengálskou červení, vyšetření menisku, detritu a keratitis punctata superficialis), laboratorní testy (morfologické vyšetření spojivky, detekce apoptotických buněk) byly provedeny před a po ukončení aplikace autologního séra-očních kapek. Během studie pacienti denně posuzovali subjektivní stav očí (pocit sucha, diskomfort, pocit cizího tělesa v oku a světloplachost).

Výsledky:
Aplikace autologního séra-očních kapek vedla ke statisticky významnému zlepšení hodnot Schirmerova testu, vyšetření detritu a keratitis punctata. Na povrchu spojivky došlo k zvýšení počtu pohárkových buněk a ke snížení počtu buněk apoptotických. Ve všech pacienty hodnocených kategoriích stavu oka došlo k významnému snížení intenzity nepříjemných pocitů.

Závěr:
Aplikace AS-očních kapek vede k objektivnímu zlepšení stavu spojivky i ke snížení subjektivních obtíží vnímaných pacienty. Pozitivní působení AS-očních kapek při syndromu suchého oka je zřejmý a jeho aplikace má předpoklady stát se běžnou léčebnou praxí.

Klíčová slova:
syndrom suchého oka, autologní sérum-oční kapky, spojivka

ÚVOD

Syndrom suchého oka, keratoconjunctivitis sicca (KCS), je stav charakterizovaný patologickými změnami na povrchu oka, ke kterým dochází na základě nízké produkce slz, jejich zvýšeným vypařováním, či při abnormálním složení slzného filmu [26].

Farmakoterapie KCS v současné době spočívá zejména v aplikaci umělých slz. Pacientům s mírnou formou se tradičně podávají umělé slzy s přítomností konzervačních látek, pacientům s těžší a těžkou formou jsou aplikovány umělé slzy bez konzervans, v případě potřeby lze přidat lubrikační mast na noc. Pokud jsou tato opatření nedostatečná, je třeba zvážit dočasnou či trvalou okluzi slzných kanálků, případně tarzorafii. Dalšími možnostmi léčby jsou lokální aplikace cyklosporinu A, kortikosteroidů, pomocnou metodou je i nošení ochranných brýlí [4, 19, 25, 30].

Intenzita KCS, často násobená toxickým působením konzervačních látek při intenzivní lokální léčbě, se odráží i v míře poškození povrchu oka [9]. Dochází ke kvalitativním i kvantitativním změnám v buněčném složení jeho povrchu, a to především v oblasti spojivky [28]. Charakteristickým rysem KCS je skvamózní metaplazie, projevující se snížením počtu až vymizením pohárkových buněk, snížením jádro-cytoplazmatického poměru epitelových buněk (zvětšení cytoplazmy oproti jádru) a jejich keratinizací [20, 31]. V epitelu spojivky vzrůstá i počet HLA-DR pozitivních buněk, jejichž přítomnost je charakteristickým projevem probíhajícího zánětlivého procesu [2]. Během KCS se zvyšuje počet odumírajících a mrtvých buněk na povrchu oka. Bylo prokázáno, že k zániku buněk spojivky pacientů s KCS dochází na základě apoptózy [1].

Navzdory léčbě si mnoho pacientů trpících KCS stěžuje na přetrvávání příznaků této choroby (pálení očí, pocit sucha či pocit cizího tělesa v oku), svědčících o poškození povrchu oka, přičemž objektivní klinický nález nemusí vždy míře subjektivních obtíží odpovídat. U těchto pacientů může být účinná aplikace přípravků, podporujících proliferaci a diferenciaci epitelu. Mezi takové patří autologní sérum (AS), jehož příznivý účinek na zlepšení hodnot některých klinických testů i subjektivní vnímání intenzity choroby pacienty byl v léčbě KCS prokázán [23].

Úspěch terapie AS je dán komplexním působením celé řady látek, které jsou v něm obsaženy. Jedná se především o růstové faktory, vitaminy, ale i základní nutriční komponenty, jejichž množství může být v slzách pacientů s KCS sníženo, nebo mohou úplně chybět. Vedle toho AS-oční kapky zvlhčují povrch oka, aniž by byly aplikovány pro organismus cizorodé látky a nemusíme se tedy obávat alergické reakce. Epidermální růstový faktor (epidermal growth factor, EGF) podporuje proliferaci a hojení epitelu [24, 36]. Fibronektin zvyšuje migraci epitelových buněk a jejich uchycení v oblasti defektu [21]. Transformující růstový faktor beta (TGFβ) moduluje účinky EGF a fibronektinu, při absenci EGF může proliferaci epitelu inhibovat [17]. Retinol brzdí progresi skvamózní metaplazie během KCS, ale v klinických studiích se jeho účinky nepotvrdily [32, 33]. V AS přítomné proteiny (především albumin) zvyšují stabilitu slzného filmu [29]. Přítomnost oleje v AS může nahradit lipidovou složku produkovanou meibomskými žlázami [10]. V kultivovaných buňkách spojivky zvyšuje aplikace AS expresi mucinu [11, 34]. Díky neurotropním faktorům: substanci P, inzulinovému a nervovému růstovému faktoru má AS i účinky neuroprotektivní [14]. Předností AS je i jeho antiinfekční působení dané přítomností lysozymu a imunoglobulinů [18]. V případě epitelových lézí na povrchu oka vede působení všech těchto látek v místě poškození ke stimulaci a urychlení hojení [30]. Vzhledem k tomu, že biomechanické a biochemické vlastnosti AS jsou velmi podobné slzám (pH ani osmolarita se téměř neliší), je jeho použití v prostředí oka velmi šetrné [8]. Nežádoucí účinky AS jsou ojedinělé (vznik imunoglobulinových depozit, periferní infiltrace a ulcerace u pacienta s revmatoidní artritidou) [16, 27].

Klinicky bylo AS úspěšně použito k léčbě těžkého syndromu suchého oka, přetrvávajících defektů epitelu, horní limbální keratokonjunktivitidy, recidivujících erozí rohovky, neurotrofické keratopatie i k zastavení zevní filtrace z filtračních polštářků po trabekulotomii [14, 15, 22, 27, 35, 37].

Cílem této studie bylo zjistit objektivní změny na spojivce a míru subjektivních obtíží pacientů s KCS před a po aplikaci AS-očních kapek.

SOUBOR PACIENTŮ, METODY

Studie byla schválena Etickou komisí VFN a 1. LF UK; všichni pacienti byli do studie zařazeni po podepsání informovaného souhlasu s odběrem krve pro přípravu AS-očních kapek a s provedením otiskové cytologie spojivky.

Sledovaný soubor tvořilo osm pacientů (7 žen, 1 muž, hodnoceno 16 očí), s těžkým syndromem suchého oka: Schirmerův test < 5 mm, čas potřebný k roztržení slzného filmu (break-up-time test, BUT) < 5 sekund. Průměrný věk pacientů byl 54,8 let (rozmezí: 28–70 let). Šest z těchto pacientů trpělo primárním Sjőgrenovým syndromem, 2 pacienti měli KCS nejasné etiologie. Terapie sledovaných osob umělými slzami se neměnila nejméně po dobu 3 měsíců před začátkem a po celou dobu studie. Tři pacienti aplikovali Hypotears SDU PLUS, 3 pacienti Hylocomod, 1 pacient Lacrysin a 1 pacient Tears Natural II.

Příprava a aplikace AS-očních kapek: pacientům bylo odebráno 40 ml venózní krve, ta byla centrifugována (4000/min, po dobu 15 minut), sérum odebráno a zředěno fyziologickým roztokem na 20 %, plněno po cca 3–5 ml do sterilních označených lahviček. Připravené AS-oční kapky byly zamrazeny na -20 °C a po provedení kontroly sterility předány pacientům. Ti byli poučeni, jak AS-oční kapky uchovávat a aplikovat (zásobní kapky je třeba uchovávat v mrazáku při -20 °C, používané kapky v lednici při 4–8 °C). Pacienti si kapali AS-oční kapky po dobu 3 měsíců, a to úměrně počtu aplikací umělých slz, maximálně však 8krát denně. AS-oční kapky byly podávány asi 15 minut po aplikaci umělých slz.

Z klinických testů byl proveden Schirmerův test I, BUT (měřen čas potřebný k roztržení slzného filmu v s), vitální barvení 1% roztokem bengálské červeně (intenzita zbarvení na rohovce a interpalpebrální spojivce byla hodnocena pomocí pětistupňové škály 0–4). Ve škále 0–4 byly hodnoceny keratitis punctata superficialis a přítomnost detritu. Vyšetření menisku slzného filmu bylo provedeno při okraji dolního víčka a hodnoceno v mm.

Pro laboratorní testy byly použity vzorky získané pomocí otiskové cytologie, která byla provedena přitisknutím odběrového materiálu na horní a dolní bulbární spojivku ve vzdálenosti 2 mm od limbu po dobu 3–5 sekund [20, 31].

Odběr z horní a dolní bulbární spojivky byl proveden na nitroacetátcelulózové filtrační papíry (Millipore GSWP 0.4700, velikost pórů 0,22 μm) a vzorky použity pro morfologické vyšetření. Odběr ve stejných lokalizacích byl proveden i na membrány Millicell (Biopore MILLICELL^®-CM, PICM 01250, Millipore), vzorky byly použity pro imunofluorescenční vyšetření.

Vzorky pro morfologické vyšetření byly fixovány a obarveny [12]. Počet epitelových a pohárkových buněk/mm² byl zjištěn pomocí programu pro obrazovou analýzu LUCIA (Laboratory Imaging, Česká republika), vždy nejméně z  5 fotografií snímaných pomocí kamery Vosskühler VDS CCD-1300 (VDS Vosskühler, GmbH, Německo) z mikroskopu Olympus BX 51. Zakódované vzorky byly hodnoceny nezávisle dvěma pracovníky; ve výsledcích jsou uvedeny průměrné hodnoty.

Detekce apoptotických buněk byla provedena na membránách Millicell po fixaci (1 min) koncentrovaným acetonem. Membrány uvolněné působením acetonu z plastikového nosiče byly umístěny na kulatá krycí skla (12 mm) a buňky permeabilizovány 0,2% tritonem (Triton X-100, Sigma-Aldrich Corp, St Luis, MO, USA) ve fosfátovém pufru. Pro detekci apoptózy byl použit In Situ Death Detection Kit, Fluorescein (Roche Applied Science, Mannheim, Německo). Principem detekce je značení volných 3’-OH konců DNA vznikajících během apoptózy vazbou fluorescenčně značených nukleotidů (deoxyuridin trifosfát) pomocí terminální deoxynukleotidyl transferázy [7]. Vzorky byly montovány pomocí média Vectashield (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, USA) s propidium jodidem, který interkaluje s DNA a zviditelňuje buněčná jádra. Vzorky byly hodnoceny pomocí fluorescenčního mikroskopu Olympus BX 51 a procento apoptotických buněk zjišťováno na základě hodnocení alespoň 1000 buněk.

Statistická analýza

Pro analýzu dat byl použit statistický software R (v.2.2.1). K testování hypotézy nulového efektu použit párový Wilcoxonův test. K výpočtu exaktních p-hodnot byla použita R-knihovna exactRankTests (v.0.8-12). Za statisticky významnou byla považována hladina rovná nebo nižší než 5 %.

VÝSLEDKY

Hodnoty klinických testů před a po aplikaci AS-očních kapek jsou zaznamenány v tabulce 1.

K statisticky významnému zlepšení došlo u ST (p = 0,04492), vyšetření detritu (p = 0,00098), a keratitis punctata (p = 0,03125). U vyšetření BUT a menisku došlo ke zlepšení, které nebylo statisticky významné. U barvení bengálskou červení došlo k mírnému statisticky nevýznamnému zhoršení.

Z laboratorních testů došlo ke statisticky významnému zvýšení průměrného počtu pohárkových buněk z 35 na 68 buněk/mm² (tj. na 194 % původních hodnot, p = 0,01038, *) na horní bulbární spojivce a z 34 na 79 buněk/mm² (tj. na 232 % původních hodnot, p = 0,00085, ***) na dolní bulbární spojivce. V počtu epitelových buněk došlo k mírnému statisticky nevýznamnému nárůstu (z 2660 na 2761 buněk/mm²) na horní spojivce a k mírnému statisticky nevýznamnému poklesu (z 2479 na 2447 buněk/mm²) na spodní spojivce. Rozdíl mezi povrchem spojivky před a po aplikaci AS-očních kapek byl u většiny pacientů dobře patrný (obrázek 1).

Aplikace AS-očních kapek vedla ke snížení počtu apoptotických buněk na povrchu spojivky z 6,6 na 5,1 %.

K zmírnění vnímání nepříjemných pocitů u hodnocených pacientů došlo ve všech sledovaných kategoriích a to v průměru o 0,6 stupně (tabulka 2).

Výraznější zlepšení udávali pacienti, kteří vnímali své obtíže před začátkem studie jako výrazné. Pacienti, kteří byli stabilizovaní a relativně bez intenzivně vnímaných potíží, rozdíl před a po podávání AS-očních kapek nevnímali jako výrazný.

DISKUSE

Ačkoliv byla první náhrada slz autologním sérem popsána již v roce 1984 – právě u pacientů s KCS [6], širší uplatnění nachází AS v léčbě oka až začátkem 21. století. Rozkvět v jeho používání nastal díky studiím, které odkryly mechanismy jeho působení a především díky pozitivním výsledkům, které byly po léčbě AS zaznamenány u celé řady onemocnění projevujících se poškozením epitelu na povrchu oka.

K statisticky významnému zlepšení po aplikaci AS-očních kapek došlo kromě syndromu suchého oka, v léčbě KCS s reakcí štěpu proti hostiteli, přetrvávajících defektů epitelu, limbální keratokonjunktivitidy, neurotrofní keratitidy, recidivujících erozí rohovky, defektů epitelu vzniklých v důsledku refrakčního laserového zákroku [3, 5, 10, 13, 22, 34, 37].

Úspěch AS spočívá v náhradě celé řady základních nutričních látek na povrchu oka, které při KCS mohou být sníženy nebo chybět, ale i růstových faktorů, antioxidačních a dalších příznivě působících látek [23, 34]. Aniž by byly aplikovány pro organismus cizorodé látky zvlhčuje AS povrch oka. AS také – na rozdíl od řady komponent umělých slz – nenarušuje integritu buněčných membrán [27]. Další výhodou AS-očních kapek je, že je lze aplikovat poměrně často – i více než 10krát denně [10, 23].

AS se používá koncentrované, ale častěji ředěné na 50 až 20 % [23, 27, 30, 37]. V současnosti je vzhledem k 5krát vyšší koncentraci TGF‚ [34] v séru než v slzách a možnému antiproliferačnímu působení TGF‚ při vyšších koncentracích, aplikováno téměř výhradně 20% AS [34]. Pro zachování stability TGF‚ trvající při -20°C asi 3 měsíce [35], jsme připravovali AS-oční kapky pro aplikaci nepřesahující toto období. V některých studiích přidávali do AS-očních kapek i antibiotika [27]. V naší studii jsme podobně, jako celá řada autorů, vycházeli z faktu, že látky s antiinfekčním působením obsažené v séru ochrání před případnou kontaminací kapky samotné, ale i povrch oka po jejich aplikaci [34].

Při léčbě KCS bylo ve většině studií AS aplikováno současně s umělými slzami [30, 34], v některých však jejich aplikaci zcela nahrazuje [13, 23].

Absolutní kontraindikace použití AS se neuvádí, relativní kontraindikace se liší i v rámci evropských států. Například relativní kontraindikací aplikace AS je séropozitivita pro HIV, hepatitidu A, B, C a syfilis, relativní kontraindikací odběru většího množství krve (nad 100 ml) může být anémie (hemoglobin < 11g/dl) či vážné kardiovaskulární onemocnění [8].

Výsledky naší studie ukazují, že aplikace AS-očních kapek po dobu 3 měsíců vedla k  zlepšení většiny klinických testů (ST, BUT, vyšetření detritu, keratitis punctata superficialis a  menisku slzného filmu). Mírné statisticky významné zlepšení hodnot Schirmerova testu odpovídá i hodnotám zjištěným v jiných studiích [30]. Za významné lze považovat i snížení přítomnosti detritu a keratitis punctata superficialis, které dosud po působení AS nebylo dokumentováno.

Statisticky nevýznamné zhoršení, které nastalo u barvení bengálskou červení, by mohlo souviset s obnovou buněk epitelu trvající po dobu aplikace AS-očních kapek. Ke zlepšení výsledků barvení bengálskou červení ovšem na rozdíl od našich výsledků došlo po aplikaci AS u pacientů s KCS v několika studiích [23, 30, 34].

Zásadní pozitivní změny byly zaznamenány v buněčném složení povrchu spojivky, kde se statisticky významně zvýšil počet pohárkových buněk. Zhodnocením písemných záznamů účastníků studie o stavu oka, jsme zjistili, že došlo k významnému snížení intenzity nepříjemných pocitů ve všech hodnocených kategoriích. Při závěrečném zhodnocení působení AS-očních kapek však dva pacienti rozdíly nevnímali. Jednalo se o pacienty, kteří před začátkem studie svůj stav vnímali jako stabilizovaný a výraznější problémy neudávali. Šest pacientů udává mírné až výrazné zlepšení. Všichni tito pacienti před začátkem studie vnímali stav svých očí jako nepříjemný. Přestože pacienti byli poučeni, aby během studie neměnili dávkování stávající terapie, vedlo dva pacienty subjektivní zlepšení stavu očí ke spontánnímu snižování počtu denních dávek umělých slz. Čtyři ze sledovaných pacientů po ukončení studie přišli s přáním v aplikaci AS-očních kapek pokračovat. Naše výsledky jsou v souladu s jinými studiemi, ve kterých bylo rovněž zaznamenáno subjektivní zlepšení [23, 30].

Na základě těchto výsledků můžeme shrnout, že aplikace AS-očních kapek vede k zlepšení subjektivního stavu pacienta, ale i k objektivnímu zlepšení stavu spojivky ve většině sledovaných parametrů zjištěných jak klinickými, tak i laboratorními metodami. Pozitivní působení AS při KCS a hojení epitelu povrchu oka je zřejmý a jeho aplikace má tak předpoklady stát se běžnou léčebnou praxí.

PODĚKOVÁNÍ

Tato studie byla podpořena projektem Sicca research 2005 (Bauch and Lomb) a VZ MŠMT 002160806/20610011. Autoři děkují firmě Ursapharm za poskytnutí přípravku HYLO-COMOD pacientům začleněným do této studie.

Mgr. Kateřina Jirsová, PhD.

VFN a 1. LF UK

U Nemocnice 2

128 08 Praha 2

e-mail: katerina.jirsova@vfn.cz