Prediktivní diagnostika u karcinomu prsu

Súhrn

Přes pevnou pozici vyšetřování některých prediktivních markerů – vedle stanovení standardních morfologických znaků – existuje ve standardu vyšetření karcinomu prsu celá řada otevřených otázek a výzev pro budoucnost.

Markerem u karcinomu prsu, který je v literatuře v posledních letech nejvíce diskutován, je HER-2/neu. V roce 2007 došlo ke změně kritérií pozitivity, což paradoxně vyvolalo určitá nedorozumění. Málo poznatků je zatím k dispozici u nádorů s diskordantním fenotypem (nesoulad mezi výsledkem imunohistochemie a in situ hybridizace). Vzhledem k tomu, že i u selektované populace HER2 pozitivních karcinomů je anti-HER2 léčba účinná jen asi u 30 % pacientek, nabízí se otázka, jaké další faktory jsou zodpovědné za selhání léčby a zda jsme schopni identifikovat pomocí nových markerů tyto případy.

Klíčová slova:
karcinom prsu – HER-2/neu – imunohistochemie – in situ hybridizace

Karcinom prsu jako nejčastější zhoubné onemocnění žen v rozvinutých zemích, ČR nevyjímaje, budí jistě zaslouženou pozornost nejen v oblasti novinek terapeutických, ale rovněž v otázkách správné, přesné a rychlé diagnostiky. Alfou a omegou histopatologického vyšetření je nepochybně stanovení správné diagnózy, stupně diferenciace a pokročilosti onemocnění, postižení sentinelové uzliny (1), vztahu nádoru k resekčním okrajům, apod. Všechny tyto parametry lze zjistit za pomoci prosté morfologie bez použití speciálních metodik. Pro svůj zásadní význam při volbě optimální léčby jsou dnes však u celé řady nádorů (2) vyšetřovány také speciální molekulární znaky, které pomáhají onkologovi lépe se rozhodnout při volbě optimálního terapeutického postupu, zejména tehdy, když se jedná o možnost podání ekonomicky náročné tzv. cílené terapie.

Proto byly také u karcinomu prsu do diagnostického standardu zahrnuty výsledky imunohistochemického vyšetření exprese hormonálních receptorů, proliferačních markerů (v dnešní době prakticky výhradně antigenu Ki67) a některých onkoproteinů (p53 či HER-2/neu). Zejména otázky kolem vyšetřování posledního jmenovaného receptoru jsou v naší i světové literatuře velmi diskutovány. Pozornost se soustředí zvláště na oblast kvality provedení a reprodukovatelnosti vyšetření, na volbu optimálního diagnostického postupu a také na ideální kritéria, s jejichž pomocí dokáže patolog s nejvyšší možnou pravděpodobností vyselektovat pacientky k nákladné biologické léčbě.

Protein HER-2/neu (dále jen HER2), popsaný poprvé v roce 1982, je produktem přepisu onkogenu c-erbB-2 lokalizovaného na dlouhém raménku 17. chromozomu (17q21). Tento protein o molekulové hmotnosti 185kd je zástupcem skupiny receptorů pro epidermální růstový faktor (EGFR). Kromě HER2 patří do této skupiny také receptory HER1 (EGFR), HER3 a HER4. Tyto 4 molekuly jsou do značné míry homologní – mají extracelulární doménu, na kterou se váže ligand daný receptor aktivující, transmembránovou doménu a intracelulární doménu, která se vyznačuje tyrozinkinázovou aktivitou, díky které je signál předán k dalšímu zpracování (3).

Na samém počátku signální dráhy je moment dimerizace receptoru – homodimerizace, či v případě vazby na jiný receptor z rodiny HER, heterodimerizace. Jednotlivé molekuly skupiny HER se od sebe poněkud liší – právě HER2 je jediným zástupcem, který není přímo aktivován svým ligandem (má “necitlivou” či “slepou” svou extracelulární doménu) a podílí se tak na procesu dimerizace spontánně a z celé skupiny HER receptorů nejochotněji. Následná fosforylace a aktivace signální dráhy vede ke zvýšené proliferaci, zablokování apoptózy, zvýšené vaskularizaci nádoru a vyššímu metastatickému potenciálu. Proto je HER2 u karcinomu prsu považován za jednoznačně nepříznivý prognostický faktor (4).

U některých nádorů (karcinomy prsu, slinných žláz, pankreatu, endomeria, ovaria) je tento receptor zvýšeně exprimován – místo desítek tisíc molekul, které jsou přítomny na povrchu normálních epiteliálních buněk, je jich u tumorů s overexpresí HER2 na membráně nádorové buňky přítomno několik stovek tisíc až milion kopií. Příčinou overexprese, vyskytující se u zhruba 15 procent všech karcinomů prsu, je v naprosté většině případů amplifikace genu c-erbB-2 (5). Pozitivita HER2 (ať již stanovená imunohistochemicky (IHC) na úrovni proteinu, nebo in situ hybridizací (ISH) na úrovni genu), bývá významně častější zejména u nádorů nízce diferencovaných, častěji u karcinomů duktálních než lobulárních (6).

Jak bylo již výše řečeno, až do 90. let minulého století byla zvýšená exprese HER2 považována pouze za negativní prognostický faktor (4). Avšak se zavedením trastuzumabu (Herceptin^®) do léčby na konci 90. let se situace změnila. Trastuzumab je humanizovaná monoklonální protilátka cílená proti HER2 receptoru a proto jsou pro léčbu vhodné právě pacientky s agresivnějšími HER2 pozitivními nádory. Prognóza u pacientek s HER2 pozitivním metastatickým karcinomem prsu je v případě neoadjuvantní léčby chemoterapií kombinovanou s trastuzumabem lepší než u pacientek, které mají nádor HER2 negativní a jsou léčeny neoadjuvantně pouze chemoterapií (7). Z čistě prognostického markeru se tak HER2 stal rovněž markerem prediktivním a jeho vyšetřování se ukázalo být zcela zásadním pro selekci těch pacientek, které jsou pro léčbu trastuzumabem vhodné.

Stojíme však před – jen zdánlivě jednoduchou – otázkou, jak definovat HER2 pozitivní karcinom prsu. V dřívější době byly jako nádory HER2 pozitivní označovány ty, které vykazovaly silnou imunohistochemickou membránovou pozitivitu (3+) ve více než 10 % nádorových buněk, nebo nádory s amplifikací genu c-erbB-2 definovanou jako průměrný absolutní počet kopií genu v jádře >4, nebo jako poměr mezi počtem kopií genu c-erbB-2 a počtem signálů centromerické oblasti 17. chromozomu >2.

V roce 2007 však American Society of Clinical Oncology a College of American Pathologists vydaly společné doporučení, které změnilo kritéria HER2 pozitivity (8). Pro imunohistochemii byl z důvodu eliminace nádorů s minoritní HER2 pozitivní komponentou zvýšen minimální podíl pozitivních buněk z původních 10 % na 30 %, u FISH pak byla zavedena kategorie hraničních nádorů, kde poměr HER2/CEP17 se pohyboval v rozmezí 1,8–2,2, případně v rozmezí absolutního počtu 4–6 kopií genu na jádro. V oblasti imunohistochemie se nejednalo o zásadní změnu. Heterogenních lézí s podílem pozitivní komponenty mezi 10% a 30% je relativně málo a i u těch, které budou z důvodu zvýšené hranice pro pozitivitu hodnoceny nikoli jako 3+, ale jako 2+, bude následně provedeno vyšetření in situ hybridizací, které potvrdí, zda je gen amplifikován, či nikoli.

Naproti tomu zavedení kategorie hraniční amplifikace vedlo k celé řadě nedorozumění. Důvodem pro zavedení hraniční kategorie byl fakt, že v důsledku interindividuální variability mohli dva různí hodnotitelé dojít při kvantifikaci počtu kopií genu k rozdílům, které nebyly matematicky velké (např. 1,9 versus 2,1), ale měly zásadní dopad na klinické rozhodování (nepodání versus podání Herceptinu). Proto bylo doporučeno, aby u nádorů, které budou spadat do hraniční kategorie, bylo počítáno větší množství jader, použit jiný tkáňový blok, apod., tak aby se pokud možno prokázalo nade vší pochybnost, zda je nádor amplifikován, či nikoli. Pokud bude výsledná hodnota i nadále v hraniční oblasti, platí, že pro anti-HER2 léčbu jsou vhodné případy s hodnotou HER2/CEP17 2 a vyšší. Zatímco tedy pro stanovení ISH pozitivity (amplifikace) platí hranice poměru HER2/CEP17 2,2, pro indikaci terapie trastuzumabem nadále zůstává platná původní hranice 2,0.

Obě běžně používané metody – IHC a ISH, se zaměřují na odlišné struktury. Ve většině případů je výsledek obou vyšetření konkordantní (obě vyšetření pozitivní, nebo obě negativní), míra shody mezi oběma metodami (9–11) přesahuje 95 %, u menšiny nádorů se však lze setkat s výsledky diskordantními (jedno z vyšetření pozitivní, druhé negativní). Tyto diskordantní výsledky neznamenají nutně selhání – falešnou pozitivitu či falešnou negativitu – jedné z metod, příčiny mohou být (a často jsou) důsledkem inherentních biologických vlastností daného nádoru. U nádorů IHC+/ISH- jde nejčastěji o případy, kdy zvýšená exprese proteinu je způsobena polysomií chromosomu 17 v nádorové buňce (9), u nádorů IHC-/ISH+ může jít o důsledek změn struktury proteinu, který je následně imunohistochemicky nedetekovatelný (12).

Celá řada studií prokázala, že amplifikace genu je prediktorem efektivity léčby trastuzumabem, bez ohledu na výsledek IHC; další studie (13,14) však ukazují, že také pacientky s nádory IHC 3+ profitují z léčby trastuzumabem i v případě, kdy nebyla ISH prokázána amplifikace genu. Není tak překvapením, že dle analýzy dat ze studie HERA efekt léčby trastuzumabem nezávisí na stupni amplifikace genu, ať již hodnoceném pomocí indexu HER2/CEP17 nebo pomocí absolutního počtu kopií genu HER2 (13,15). Zajímavým zjištěním je, že pravděpodobně důležitější, než poměr HER2/CEP17 je absolutní počet kopií genu HER2 v jádře (16,17). Navíc, stav detekovaný jako polysomie pomocí FISH nemusí být skutečnou polysomií, ale ve značném počtu případů může jít pouze o současnou amplifikace HER2 a centromerické oblasti chromozomu 17 (18).

Zavedení nových metod hodnocení amplifikace genu – CISH a SISH je jednou z novinek, která přináší celou řadu výhod. Vzhledem k tomu, že vyšetření je prováděno v klasickém světelném mikroskopu, přináší tato novinka několik podstatných výhod. Při použití těchto metod lze preparáty archivovat (nedochází ke ztrátě signálu, jako tomu je u FISH), hodnocení počtu kopií genu lze provádět v kontextu morfologie jednotlivých nádorových buněk, u nádorů, které jsou heterogenní, lze lépe stanovit procento buněk, které vykazují amplifikaci (19).

Přitom CISH i SISH vykazují excelentní shodu (přes 95 %) v naprosté většině studií, srovnávajících je s klasickou FISH (20,21). Podobně jako FISH, lze i SISH použít také pro vyšetření cytologických nátěrů.

Zároveň je třeba konstatovat, že přes zlepšující se diagnostiku se pozitivní efekt trastuzumabu projeví jen asi u 30 % všech takto léčených nemocných (15,22). Tento fakt podtrhuje nutnost dalšího zpřesňování diagnostiky a zlepšení výběru nejvhodnějších kandidátů pro tuto nákladnou terapii. Kromě nepochybně narůstajícího (a oprávněného) tlaku onkologů na zpřesňování a standardizaci laboratorních metod, což by mělo vést k zvyšování validity histopatologického vyšetřování, to bude zavádění nových markerů do rutinní diagnostiky.

Příčin rezistence na léčbu, resp. jejího časného selhání, však může být celá řada. Obviňována byla zejména skutečnost, že během metastazování karcinomu prsu se vyselektují klony, které mohou mít vlastnosti odlišné od primárního nádoru, který je zpravidla testován a metastázy tak mohou mít jiný molekulární profil, než primární nádor. Tento předpoklad platí v menší části případů, ale jistě takto nelze vysvětlit tak výraznou diskrepanci mezi výsledky vyšetření HER2 a odpovědí na léčbu (23).

Důležitým faktorem je skutečnost, že část karcinomů prsu, které jsou HER2 pozitivní (amplifikované a/nebo IHC silně pozitivní), exprimuje na buněčné membráně defektní – zkrácený – receptor HER2, který postrádá větší část své extracelulární domény. Tento receptor je označován v literatuře jako p95HER2, případně jen jako p95. Molekuly fragmentovaného receptoru vznikají přinejmenším 2 rozdílnými mechanismy – proteolytickým odštěpením extracelulární domény receptoru o původně normální délce, nebo přepisem kratší části genu (mRNA se začíná přepisovat od vnitřního iniciačního kodonu) (24). První zmiňovaný děj vede ke vzniku kratší varianty receptoru s pouhými 4 aminokyselinami v extracelulární doméně. Tyto receptory nemají tendenci k dimerizaci a jsou tak víceméně biologicky nefunkční. Naproti tomu druhá zmiňovaná možnost vede ke vzniku receptoru se zkrácenou extracelulární doménou obsahující 5 molekul cysteinu. Ten velmi ochotně tvoří disulfidické můstky, což vede ke spontánní homodimerizaci receptoru, paradoxně podstatně častější, než u plnohodnotných molekul HER2 (24,25). Nádory s touto variantou zkráceného receptoru (p95HER2+) jsou tak dokonce výrazně agresivnější, než nádory s overexpresí intaktního HER2. Receptor je sice detekovatelný pomocí IHC, vazebné místo pro trastuzumab ale molekula postrádá a nádor na léčbu nereaguje. V literatuře se již objevily první práce popisující IHC detekci p95, což by v budoucnosti umožnilo identifikaci těch nádorů, které budou s velkou pravděpodobností rezistentní na léčbu trastuzumabem, avšak bude u nich možné (vzhledem k zachované intracelulární tyrozinkinázové aktivitě receptoru) použít malomolekulární intracelulární inhibitory (např. lapatinib) (22). Teprve další prospektivní studie ale prokážou, jaká je senzitivita a specificita průkazu p95 a zda tedy bude tento marker použitelný v rutinní klinické praxi.

Závěrem tak lze konstatovat, že v současné době stojíme před mnohými výzvami – s nárůstem poznatků na poli predikce odpovědi na cílenou léčbu se ukazuje, že celá situace je daleko komplexnější a nelze ji popsat schematickým vztahem “pozitivní marker = odpověď na terapii”. Kromě již známých faktorů, které jsou ve hře (dodržení všech zásad zacházení s materiálem během preanalytické fáze, soustavná kontrola kvality testování, dodržování stanovených pravidel při interpretaci) se objevují faktory nové. Blokování signálních drah u nádorových buněk předpokládá nejen přítomnost struktur, na které se jednotlivé léky mohou vázat, ale také zachovalou funkčnost těchto signálních drah. Je třeba si uvědomit, že naše porozumění tzv. crosstalku, kdy jednotlivé dráhy spolu komunikují, a zablokování jedné cesty vede k přenosu signálu cestou jinou, je teprve na samém počátku.

PODĚKOVÁNÍ

Práce byla podpořena výzkumným záměrem MZ ČR MZO 00179906.

Adresa pro korespondenci:

Prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.

Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN

500 05 Hradec Králové

tel: 495833748, fax: 495832004

e-mail: ryskaale@fnhk.cz