Cesta k cíli vede přes spolupráci

RNDr. Lenka Krsková, Ph.D. vystudovala Přírodovědeckou fakultu UK v Praze, obor molekulární biologie a genetika. Už během studií a krátce po absolutoriu pracovala v oddělení molekulární genetiky Ústavu hematologie a krevní transfuze v Praze. Od roku 2000 zakotvila v Laboratoři molekulární patologie Ústavu patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN v Motole, kde pracuje dodnes. Odborně se v současnosti věnuje zejména molekulární patologii nádorů měkkých tkání a nádorů CNS.

Jak se z člověka stane biolog?

Myslím, že většina biologů miluje otázku „PROČ?“. Správný biolog si tuto otázku klade neustále: Proč vznikl život? Proč zanikl nějaký ekosystém? Proč dochází ke vzniku malignit? Proč dochází k mutacím? .. a podobně. Asi nám zůstala dětská duše a tím i nejčastější dětská otázka PROČ?

Jak se z člověka stane genetik?

Já jsem se pro molekulární biologii a genetiku rozhodla na gymnáziu, když nám profesorka v hodině biologie řekla, že od příští hodiny bereme genetiku a „to teprve bude horror, miláčkové!“ … a bylo rozhodnuto. Byla to výzva! A občas si dělám legraci, že je to způsobeno zárodečnou mutací u potomků jaderných fyziků. Sešli jsme se v ročníku čtyři, kteří měli alespoň jednoho rodiče jaderného fyzika, a to v té naší nevelké skupině bylo dost statisticky významné číslo…

Jak se z člověka stane molekulární patolog?

Tak to je asi osud. Když jsem v roce 2000 zauvažovala o změně místa, abych poznala i něco jiného než pracoviště, kde jsem dělala Ph.D., objevila jsem volné místo na Ústavu patologické anatomie 2. LF UK a FN Motol. Moje první reakce byla - no to jste se zbláznili a co bych tam jako dělala?! Ale jelikož mám ráda ty výzvy… No, a za krátko byl z Ústavu patologické anatomie Ústav patologie a molekulární medicíny.

Co molekulárního patologa na patologii nejvíc trápí?

Asi nedostatek financí, protože stále vidíte nové možnosti, co zavést, co udělat, co vylepšit, co rozšířit, ale jelikož jde většinou o poměrně finančně náročné metody, na které obor patologie historicky nebyl nastaven, tak se neustále střetáváte s realitou - kde na to vzít, co nejdřív a jak to vyjde.

Co molekulárního patologa na patologii nejvíc těší?

Jednoznačně velmi pestrá práce a pocit, že to, co děláte, má opravdu nějaký smysl. Například, že určením nějakého fúzního genu přispějete k upřesnění diagnózy, nebo, že naleznete fúzní gen/molekulární změnu, která se dá v dnešní době cílené terapie terapeuticky zacílit. A hlavně, když zjistíte, že to funguje a že to tomu pacientovi opravdu pomohlo. To mě neomrzí asi nikdy a s každým novým během NGS číhám, co zjistíme za „rarity“ a jak to budeme ladit.

Je morfologická patologie za zenitem, budou patologové házet mikroskopy z okna a masově nakupovat přístroje na NGS?

Myslím, že ne. Kdo by nám odečítal procenta nádorových buněk a jak bychom věděli, co vlastně vyšetřujeme? Vždy vysvětluji studentům, že stanovit diagnózu je jako sestavit puzzle nebo mozaiku. Vše musí dobře zapadat. Pokud to neladí, nezapadá, je potřeba se na to podívat z jiného úhlu a ladit po všech směrech: z morfologického hlediska, imunohistochemického i toho genetického. A dnes už nám hodně pomáhá i epigenetika, jako je metylační profilování.

Opravdu nelze z tkáně fixované formolem a zalité v parafinu získat validní molekulární data?

Teď jsem asi sama proti sobě, když řeknu, že lze. Jde to, ale… musíte mít dobře fixovaný a zpracovaný materiál. Určitě je pro molekulární vyšetření mnohem vhodnější nativní/mražený materiál. Například, když potřebujeme detekovat fúzní gen, který má velké množství zlomových míst, tak v případě mraženého materiálu uděláme jednu RT-PCR a máme hotovo, jelikož lze naamplifikovat molekulu řádově ve stovkách párů bazí. V případě, že vycházíme z fixovaného materiálu, musíme udělat celou řadu reakcí – nejdříve na ta nejčastější zlomová místa, pak méně častá a někdy skončíme u RNA NGS, protože nejsme schopni fúzi prokázat, neboť máme fragmentované nukleové kyseliny. Ale podařilo se nám například pomocí RNA NGS prokázat fúzní gen KIAA1549-BRAF s fúzí exonů 16 a 9 z 34 let starého FFPE bločku u pacienta s low-grade gliomem a porovnat ho se současnou recidivou. Takže to vlastně jde, ale ne vždy…

V čem spočívá práce molekulárního patologa? Strčí se do stroje vzorek a vyjede výsledek?

Že by nám ze stroje jen tak vyjel výsledek, je fakt výjimka potvrzující pravidlo. Máme sice jeden přístroj, který na principu real-time PCR detekuje hot spot mutace některých genů, kdy po vložení parafínových řezů nebo 2 ml plazmy proběhne ve speciální kazetě izolace i PCR a přístroj nám pak poskytne výsledek mutační analýzy. Tato analýza ale funguje pouze na velmi úzkém spektru našich vyšetření. Běžnou prací molekulárního patologa je diagnostika na úrovni DNA nebo RNA, kdy hledáme různé mutace, početní změny kopií genů, nebo fúzní geny, sledujeme expresi různých genů, změny na úrovni metylace apod., a právě těchto molekulárních změn využíváme v diagnostice nádorových onemocnění. Řada změn má prognostický význam a v dnešní době personalizované terapie má řada změn i terapeutický dopad. Takže prací molekulárního patologa je ve spolupráci s patologem v návaznosti na morfologii vybrat optimální strategii vyšetření vzorku tak, abychom pokud možno dosáhli kýženého výsledku v podobě detekované molekulární změny a zároveň analýzu neprodražovali zbytečnými vyšetřeními. Při analýze pak musíme zohlednit morfologii velmi často v korelaci se zobrazovacími metodami a klinickým chováním, věkem pacienta (protože některé změny jsou časté v různých věkových skupinách, takže např. vyšetření mutace genů IDH nebudeme indikovat u infantilních gliomů, apod). Velká část práce molekulárního patologa je také zvážit, zda nějaká detekovaná změna může být patogenní a/nebo zda skutečně souvisí s daným onemocněním.

Nestačila by vám na většinu vyšetření dnes hodně skloňovaná metoda NGS?

To asi úplně ne. Dost často by byla zbytečná, protože mám-li pacienta se suspektním synoviálním sarkomem, tak pomocí běžné RT-PCR vyšetřím fúzi genů SS18 a SSX či pomocí fluorescenční in situ hybridizace zlom v oblasti genu SS18 a analýza NGS by byla zbytečná. A takových příkladů by bylo mnoho. Ale mám-li pacienta, u kterého je diagnóza z morfologického hlediska obtížná a nemůžeme se nějaké charakteristické změny dopátrat, použijeme metodu NGS. Rovněž u pacientů s progresí nebo relapsem onemocnění má metoda NGS nezastupitelnou úlohu, protože nám může pomoci najít nějaký terapeutický cíl. Tato metoda nám navíc napomáhá vyčlenit nové diagnostické jednotky na základě nově detekovaných změn, které jsme dříve neznali. Takto se na základě nedávno diagnostikovaných fúzních genů vyčlenily, např. nové jednotky tzv. Ewing-like sarkomů, které již ve WHO tvoří samostatné jednotky, jako je sarkom s přestavbou genu CIC a sarkom s přestavbou genu BCOR. Podobné je to např. i u nádorů CNS, kdy se nyní nově vyčleňuje nová jednotka neuroepiteliálních nádorů s přestavbou genu PATZ1 (tzv. NET-PATZ1).

A vystačí si molekulární patolog sám nebo potřebuje spolupráci bioinformatika?

Jednoznačně je lepší, když máte k dispozici šikovného bioinformatika. Řadu analýz je schopný udělat molekulární patolog sám za pomocí různých komerčních softwarů, ale určitě je ku prospěchu bioinformatik, který analýze dat velmi dobře rozumí a vnáší do toho nový úhel pohledu. Komerčních softwarů je navíc poměrně málo a většinou je není možné upravit pro vlastní potřebu, anebo zakomponovat nové bioinformatické moduly (u detekce fúzních genů, nově popsané algoritmy detekce fúze). Spolupráce s bioinformatikem tak přináší větší flexibilitu a rychlost při zavádění nových analýz a zpracování získaných dat. Bioinformatik také pomáhá tehdy, když je v NGS nějaký problém, a on z analýzy dat upozorní na to, kde mohla nastat chyba daleko podrobněji, než jak danou situaci popisuje komerční software. A nakonec se velmi často ukazuje, že ani my „molekulárníci“ neumíme dobře své požadavky bioinformatikům přednést a bioinformatik zas často nerozumí našim požadavkům a genetickému slangu. Ve velkých centrech se pak s výhodou využívá takových spojek, či zprostředkovatelů – analytiků, kteří znají základy programování, ale zároveň jsou vzdělaní v molekulární genetice.

A co děláš, když neděláš?

Sice si rodina často stěžuje, že si stále víc práce nosím domů a pracuji po večerech. Ale pokud se naskytne příležitost, tak se nejraději odreagovávám v přírodě. Naštěstí manžel i děti sdílí mou zálibu chodit po horách či jezdit na vodu. Velmi často nám parťáka dělá i náš pes, který je vděčný za každý výlet. Bydlíme na venkově, máme zahradu, kterou neustále zvelebuji, a při tom se krásně čistí hlava… Náš pes je navíc velmi společenský a projevuje upřímnou radost, že mě vidí, ať přijdu v jakoukoli dobu, a projevuje mi náklonost třeba tím, že mi rozkouše botu nebo konev na zalévání, a tím mě velmi rychle přivede na jiné než molekulární myšlenky…