Staphylococcus saprophyticus – jeho rezistence k vybraným antibiotikům a tvorba biofilmu u kmenů izolovaných z moče

Súhrn

V období 2005–2009 bylo vyšetřeno celkem 87 kmenů S. saprophyticus pocházejících z močí pacientů s diagnózou zánět močového měchýře – cystitis. U všech těchto kmenů byla sledována rezistence k vankomycinu, nitrofurantoinu, doxycyklinu, oxacilinu, amoxicilin/klavulanátu, cefoxitinu a sulfamethoxazol/trimethoprimu. Tvorba biofilmu byla detekována pomocí modifikované Christensenovy metody.

Nebyl nalezen žádný kmen rezistentní k vankomycinu, k nitrofurantoinu byly rezistentní 2 kmeny (2,3 %), k doxycyklinu 9 kmenů (10,3 %), k oxacilinu 20 kmenů (23,0 %), k amoxicilinu s klavulanátem a k cefoxitinu shodně 6 kmenů (6,9 %), ke sulfamethoxazol/trimethoprimu 1 kmen (1,1 %).

Z 20 375 kultivačně pozitivních močí testovaných v letech 2005-2009 v naší laboratoři byl S. saprophyticus prokázán jako původce 0,4 % zánětů močového měchýře. Většina kmenů (67) pocházela od žen (77,0 %), zejména mladšího věku. Biofilm tvořilo 16 z 87 kmenů (18,4 %).

Klíčová slova:
S. saprophyticus – močové infekce – biofilm – antibiotika.

Jako původci močových infekcí se uplatňují rozmanité bakterie. Často bývají z močí pacientů s močovou infekcí izolovány bakterie Escherichia coli (až 80 %), dále Proteus mirabilis, Enterococcus faecalis a Streptococcus agalactiae [16], méně často (1–10 %) [1] Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophyticus (dále jen S. saprophyticus), případně další stafylokoky. Role koagulázanegativních stafylokoků jako původců močových infekcí je sporná, zato kmeny S. saprophyticus bývají považovány za primární patogeny, jsou tedy schopné vyvolávat močovou infekci i u jedinců s normálním močovým traktem [1].

S. saprohyticus subs. saprophyticus je kataláza-pozitivní, plazmakoagulázanegativní, grampozitivní kok, rezistentní k novobiocinu. Byl objeven v roce 1951 [20], nachází se na kůži lidí i primátů a vyznačuje se afinitou k buňkám epitelu urogenitálního traktu [18]. Nejčastěji bývá izolován z moči mladých, sexuálně aktivních žen, ale bývá nalézán taktéž u mužů. Způsobuje nespecifické záněty močové trubice u mladých žen, cystitidy, pyelonefritidy, urosepse, u mužů také zánět prostaty [9, 12, 15, 17, 18]. V uplatnění na sliznicích mu pomáhá ureáza, která poškozuje tkáň močového měchýře a povrchově asociovaný fibrilární protein, který má roli mezibuněčného adhezinu [8].

V literatuře je popsána rezistence S. saprophyticus k různým antibiotikům, často souvisí s původem vyšetřovaného materiálu [10, 11]. Nejčastěji je popisována rezistence k oxacilinu. Tato rezistence může souviset jednak s hyperprodukcí beta-laktamáz (v tomto případě jsou kmeny citlivé k inhibitorům beta-laktamáz, jako je např. klavulanát aj.) jednak s přítomností genu mecA [10, 11]. Ten byl pravděpodobně získán přenosem od methicilin-rezisteních kmenů Staphylococcus aureus (MRSA) či methicilin-rezistentních kmenů Staphylococcus epidermidis (MRSE). Přítomnost mecA genu poměrně dobře koreluje s rezistencí bakterií k cefoxitinu, proto je doporučeno používat k detekci methicilin-rezistentních kmenů S. saprophyticus disk s cefoxitinem [10].

S. saprophyticus je stejně jako jiné stafylokoky schopen tvořit biofilm. Biofilm je obvykle tvořen bakteriemi usazenými na pevném povrchu, které produkují polysacharidovou hmotu zvanou matrix, v níž drží buňky pohromadě [22, 24]. V biofilmu jsou bakterie chráněny před účinkem antibiotik [4, 13, 22, 24] a jsou tak obtížně eradikovatelné [22].

Cílem práce bylo zjistit rezistenci močových kmenů S. saprophyticus z naší spádové oblasti k různým antibiotikům, schopnost získaných kmenů tvořit biofilm, závislost jejich výskytu na pohlaví.

Materiál a metody

V období 1/2005 do 12/2009 bylo v naší laboratoři otestováno celkem 86 kmenů S. saprophyticus. Tyto kmeny pocházely z močí pacientů s diagnózou zánět močového měchýře-cystitis a nacházely se v moči v signifikantním množství, tj. více než 10⁵ CFU/ml. Moč byla získána spontánním vymočením a pocházela ze středního proudu pacientů, kteří prošli urologickou ambulancí Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně a podle urologického vyšetření splnili klinická kritéria pro danou diagnózu. Celkem bylo v naší laboratoři v daném časovém období otestováno 20 375 kultivačně pozitivních močí pocházejících od ambulantních pacientů Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně s diagnózou zánět močového měchýře a se signifikantní bakteriurií (tj. více než 10⁵ CFU/ml), 87 kmenů S. saprophyticus tedy tvořilo 0,4 % z těchto kultivačně pozitivních močí.

Byla sledována jejich rezistence k vankomycinu, nitrofurantoinu, doxycyklinu, oxacilinu, amoxicilinu s klavulanátem, cefoxitinu a sulfamethoxazol/trimethoprimu. Každý kmen byl vyšetřen jen jednou. Kmeny byly pěstovány na běžných kultivačních půdách, S. saprophyticus byl určen pomocí Staphytestu 24 (Lachema, Česká republika) a rezistence k novobiocinu (Oxoid).

Určení citlivosti kmenů k antibiotikům bylo provedeno pomocí diskového difuzního testu. Bylo připraveno inokulum vyšetřovaného kmene o koncentraci 0,5 podle McFarlanda. Pomocí sterilního vatového tampónu bylo inokulum naočkováno na celý povrch Mueller-Hintonové agaru (MH). Na takto připravený agar byly kladeny antibiotické disky firmy Oxoid. Plotny byly umístěny do termostatu a inkubovány při 37 °C přes noc [23].

Po inkubaci byl posuvným měřítkem změřen průměr inhibičních zón. Průměr zóny inhibice byl porovnán s referenčními (hraničními) hodnotami pro citlivé kmeny. Vytvořil-li vyšetřovaný kmen inhibiční zónu o stejném nebo větším průměru, než je hraniční hodnota, byl interpretován jako citlivý k danému antibiotiku. Vytvořil-li vyšetřovaný kmen zónu o menším průměru, byl interpretován jako rezistentní k danému antibiotiku [23].

Tvorba biofilmu byla u všech 87 kmenů zjišťována modifikovanou Christensenovou metodou v malých 3ml polystyrenových zkumavkách (Dispolab, Česká republika) tak jako v Černohorská a Votava (2004). Byla použita 24hodinová kultivace vzorků v 1,5 ml tryptózosójového bujónu při 37 °C. Po trojím promytí vodou byly pomocí 0,71% krystalové violeti prokazovány buňky adherované ke stěně zkumavky. Jako biofilmpozitivní byly označeny ty kmeny, které po obarvení tvořily na stěnách zkumavky souvislou obarvenou vrstvu [2, 3].

Dále byla zjišťována závislost nálezů na pohlaví a věku pacientů.

Výsledky

Celkem bylo vyšetřeno celkem 87 kmenů S. saprophyticus. Nebyl nalezen žádný kmen rezistentní k vankomycinu, k nitrofurantoinu byly rezistentní 2 kmeny (2,3 %), k doxycyklinu 9 kmenů (10,3 %), k oxacilinu 20 kmenů (23,0 %), k amoxicilinu s klavulanátem a k cefoxitinu shodně 6 kmenů (6,9 %), k sulfamethoxazol/trimethoprimu 1 kmen (1,1 %) (graf 1).

Z 87 kmenů S. saprophyticus pocházelo 20 kmenů od mužů a 67 od žen, nejčastěji se S. saprophyticus vyskytoval ve věkové skupině 21–25 let a 16–20 let (graf 2).

Biofilm tvořilo celkem 16 z 87 kmenů S. saprophyticus (18,4 %).

Diskuse

S. saprophyticus izolovaný od pacientů s diagnózou zánětu močového měchýře tvořil 0,4 % námi sledovaných kultivačně pozitivních močí, naproti tomu v literatuře [1, 19] je uváděn jako původce 5–20 % močových infekcí. Bohužel se v posledních letech neobjevila podrobná studie mapující stav v České republice. V zahraničí se současné studie týkající se S. saprophyticus zaměřují spíše na specifické kategorie, jako jsou mladé ženy [17], či pouze na muže [12], tato data tedy nelze dost dobře porovnat.

Rezistence S. saprophyticus k vybraným antibiotikům zůstává i nadále poměrně nízká, nejvýraznější je u oxacilinu (20 kmenů, 23,0 %), což může souviset s hyperprodukcí beta-laktamáz, či přítomností mecA genu [11]. Z těchto 20 kmenů bylo 6 kmenů zároveň rezistentních k cefoxitinu i k amoxicilinu s klavulanátem, dá se tedy usuzovat, že se jednalo o 6 methicilin-rezistentních kmenů a 14 kmenů s hyperprodukcí beta-laktamázy.

K terapii stafylokokových infekcí lze podle našeho sledování i nadále použít většinu doporučovaných antibiotik jako jsou sulfamethoxazol/trimethoprim, cefalosporiny I. generace, tetracyklin; v případě citlivosti daného kmene je možná i terapie oxacilinem či amoxicilinem s klavulanátem, v indikovaných případech pak vankomycinem [14, 19].

S. saprophyticus tvořil biofilm v 18,4 %. Ve srovnání s jinou studií [5], zaměřenou na koagulázanegativní stafylokoky u hospitalizovaných pacientů (30 % pozitivních izolátů), byla tvorba biofilmu nižší. Protože v obou studiích byla použita stejná detekční metoda, lze předpokládat, že kmeny pocházející od ambulantních pacientů tvoří biofilm méně často než kmeny od hospitalizovaných pacientů, což již bylo zjištěno u pseudomonád [6].

Ze získaných výsledků vyplývá, že S. saprophyticus je mnohonásobně častěji přítomen u mladých žen ve věku 16–25 let, což zmiňují rozmanité literární údaje [9, 15, 17]. Příčina tohoto jevu není doposud spolehlivě vysvětlena [9] – souvisí snad s užíváním spermicidních prostředků [7], s kolonizací střeva či pochvy a promiskuitou [21].

Závěr

S. saprophyticus je sice méně častým původcem močových infekcí, není ani výrazným producentem biofilmu, a dokonce ani rezistence k antibiotikům u něj není výrazná, jako je tomu například u pseudomonád, zato je patogenem primárním, který postihuje zejména mladší osoby, a neměl by proto být podceňován.

MUDr. Lenka Černohorská, Ph.D.
Mikrobiologický ústav LF MU a FN u sv. Anny v Brně
Pekařská 53
656 91 Brno
e-mail: lenka.cernohorska@fnusa.cz