West Nile virus (linie 2) poprvé detekován v komárech v jižních Čechách: nová endemická oblast?

Súhrn

V roce 2018 jsme poprvé detekovali neuroinvazivní linii 2 viru West Nile (WNV-2) v komárech v oblasti třeboňských rybníků v jižních Čechách. Celkem bylo vyšetřeno 6 790 samic druhů Culex modestus, Culex pipiens a Coquillettidia richiardii ve 136 směsích a RNA viru West Nile byla detekována ve dvou směsích. Zachycený virus je geneticky shodný s kmeny WNV-2, které v současnosti cirkulují na jižní Moravě, a rovněž s kmeny tohoto viru způsobujícími epidemie ve střední a jižní Evropě. Výsledky naznačují nezbytnost entomologické surveillance patogenních arbovirů i v lokalitách, kde dosud nebyl WNV prokázán. Jihočeský region se tak po jižní Moravě stává další oblastí s rizikem autochtonního výskytu onemocnění západonilskou horečkou.

Klíčová slova:

West Nile virus – arboviry – emergentní zoonózy – komáři – jižní Čechy – Culex modestus – Culex pipiens – Coquillettidia richiardii

ÚVOD

West Nile virus (WNV; Flavivirus, Flaviviridae) je původně africký arbovirus, dnes již s kosmopolitním rozšířením, který v přírodě cirkuluje mezi ptáky (hostiteli-amplifikátory) a ornitofilními komáry, v Evropě především druhy Culex pipiens a Cx. modestus. Koně a lidé jsou tzv. konečnými (‚dead-end‘) hostiteli viru a WNV je u nich původcem tzv. západonilské horečky. Infekce tímto virem probíhá v 80 % případů asymptomaticky, asi ve 20 % případů je však charakterizována horečnatým onemocněním doprovázeným bolestmi hlavy, svalů, kloubů, nauzeou, faryngitidou, lymfadenitidou a někdy vyrážkou (10 % případů), a v 1–2 % případů se může vyvinout dokonce neuroinvazivní onemocnění provázené meningitidou, encefalitidou nebo paralýzami [1].

Od roku 2004 jsme svědky šíření nebezpečné neuroinvazivní linie 2 (WNV-2) včetně epidemického výskytu především v jižní a střední Evropě: Maďarsko (poprvé dokumentováno v roce 2004), Rakousko (2008), Řecko (2010), Rumunsko (2010), Itálie (2011) nebo Srbsko (2012) [2]. V České republice byl WNV poprvé izolován, respektive jeho méně virulentní linie 3 (WNV-3; Rabensburg), po povodních v roce 1997 z komárů Cx. pipiens na Břeclavsku a současně zde bylo zaznamenáno několik autochtonních infekcí západonilské horečky u lidí, pravděpodobně způsobené linií 1 (WNV-1), která v tomto období cirkulovala v Evropě [3, 4]. Při několika rozsáhlých sérologických přehledech byly detekovány specifické WNV protilátky u divokého ptactva [5], ale také u koní [6] nebo divoké zvěře [7]. Přelomovým nálezem byl záchyt WNV-2 v roce 2013 u komárů Cx. modestus na rybnících Lednicko-valtického areálu [8] a také následný záchyt WNV u komárů Cx. pipiens, který z hlediska přenosu představuje vyšší riziko převážně v urbánním biotopu včetně rizika přezimování viru v dospělých samicích [9, 10]. V září a říjnu 2018 byly zaznamenány první autochtonní lidské případy západonilské horečky v jihomoravském regionu a Česká republika se tak plně přiřazuje k zemím s endemickým výskytem tohoto dříve exotického onemocnění (tzv. ‚affected area‘) [11].

Protože jihočeský a jihomoravský region jsou si do jisté míry podobné svými geograficko-klimatickými podmínkami včetně nadměrného výskytu komárů, bylo cílem naší studie provést monitorování jako v předchozích letech v oblasti Lednicko-valtického areálu také v oblasti třeboňských rybníků a posoudit tak možné riziko přenosu WNV i v tomto regionu České republiky.

MATERIÁL A METODY

Studijní plochy

Komáři byli v roce 2018 odchytáváni v rákosinném biotopu rybníků Velký Tisý-západ [49.0672747N, 14.7057347E], Velký Tisý-východ [49.0630008N, 14.7248750E], Služebný [49.0746814N, 14.7116142E], Velký Dubovec [49.0673675N, 14.7212733E], Malý Tisý [49.0509867N, 14.7465914E], Koclířov [49.0673728N, 14.6922919E], Černičný [49.0763772N, 14.7502850E], Šaloun [49.0691664N, 14.7100839E], Velký Panenský [49.0686256N, 14.7312278E] (obr. 1). Oblast je významnou národní přírodní rezervací (NPR) Velký a Malý Tisý ležící na západním okraji CHKO Třeboňsko. NPR zahrnuje soustavu 11 rybníků ležících v nadmořské výšce 422–431 m s rozsáhlými litorálními porosty. Převažuje rákos (Phragmites australis) a hojné jsou i porosty orobinců (Typha spp.). Průměrná červencová teplota oblasti je 18 °C, což je více, než by odpovídalo uvedené nadmořské výšce. Jde o významnou ptačí rezervaci, která slouží jako hnízdiště mnoha druhů ptáků i shromaždiště migrujících druhů.

Sběr a determinace komárů

Komáři byli odchyceni pomocí speciálních EVS pastí (Bioquip, San Domingo, USA) doplněných suchým ledem jako atraktantem. Pasti byly exponovány zpravidla ve čtrnáctidenních (ke konci sezony v týdenních) intervalech od 12. června do 24. září 2018 a v našem screeningu zaměřeny především na rákosinný druh Cx. modestus, který je v evropských podmínkách ideálním vektorem WNV – saje na ptácích i lidech [8]. Dále byli vyšetřeni komáři druhů Culex pipiens (včetně Cx. torrentium – samice totiž nelze spolehlivě morfologicky rozlišit) a Coquillettidia richiardii, kteří se v rákosí hojně vyskytují společně s Cx. modestus. Pasti byly zavěšeny na 2metrových dřevěných trojnožkách ve výšce 50–70 cm nad hladinou vody. Samice sající krev jsou v rákosinách aktivní i ve dne [12], proto byly pasti do porostu rákosí pokládány v průběhu celého dne. Zachycené samice komárů byly odebírány po 4 hodinách při expozici pasti ve dne (od 8.00 do 20.00) a po 12 hodinách při expozici v noci (20.00–8.00). Odchycení komáři byli na místě zchlazeni a transportováni do laboratoře, kde byli uchováni v hlubokomrazicím boxu (-60 °C) do dalšího zpracování. Poté byli na chladicím stolku pomocí stereomikroskopu identifikováni do druhů [13], roztříděni do směsí obsahujících 1–50 jedinců (odpovídající datu, lokalitě a druhu komára), homogenizováni v PBS (pH 7,4) obohaceným o 0,4 % hovězího sérového albuminu a centrifugováni při 4 °C. Supernatant byl uchován při -60 °C a využit pro následné molekulární analýzy.

Extrakce virové RNA a molekulární identifikace WNV

Extrakce virové RNA byla provedena pomocí QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) podle přiloženého manuálu. Konvenční PCR byla provedena s využitím One-step RT-PCR kitu (Qiagen, Hilden, Německo) a se specifickými primery zacílenými do oblasti genu pro obalový protein WNV. Pozitivní vzorky byly sekvenovány podle Sangera a sekvence poté upraveny a vyhodnoceny pomocí bioinformatického softwaru Lasergene 15 (DNASTAR, Madison, USA) a srovnávacího nástroje BLAST v rámci databázové platformy NCBI [8]

VÝSLEDKY A DISKUSE

V roce 2018 bylo odchyceno celkem 29 207 samic komárů. Celkem bylo molekulárně vyšetřeno 6 790 komárů (celkem 136 směsí) druhů Cx. modestus (5 816 kusů), Cx. pipiens (781 kusů) a Cq. richiardii (193 kusů) odchycených v období od 26. 6. 2018 do 24. 9. 2018 (tab. 1). Celkem dvě směsi (č. R-33; lokalita: ‚Velký Tisý-východ‘; sběr: 12. 9. 2018; 50 samic Cx. modestus ve směsi a č. R-119; lokalita: ‚Šaloun‘; sběr: 26. 7. 2018; 33 samic Cq. richiardii ve směsi) obsahovaly RNA WNV-2. Minimální prevalence WNV tedy byla 0,03 % v celém sběru ze všech lokalit. Sekvenací bylo potvrzeno, že se jedná o WNV-2 kmen totožný (shoda 100% v úseku o délce 306 bp) s kmeny cirkulujícími v jihomoravském regionu i s kmeny, které v současnosti způsobují epidemický výskyt WNV ve střední či jižní Evropě. Podle informace NRL pro arboviry nebyla v dané sezoně potvrzena humánní nákaza WNV v jižních Čechách (osobní sdělení).

Západonilská horečka je dnes z pohledu veřejného zdraví nejdůležitějším komáry přenášeným onemocněním v Evropě. V roce 2018 byl Evropským centrem pro prevenci a kontrolu nemocí (ECDC) zaznamenán dosud nejvyšší počet případů západonilské horečky v Evropě, bylo hlášeno celkem 1 503 případů z 11 zemí EU: Itálie (576 případů), Řecko (311), Rumunsko (277), Maďarsko (215), Chorvatsko (53), Francie (27), Rakousko (20), Bulharsko (15), Česká republika (5), Slovinsko (3) a Kypr (1). Celková suma autochtonních infekcí v roce 2018 je vyšší než součet počtu infekcí zaznamenaných za posledních 7 let a statisticky jde až o 7násobný nárůst v počtu klinických případů ve srovnání s předchozí sezonou [11]. Navíc byly poprvé popsány klinické případy západonilské horečky způsobené WNV-2 linií u lidí na území ČR včetně hlášení jednoho úmrtí. Všechny autochtonní infekce u nás měly svůj původ v jihomoravském regionu.

Je třeba akceptovat fakt, že komáři v České republice nepředstavují pouze tzv. obtížný hmyz, který v období kalamitních stavů působí nadměrné napadání obyvatelstva a zvěře, ale i to, že kromě viru Ťahyňa způsobujícího valtickou horečku mohou přenášet vysoce virulentní linii WNV, proti které není v současnosti dostupné očkování ani cílená antivirová léčba. Současně je nezbytné upozorňovat infektology a praktické lékaře v oblastech možného výskytu WNV, aby při diferenciální diagnostice nejasných letních horečnatých stavů a meningitid brali v úvahu i možnou nákazu tímto pro nás dosud exotickým virem [14]. Například někteří praktičtí lékaři při diferenciální diagnostice vektory přenášených nákaz dosud opomíjejí možné poštípání komárem v souvislosti s možným přenosem WNV infekce.

Po hlášení prvních lidských případů WNV infekce v loňském roce byla hlavní hygieničkou ustavena pracovní skupina složená z epidemiologů, infektologů, entomologů, veterinářů i virologů, kteří mají za úkol definovat rizikové oblasti výskytu WNV, monitorovat aktuální stav i možný vývoj šíření WNV v České republice a také připravit metodické podklady pro infektology usnadňující diferenciální diagnostiku onemocnění. Navíc se podařilo iniciovat spolupráci mezi Jihomoravským krajem, Hygienickou stanicí Jihomoravského kraje a Akademií věd, která má za úkol podílet se na odhadu rizik (tzv. risk assessment) a plánování připravenosti (WNV preparedness), zahrnující především opatření směřující k surveillanci, prevenci a kontrole onemocnění přenášených komáry v souladu s kritérii ECDC [15]. Klíčovým prvkem v surveillanci WNV je také připravenost v oblasti bezpečnosti a kontroly nakládání s krví a krevními deriváty [16].

V naší studii jsme potvrdili výskyt WNV v komárech v oblasti jižních Čech, a tím i zvýšené riziko nákazy západonilskou horečkou v nadcházejících sezonách. Studie nabádá k prohloubení entomologické surveillance WNV i v dalších oblastech s nadměrným výskytem komárů v letních měsících (např. Polabí, Litovelské Pomoraví apod.) a také v oblastech velkých vodních rezervoárů, kde může docházet ke zvýšenému kontaktu komárů (přenašečů viru) a divokých vodních ptáků, rezervoárů WNV.

Poděkování

Práce byla finančně podpořena interním grantem Státního zdravotního ústavu (RVO-SZÚ/2018) a také projektem Agentury pro zdravotnický výzkum (reg. číslo projektu NV19-09-00036). Autoři by rádi poděkovali RNDr. Oldřichu Šebestovi za přípravu mapy znázorňující lokality sběru komárů.

Do redakce došlo dne 1. 3. 2019.

Adresa pro korespondenci:

doc. RNDr. Ivo Rudolf, Ph.D.

Ústav biologie obratlovců AV ČR, v.v.i.

Klášterní 212

691 42 Valtice

e-mail: rudolf@ivb.cz