Extracelulární vezikuly v infekčním lékařství – význam a perspektivy

Súhrn

Extracelulární vezikuly (EV) jsou transportní váčky derivované ze zdrojové buňky do extracelulárního prostředí. Představují nový pilíř mezibuněčné komunikace, neboť přenáší nukleové kyseliny, proteiny a různé signální molekuly, které jsou chráněny před degradací v extracelulárním prostředí a posléze jsou uvolněny fúzí vezikuly s cílovou buňkou. Transportní mechanismus je zajištěn povrchovými strukturami účastnícími se buněčné adheze. Je všeobecně známé, že všechny buněčné organismy jsou schopné tvořit EV. Většina lidských buněk je schopna produkovat EV, díky tomu je možná jejich detekce ve všech tělesných kompartmentech. EV při svém objevu byly vnímány jako nepotřebné odpadní váčky a stály na okraji zájmů. Zásluhou nově popsaným mechanismům transportu biologicky aktivních molekul je známo, že se EV účastní celé řady homeostatických mechanismů. V infekčním lékařství je nejvíce studována oblast modulace imunitní odpovědi, kdy jsou vnímány jako potenciální biomarkery, neboť jejich produkce či nesený obsah může být alterován za patologických stavů. U mikrobů stojí v popředí interakce na úrovni patogen-patogen a patogen-hostitel. Další možností je potenciální využití EV jako transportních lékových systémů a nových cílů farmakoterapie.

Klíčová slova:

biomarker – extracelulární vezikuly – infekční lékařství – patogen

ÚVOD DO NOMENKLATURY A KLASIFIKACE VEZIKUL

Extracelulární vezikuly (EV) představují heterogenní skupinu sekrečních vezikul tvořených lipidovou dvouvrstvou, které nejsou schopny replikace a neobsahují buněčné jádro. Vzhledem k progresivně probíhajícímu výzkumu dosud není v literatuře ustálena jejich jednotná klasifikace [1]. Nejstarší a stále používané dělení respektující biogenezi vezikul zahrnuje exozomy, ektozomy, apoptoická tělíska a jiné vezikuly [2]. Jejich vznik je ilustrován na obrázku 1.

Exozomy představují nejmenší subtyp EV (velikost 30–100 nm). Vzhledem ke své velikosti tyto váčky mohou snáze prostupovat mezi buňkami tvořící přirozené bariéry, a uvolňovat se tak do systémové cirkulace, což je důvod největšího zájmu probíhajících studií. Vznikají endocytózou cytoplazmatické membrány za vzniku časného endozomu, ten prochází vnitřním pučením membrány generující pozdní endozom, který obsahuje intraluminální váčky (budoucí exozomy). Fúzí pozdního endozomu s cytoplazmatickou membránou se uvolňují do extracelulárního prostředí exozomy [3, 4]. Dosud není vyřešena otázka selektivního zabudování obsahu a tvorby membrány vezikul, neboť se dramaticky odlišují od cytosolu a cytoplazmatické membrány zdrojové buňky [5]. V roce 2007 bylo prokázáno, že exozomy mohou obsahovat kódující mRNA, ale i signální mikroRNA, aktivní v recipientní buňce. Tato skutečnost posunula vnímání EV z okrajového tématu do centra zájmů [2, 6].

Ektozomy se označují také jako mikrovezikuly či mikropartikule. Jsou zpravidla větší než exozomy (100 až 1000 nm). Vznikají přímým pučením cytoplazmatické membrány do extracelulárního prostoru. Jejich povrchové znaky do značné míry závisí na složení původní cytoplazmatické membrány buňky, ze které pochází [3, 5, 7]. Při biogenezi ektozomů také dochází k selektivnímu začlenění neseného nákladu [5].

Apoptoická tělíska jsou největší subfrakcí EV (100 až 5000 nm). Vznikají při apoptóze fragmentací buňky a to je důvodem jejich výrazné variability velikosti i obsahu [8]. Předpokládaným hlavním cílem tvorby apoptoických tělísek je buněčná clearance pomocí fagocytujících buněk za absence zánětlivé reakce. Podle novějších prací jsou však navíc zapojeny do mezibuněčné komunikace zejména regulací imunitní odpovědi ve smyslu aktivace nebo suprese [9]. Pro úplnost je vhodné zmínit, že apoptoické buňky dokonce tvoří více EV než buňky zdravé a jsou schopny tvořit ostatní typy EV (ektozomy i exozomy – označované souhrnně apoEV), což reflektuje jejich roli v mezibuněčné komunikaci [10].

Mimo základní tři typy EV jsou mnohými autory dále vyčleňovány vezikuly odkazující na jejich buněčnou funkci, izolační techniky nebo velikost. Jedná se například o onkozomy, nanovezikuly, migrazomy a jiné.

Jejich definice si často napříč různými pracemi protiřečí, mnohdy se liší i základní údaj o jejich velikosti [1, 11]. Úskalí této klasifikace tkví v různorodém buněčném původu vezikul, heterogenitě transportovaného obsahu i povrchových struktur, absenci univerzálního povrchového znaku pro detekci a rozlišení jednotlivých druhů EV a jejich odlišení od podobných částic (lipoproteiny, exomery). Problematické je také to, že stejná buňka může produkovat několik druhů vezikul [11]. Východiskem z této problematiky měla být nová klasifikace vydaná International Society for Extracellular Vesicles v roce 2018 [1]. Je v ní doporučeno používat obecný termín extracelulární vezikula a zdržet se historických termínů odkazujících na biogenezi. Jednoznačně je preferované členění podle měřitelných veličin (velikost, denzita, biochemické složení neseného obsahu, povrchové znaky a buněčný původ). Například dělení dle velikosti na velké, střední a malé EV (Small Extracellular Vesicles, SEV), do kterých jsou řazeny exozomy a malé ektozomy. Tato nová klasifikace vyvrací historické představy o jedinečné biogenezi vezikul a možnou zaměnitelnost při měření v překryvných velikostech EV. Nová klasifikace však není všeobecně přijímána, což činí danou problematiku nesmírně nepřehlednou [12].

Funkce a obsah vezikul

Funkce EV je do značné míry odrazem buněčného původu jednotlivých vezikul, který určuje nesený obsah i povrchové znaky. Tyto charakteristické vlastnosti vezikul se mohou měnit mimo jiné při infekci, buněčném stresu vyvolaném signálními molekulami či jiným patologickým stavem [13]. Membrána EV je složením odlišná od zdrojové buňky (má mimo jiné vyšší obsah lipidů) a na svém povrchu nese adhezní molekuly (např. integriny, selektiny) a specifické proteiny dle zdrojové buňky, které fungují jako receptory, koreceptory nebo ligandy (např. hlavní histokompatibilní komplex 1 a 2, receptor T buněk). Výsledná konformace membrány určuje, zda dochází k aktivaci signální dráhy interakcí ligand-receptor na povrchu cílové buňky nebo k internalizaci vezikuly s uvolněním obsahu do cytosolu – obrázek 1 [3, 4, 6]. V některých pracích bylo popsáno také splynutí vezikuly s lysozomem s následnou degradací obsahu. Dosud není prokázán určující mechanismus rozhodující o degradaci či uvolnění obsahu do cytosolu [14]. Vezikulární lumen může obsahovat zejména nukleové kyseliny (DNA, mRNA, mikroRNA a ostatní nekódující RNA) [6], proteiny, lipidy a komplexnější biomolekuly – enzymy a cytokiny [3, 14, 15]. Tímto způsobem přenesené biomolekuly mohou v recipientní buňce aktivovat nebo inhibovat řadu signálních drah, či dokonce částečně změnit buněčný fenotyp [13, 16]. EV tak mohou zprostředkovat autokrinní, parakrinní, endokrinní i juxtakrinní mezibuněčnou komunikaci [23].

Regulace imunitní odpovědi

V rámci imunitního systému je popsána role EV na mnoha úrovních. Dobře je prozkoumán přenos cytokinů, které jsou EV schopny nést buď na svém povrchu (např. TNFα,TGFβ), nebo jako vnitřní náklad chráněný před degradací v extracelulárním prostředí [14]. Dále mohou transportovat lipidové mediátory odvozené od kyseliny arachidonové a enzymy zapojené do jejich tvorby, a tím přispívat k modulaci zánětlivé reakce [16, 17]. Takto je zajištěna dostatečná koncentrace imunomodulačních faktorů bez ohledu na vzdálenost, což je podkladem charakteristické kooperace buněk imunitního systému označované jako orchestrace [18, 19].

Na úrovni vrozené imunity jsou EV významné jako spouštěč zánětlivé reakce pomocí přenosu signálů exogenního poškození (Pathogen Associated Molecular Patterns, PAMPs) a signálů endogenního poškození (Damage Associated Molecular Patterns, DAMPs). Zdroje PAMPs jsou patogeny přímo produkující EV (bakterie, protozoa) nebo infikované buňky inkorporující do EV cizorodé struktury [20, 21]. Tvorba DAMPs je spojena zejména s oxidačním stresem, mitochondriální toxicitou nebo se zánikem buněk [22]. V obou případech dochází k aktivaci buněk nespecifické imunity. V rámci adaptivní imunity je důležité postavení vezikul v aktivaci T lymfocytů pomocí antigen prezentujících buněk [23]. Bylo prokázáno, že EV pocházející z dendritických buněk mohou nést hlavní histokompatibilní komplex i kostimulační molekuly a také ovlivňují funkční polarizaci T buněk [23, 24, 25]. Konkrétní imunoregulační funkce EV jsou odvozeny od nesených molekul. Byly popsány EV nesoucí ligand indukující apoptózu FasL (FAS Ligand) a dále PDL1 (Programmed Cell Death Ligand 1) a CTLA4 (Cytotoxic T-lymphocyte Associated Antigen 4), které slouží k regulaci imunitní reakce [26, 27].

EV hrají významnou úlohu v regulaci imunitního systému, která probíhá na mnoha úrovních a doplňuje výraznou komplexnost dosud známých imunoregulačních mechanismů. Svým působením potvrzují další charakteristiku imunitního systému, kterou je redundance. EV mohou působit prozánětlivě i protizánětlivě, a tím vytváří dynamickou rovnováhu nutnou k zachování homeostázy [23, 28, 29]. Vychýlení této rovnováhy je podkladem mnoha patologických stavů, např. autoimunitních [30], nádorových [31] a kardiovaskulárních onemocnění [29].

EV a infekční agens

Cílem následujícího textu není přinést úplný seznam patogenů a jejich popsaného vztahu k EV, ale spíše obecné principy, které povedou k pochopení komplexity dané problematiky. V jedné rovině je možné pozorovat interakci přirozeného systému extracelulárních vezikul hostitele a samotného patogenu, kdy působí protektivní funkcí ve smyslu aktivace imunitní odpovědi. Naopak ale mohu sloužit také při diseminaci infekce z pozice transportních váčků mezi buňkami. V další rovině jsou buněčné patogeny schopné rovněž produkovat své EV, které mohou narušovat funkci imunitního systému a mimo jiné sloužit jako transportéry faktorů virulence [21, 28]. Interakci mikrobiálních a endogenních EV ilustruje obrázek 2.

Viry

Viry dokáží využít hostitelského transportního systému EV několika mechanismy. Viriony mohou být inkorporovány do EV hostitelské buňky a posléze transportovány do jiných buněk. Tento mechanismus je popsán zejména u malých EV (SEV), neboť syntéza virové kapsidy a exozomů sdílí stejné buněčné mechanismy [32]. Tato „infikovaná“ vezikula chrání viriony před rozpoznáním imunitním systémem a podílí se na šíření viru do dalších cílových buněk. Jde o hypotézu trojského koně, formulovanou již roku 2003, která predikovala tento mechanismus u retrovirů [33]. Dosud byl popsán například u viru hepatitidy C [34], viru hepatitidy A [35], viru hepatitidy E [36], viru herpes simplex [37] a lidského viru imunodeficience (Human Immunodeficiency Virus, HIV) [38]. EV mohou nést také nekompletní virové struktury. Tento mechanismus je nejlépe prozkoumán u HIV. Recentně byly popsány EV vznikající z buněk infikovaných HIV, které nesou na svém povrchu virový glykoprotein gp120 [39] a dále vezikuly s obsahem TAR RNA (Trans-Activation Response element) nebo genů gag a nef. Tyto vezikuly pak mohou být derivovány z rezervoárů infekce přes přirozené bariéry a aktivovat imunitní buňky. Tímto mechanismem je z části vysvětlen fenomén chronické imunitní aktivace navzdory nedetekovatelné RNA HIV v plazmě u lidí žijících s HIV [40]. Na druhou stranu EV mohou v okolních buňkách blokovat virovou replikaci spuštěním mechanismů přirozené protivirové imunitní reakce tvorbou interferonů [41] či tvorbu endogenního oxidu dusnatého [42]. Dalším mechanismem je tvorba EV nesoucích vazebné receptory, na které se váží viry. Představují tak analogii neutralizačních protilátek. U HIV byl popsán mechanismus tvorby vezikul z CD4+ buněk, které mohou obalovat viriony HIV interakcí s gp120, a tím blokovat vazbu viru s cílovou buňkou [43]. Obdobný mechanismus byl popsán u pacientů s infekcí virem SARS-CoV-2, u kterých byly detekovány zvýšené hodnoty EV nesoucích angiotensin konvertující enzym typu 2 [44].

Bakterie

Většina bakterií je schopna produkovat EV, které se někdy souhrnně označují jako bakteriální extracelulární vezikuly (BEV). Jde o heterogenní skupinu EV lišící se strukturou i obsahem v závislosti na bakteriálním druhu, biogenezi a stresových faktorech prostředí (např. expozice antibiotikům). BEV mají rozměry v průměru od 40 do 400 nm. Podobně jako u eukaryotních EV, byly BEV prvotně vnímány jako nepotřebné buněčné remnanty. Intenzivní výzkum a průkaz transferu biomolekul poukázal na zásadní roli v buněčné funkci a interakci na mnoha úrovních (bakterie-bakterie, bakterie-hostitel) [45]. U gramnegativních bakterií jsou BEV generovány procesem vezikulace (pučením) zevní membrány a buněčnou lýzou. Pučením zevní membrány vznikají vezikuly zevní membrány (Outer Membrane Vesicles, OMV), které jsou znázorněny na obrázku 2. Vnitřní (cytoplazmatická) membrána zůstává intaktní, vezikulu tak tvoří obsah periplazmatického prostoru a struktury zevní membrány. Mnoho studií v nich prokázalo nukleové kyseliny, cytosolové proteiny a také schopnost transportovat faktory virulence a rezistence k antibiotikům. Selektivita neseného obsahu dokazuje, že jde o dosud neznámým způsobem řízený proces. Druhým mechanismem u gramnegativních bakterií je explozivní buněčná lýza, při které dochází k endolysinem indukovanému štěpení peptidoglykanu buněčné stěny. Tímto mechanismem vznikají OIMV (Outer-Inner Membrane Vesicles) a EOMV (Explosive Outer Membrane Vesicles). Vzhledem k charakteristické biogenezi se předpokládá náhodné začlenění bakteriálních struktur včetně cytoplazmatických a membránových složek [46]. Dle některých prací však OIMV mohou vznikat činností autolysinů při absenci buněčné lýzy [47]. Také grampozitivní bakterie jsou schopné produkovat BEV. Díky absenci zevní membrány se označují jako cytoplazmatické membránové vezikuly (Cytoplasmic Membrane Vesicles, CMV). CMV vznikají procesem buněčné lýzy i vezikulací [48].

BEV slouží jako transportéry signálních molekul a také živin, čímž se podílí na tvorbě a stabilizaci biofilmu. Jejich funkce je odrazem neseného obsahu. Mohou obsahovat chromozomální i plazmidovou DNA, a podílet se tak na horizontálním přenosu genů (např. genů podmiňujících faktory virulence nebo antimikrobiální rezistence) [47, 49]. V bakteriální populaci mohou BEV přenášet také enzymy inaktivující antibiotika. Vzhledem k podobnosti BEV s bakteriální stěnou dochází k vychytávání molekuly antibiotika v extracelulárním prostoru, čímž snižují jeho efektivní koncentraci [50]. BEV mohou interagovat nejenom s bakteriemi jiného druhu, ale překvapivě i s eukaryotními buňkami. Zde je nejpodstatnější přenos faktorů virulence, který je prokázán u celé řady patogenů (např. Escherichia coli, Shigella spp., Pseudomonas spp.). Takto membránou obalené faktory virulence jsou chráněné před účinky degradačních enzymů a protilátek a mohou být neporušené internalizovány hostitelskou buňkou [49]. Další interakce BEV a eukaryotní buňky je podmíněna aktivací přirozené imunity rozpoznáním PAMPs na povrchu vezikul [23, 49]. V současnosti je přikládána velká pozornost detekci vysokých hodnot BEV v systémové cirkulaci člověka u onemocnění asociovaných s poruchou střevní bariéry (infekce HIV, idiopatické střevní záněty, nádorová onemocnění) [51]. Recentně publikované práce také poukazují na prostup BEV (derivovaných ze střeva) přes hematoencefalickou bariéru se vznikem lokální zánětlivé reakce [52]. O významu BEV v systémové cirkulaci zatím můžeme pouze spekulovat. Jsou však důkazem komplexity interakce mikrobioty a hostitele za fyziologických i patologických stavů [49, 51].

Parazitární původci

Problematika EV u parazitů je velmi málo prozkoumána. Jedná se o nesourodou skupinu zahrnující jednobuněčné i mnohobuněčné organismy s odlišnými fyziologickými procesy. Vzhledem k zaměření celé práce jsou dále diskutováni pouze původci lidských parazitárních onemocnění. Parazitární EV mohou modulovat imunitní odpověď hostitele inhibicí tvorby prozánětlivých cytokinů regulací genové transkripce. Tato strategie umožňuje únik před imunitním systémem hostitele. Byla popsána například u Leishmania spp. a Plasmodium spp. [53]. U příslušníků rodu Schistosoma byly popsány EV, které tlumí funkci Th2 lymfocytů [54]. Odlišným mechanismem studovaným například u Echinococcus spp. [55], Heligmosomoides spp.[56] a Toxoplasma gondi [57] je tvorba EV s obsahem nekódujících mikroRNA podobných s hostitelskými mikroRNA se známou imunoregulační funkcí. Na druhou stranu EV mohou indukovat tvorbu prozánětlivých cytokinů (Plasmodium spp. a Trypanosoma spp.) [53,58]. Duální modulace imunitní odpovědi je odrazem složitosti interakce parazita a hostitele. Dále mohou EV nést faktory virulence, které usnadňují následnou invazi patogenu [58]. EV produkované Trichomonas vaginalis tak např. usnadňují adherenci k epiteliálním buňkám urotraktu [59]. EV transferují také diferenciační faktory. Tento jev byl studován u Plasmodim falciparum, kdy EV uvolněné z infikovaného erytrocytu spustili gametogenezi, což je klíčový proces pro přenos plazmodií komářím vektorem [60]. Nedávno byl popsán přenos genů rezistence k antiprotozoálním molekulám mezi příslušníky rodu Leishmania spp. pomocí EV [61]. Studium EV může přinést cenné informace k bližšímu prozkoumání složité patogeneze parazitárních onemocnění s možností tvorby nových terapeutických strategií.

Extracelulární vezikuly jako nové biomarkery

Většina lidských buněk je schopna produkovat EV, což je předpokladem jejich výskytu ve všech tělesných kompartmentech. Dosud byly EV detekovány v krvi, moči, slinách, mozkomíšním moku, mateřském mléce i synoviální tekutině [62]. EV představují jeden ze základních pilířů mezibuněčné komunikace, čímž přispívají k udržení homeostázy. Výsledný účinek je podmíněn intravezikulárním nákladem a také povrchovými strukturami na membráně vezikuly. Jejich tvorba a nesený náklad může být alterován za patologických stavů, kde byly popsány četné kvantitativní i kvalitativní rozdíly ve složení EV. Vzhledem k tomu, že EV jsou specifické buněčným původem a signálními dráhami, které vedly k jejich uvolnění, stávají se velmi slibným nástrojem k bližšímu pochopení složitých patofyziologických procesů a také diagnostickým nástrojem stavů, které k této alteraci vedli [13].

Nejlépe je popsán výskyt EV v krvi, kde jsou nejhojněji zastoupeny EV pocházející z trombocytů, erytrocytů a endoteliálních buněk. Průlomové zjištění přinesla detekce orgánově specifických EV, které díky svému nesenému obsahu umožňují odhadnout funkční stav buněk, ze kterých pochází [63]. Jde o metodu tzv. fluidní biopsie, při které se analyzují například EV, volné cirkulující nukleové kyseliny a tkáňově specifické buňky v periferní krvi [64]. Svým potenciálem neinvazivního biomarkeru má fluidní biopsie velký přesah mimo diagnostiku patogenních infekcí, a to zejména v diagnostice nádorových [65] a neurodegenerativních onemocnění [66].

Detekce patogen specifických EV představuje velmi perspektivní možnost diagnostiky některých infekčních onemocnění. Obecně jsou zde aplikovány dva principy. Jednou možností je stanovení extracelulárních vezikul derivovaných patogenem s obsahem specifických proteinů a nukleových kyselin (např. mikroRNA). Tento způsob detekce je nejlépe prozkoumán u parazitárních onemocnění například u infekcí vyvolanými helminty [67], echinokoky [68] a schistozomami [69]. Druhou možností je stanovení extracelulárních vezikul hostitele obsahující patogenní komponenty, což je výhodné a slibné pro diagnostiku intracelulárních patogenů, jak dokazuje recentní studie popisující diagnostiku plicní i mimoplicní tuberkulózy detekcí EV z makrofágů nesoucí faktory virulence Mycobacterium tuberculosis v séru [70].

V současnosti výrazně vzrůstá zájem o studium EV a jejich role jako biomarkerů při detekci infekčních i neinfekčních onemocnění. Jejich široké přijetí do klinické praxe však omezuje mnoho faktorů. Stěžejní je absence standardizovaných metod izolace a detekce EV z tělních tekutin. Viriony a lipoproteiny mohou mít podobné biofyzikální i molekulární charakteristiky jako EV detekované v plazmě [71]. Podobně je nutné odlišení EV od recentně popsaných exomer a supermer, souhrnně označovaných jako nanočástice nebo non-EV [1, 72]. Dále také není vyřešena otázka intraindividuální a interindividuální variability [73].

Potenciální terapeutika nové generace

Extracelulární vezikuly jsou díky své přirozené funkci transportních váčků perspektivní terapeutickou modalitou. Předpokládá se využití EV jako platforem pro dodání terapeutik se zacílením na konkrétní buněčné populace [74]. Další slibnou možností je ovlivnění biogeneze endogenního systému EV ve smyslu inhibice/ stimulace tvorby a také inhibice příjmu EV recipientní buňkou [75]. Inhibice tvorby mikrobiálních EV představuje novou možnost antimikrobiální terapie [76]. Jako samostatná terapeutika jsou studovány EV derivované z mezenchymálních kmenových buněk [77]. Intenzivně je zkoumána možnost využití bakteriálních extracelulárních vezikul jako nové vakcinační platformy. Toto využití je výhodné pro nízkou výrobní cenu, přítomnost několika imunogenních povrchových antigenů a také nemožnost samostatné replikace vezikul [75, 78]. V současnosti jsou používány vakcíny proti Neisseria meningitidis skupiny B založené na vezikulách zevní membrány (OMV) [79].

Navzdory nadějným terapeutickým možnostem musí být překonána četná omezení. Je třeba dalších studií, které osvětlí dosud neznámá místa ve fyziologii a patofyziologii endogenních i exogenních vezikul, což umožní vytyčit nové farmakoterapeutické cíle. Velkou výzvu představuje výběr buněčných kultur umožňující dostatečnou produkci pro klinické využití [75, 80].

ZÁVĚR

Intenzivní výzkum výraznou měrou přispěl k lepšímu pochopení významu a funkce EV. Jde o nesmírně komplexní problematiku, danou heterogenitou neseného obsahu i strukturou měnící se napříč buněčnými organismy. Definování obsahu extracelulárních vezikul v kontextu jak endogenních (hostitelských), tak i exogenních (mikrobiálních) složek a jejich změny v průběhu infekce je zásadní pro lepší pochopení modulace imunitních reakcí a mechanismů patogenity. Zůstává zde však mnoho otázek a proměnných, zasahujících od samotné biogeneze a transferu biomolekul až po analytické a produkční záměry. Progresivní výzkum v této oblasti může vést k lepšímu pochopení duální role EV v procesech fyziologických i patofyziologických a vést k vývoji nových biomarkerů a farmakoterapeutických cílů.

 

Poděkování

Autoři děkují Mgr. Lence Kosečkové Micenkové, Ph.D. (pracoviště: RECETOX Masarykova univerzita) za grafické zpracování obrázků.

Podpořeno MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705).

Do redakce došlo dne 10. 1. 2023.

Adresa pro korespondenci:
MUDr. David Vydrář
Klinika infekčních chorob LF MU a FN Brno
Jihlavská 340/20 625 00 Brno
e-mail: vydrar.david@fnbrno.cz