Abstrakta přednášek

Česká verzia

Vyšlo v časopise: Klin. Biochem. Metab., 23 (44), 2015, No. 3, p. 129-141
Kategorie: XII.celostátní sjezd ČSKB ČLS JEP s mezinárodní účastí

HOŘEJŠÍHO PŘEDNÁŠKA

Analytika protilátek a použití protilátek v analytice

Antibodies analytics and antibodies used in analytic procedures

Štern P.

e-mail: petr.stern@atlas.cz

Pro pochopení průběhu imunoreakce je nutné mít ales-poň základní představu o prostorové konfiguraci protilátky (Ab). Významnou funkci ve stabilizaci struktury hrají disulfidické můstky. Při reakci Ab s antigenem (Ag) mohou interferovat endogenní Ab. Nejvíce používané Ab IgG a IgM reagují v imunoreakci odlišně. IgM nemá na rozdíl od IgG pant, a při reakci se musí z planární hvězdicovité struktury překlopit do svorkové krabí konfigurace. Na Ab působí elektrostatické interakce, vodíkové můstky, hydrofobní vazby a van der Waalsovy síly. Oblast Fc fragmentu blokují před navázáním Ag sacharidy. Konstantní a variabilní domény lehkých a těžkých řetězců Fab mají navzájem podobnou strukturu. Každá doména obsahuje zdrojové datové soubory na dvojici tří a pěti plátů. Oba soubory plátů jsou spojeny disulfidickým můstkem. Diverzitu struktury pro imunitní odezvu zajišťuje sekvence aminokyselin (AA) variabilní domény lehkých řetězců. Vazebné místo pro Ag tvoří hypervariabilní smyčka snadno ovlivnitelná pořadím AA. Oblasti určující komplementaritu (CDR) jsou hypervariabilní. Lehké a těžké řetězce vytvářejí vždy 3 CDR, tvořící stěny s drážkou pro Ag. Na Ab se obvykle váží 2 Ag. Kontaktní povrch mezi Ag a Ab může být rozlehlý a umožnit pevné a vysoce specifické spojení. Počet epitopů může být u velkých Ag poměrně značný. Pro stanovení lidských Ab je velká komerční nabídka zvířecích Ab, přičemž převládají myší a králičí Ab; více se nabízejí polyklonální než monoklonální Ab. Senzitivita při stanovení Ab je až 100 ng/l. Syntetické peptidy se známou sekvencí AA nemusí odpovídat prostorovému uspořádání nativní Ab, a proto se nehodí jako standardy k validaci při imunoprecipitaci a v imunohistochemii. Monoklonální Ab nemusí být specifické jen vůči cílovému Ag, nebo jej naopak nemusí zachytit (dokonce i jednotlivé šarže se mohou lišit mezi sebou). Trh s protilátkami je obrovský a ověření specifity je reálně věcí zákazníka a nikoliv výrobce.

MODERNÍ METODY: Příprava čipů pro imunoanalýzy je komplikovaná. Avidita Ab se liší podle nosiče a pro vyjádření senzitivity není žádná standardizace. Současná metodologie (s krátkou inkubací a bez míchání) vede ke snížení reakční rychlosti 300x (ve srovnání s ideálními podmínkami). Senzitivitu ovlivňuje: inkubační čas, velikost reakční plochy, povrch v místě reakce, hustota vazebných míst, účinnost míchání, geometrie inkubační komůrky, množství vzorku a způsob detekce. Senzitivita může být definována jako míra změny odezvy na malou změnu podnětu, nebo nejmenší kvantita podnětu, která může být rozlišena s daným stupněm spolehlivosti. Paralelní kompetitivní imunoanalýza s přímým nebo nepřímým značením umožňuje stanovit současně až stovky Ag, ale je méně citlivá než sendvičový postup, kdy je ovšem počet stanovovaných Ag limitovaný, vzhledem k vzájemné interakci detekčních Ab. Kapilární elektroforéza (CE) se provádí jak v homogenním (kompetitivní nebo nekompetitivní), tak v heterogenním uspořádání (s izolací analytu před CE). CE se používá k separaci imunokomplexu a volného reaktantu, nebo k eluci značené Ab při afinitní chromatografii po imunoanalýze (s ochranou paratopu Ab). Možnosti detekce jsou na principu: fluorescence, UV/VIS spektrofotometrie, chemiluminiscence, elektrochemie, hmotnostní spektrometrie nebo povrchové plazmonové rezonance. Luminiscence je běžně používaná metoda, ale rozvoj luminometrů posledních 20 let stagnuje. Luminiscence rozložená v čase může být uspořádána tak, že anténový ligand absorbovanou excitační energii přenáší přes tripletovou hladinu na chelát trojmocného europia. Anténový ligand může zvýšit absorpci záření až 100 000x. Luminiscenci lanthanoidu lze zvýšit také enzymovou reakcí, např. s ALP. Další postupy mohou být založeny na zhášení luminiscence koloidním zlatem, nebo fluorescence při kontaktu se zhášedlem. Na druhé straně může koloidní zlato iniciovat, po oxidaci, luminiscenci luminolu (senzitivita 3,1 pmol/l IgG). Kromě luminolu se jako značky hojně používají estery akridinu. Elektroluminiscence je často používaná pro vysokou senzitivitu (10 pmol/l) a dobrou časovou i prostorovou kontrolu reakce na povrchu elektrody. Pro kompetitivní imunoreakce lze použít i nevyčištěnou Ab, i když sendvičový postup je mnohem specifičtější. Takto lze stanovit např. 0,1 mg/l CRP. Pro stanovení receptorů se využívá metody přímé vazby značené Ab. Detekční limit elektroluminiscence lze podstatně snížit zabudováním bipyridylruthenia do liposomu, který se použije jako marker (senzitivita 1 pg/l AFP). Značkou může být také zhášedlo (např. nanokrystal CdSe/ZnS), které zháší elektroluminiscenci křemíkového nanokrystalu. Novinkou je použití uhlíkových elektrod ve tvaru mikrotitračních destiček, umožňujících stanovit až 10 Ag na každé elektrodě. Při simultánní elektroluminiscenci se upřednostňuje prostorově rozlišená analýza více analytů s univerzálním značením před stanovením analytů s více markery. V elektrochemických imunoanalýzách se jako markery používají apoferritin, liposomy, polovodičové nanočástice, uhlíkové nanotrubičky plněné enzymem nebo zlato. Detekce se provádí obvykle ampérometricky. Nanočástice mohou také deformovat po imunoreakci křemíkové krystaly; deformace se sleduje piezoelektrickým oscilátorem. Imunochromatografie na nitrocelulózové membráně se může použít i pro kvantitativní analýzy s fluorimetrickou detekcí v kompetitivním, inhibičním nebo sendvičovém uspořádání. Polovodičové nanokrystaly mají mnohem lepší fluorescenční vlastnosti (fluorescence nastavitelná podle velikosti částice, široké absorpční a úzké emisní spektrum, intenzivní fluorescence a vlastnosti zabraňující zeslabování světla). Nanokrystaly (např. CdSe/ZnS) se mohou použít také jako kapacitní adsorbens pro Ab (20x vyšší hustota vazeb než u koloidního zlata). HPLC s tandemovou MS separuje peptidy na základě hydrofobicity. Dále 1. kvadrupól vybere peptidy na základě m/z, 2. kolizní kvadrupól provede fragmentaci a 3. kvadrupól vybere zvolený fragment. V detektoru se pak k fragmentu přiřadí jeho prekurzor. Cílový Ag lze zachytit také specifickou Ab ve špičce nebo na kuličce a po eluci stanovit MS (s matricí zprostředkovanou laserovou desorpcí a následnou ionizací). Extrémně citlivé imunoanalýzy využívají tranzistor řízený polem s detekcí imunogenu na hradle (senzitivita 0,1 fmol/l), nebo senzor obřího elektrického odporu magnetického pole, kde malá změna pole vyvolá velký pokles elektrického odporu (senzitivita 5 fmol/l). Závěrem přednášky jsou uvedeny příklady široké nabídky metod pro stanovení Ab vůči imunogenům a použití Ab ke stanovení imunogenů a haptenů. Při imunoanalýzách se objevují nejvíce tyto problémy: nedostatek shody mezi různými analytickými soupravami, blokace epitopů Ag endogenními imunoglobuliny při stanovení autoprotilátek, vazba endogenních nespecifických nebo multispecifických imunoglobulinů na Ab použitou jako činidlo, efekt přebytku Ag při imunoreakci.

PL-1

The future of molecular biology in the diagnostic laboratories

prof. Maurizio Ferrari

president IFCC, Itálie

Abstrakt nedodán.

PL-2

Advances in molecular diagnostics and their respective analytical quality assurance

prof. Michael Neumaier

president DGKL, Německo

Abstrakt nedodán.

B1-1

Změny vnitřního prostředí při onemocnění ledvin

Changes of internal environment in renal diseases

Teplan V.

Klinika nefrologie IKEM, Praha

e-mail: vladimir.teplan@medicon.cz

Ledviny mají nezastupitelnou roli v organismu. Při jejich poruše jsou postiženy následující funkční systémy:

Funkce endogenně-exkreční: vylučování endogenních katabolitů (např. dusíkatých látek), kontrola a řízení homeostázy vnitřního prostředí, udržení stálého objemu a složení extracelulární tekutiny z hlediska jejího elektrolytového složení, osmotické koncentrace a acidobazické rovnováhy.
Funkce exogenně-exkreční: vylučování cizorodých látek, které narušují normální složení vnitřního prostředí. Do této skupiny látek patří i četné léky.
Funkce metabolicko-endokrinní. V ledvinách se tvoří látky hormonálního charakteru nebo díky metabolické přeměně v ledvině se tvoří z látek neúčinných (nebo méně účinných) látky vysoce biologicky aktivní.

Ledviny mohou být poškozeny akutně či chronicky, a s tím souvisí i dynamika a rozsah změn vnitřního prostředí. Současná klasifikace akutního poškození ledvin (AKI) se dělí do 5 stadií (RIFLE) či nověji dle AKIN do 3 stadií. Klasifikace chronického onemocnění ledvin (CKD) z původního CKD 1-5 se nyní dle KDIGO dělí do 6 stadií (G1, 2, 3a, 3b, 4, 5) a průvodná albuminurie do stadií 3 (A1-3). O zařazení rozhoduje funkční vyšetření ledvin, kde vedle sérového kreatininu stanovujeme cystatin C a hodnoty odhadnuté (estimated) glomerulární filtrace (eGFR) se počítají dle výpočtových vzorců např. CKD-MDRD, CKD-EPI, CKD-Lund-Malmö, CKD-EPI cys, CKD-EPI kr-cys, či dalších modifikovaných vzorců (historický výpočet dle Cockcroft- Gaulta či BIS1 a BIS2 pro seniory nebo CKD-MDRD pro obézní pacienty). Přesné měření renální funkce provádíme clearancí inulinu, a to klasicky se sběrem moči nebo formou plazmatické clearance. Současně můžeme posoudit i koncentrační schopnost ledvin, dnes pouze zkráceným DDAVP testem s podáním Minirinu. Funkční vyšetření umožňuje i posouzení tubulárních funkcí stanovením frakčních exkrecí Na a K a osmolality séra a moče. Acifikační a alkalizační schopnost ledvin je spojena se stanovením bikarbonátu a titrovatelné acidity.

B1-2

Vnitřní prostředí pohledem klinického biochemika

Internal environment - clinical chemist´s point of view

Kazda A.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN Praha

e-mail: kazda@vfn.cz

Cíl: Vnitřní prostředí (VP) vytváří pro organismus podmínky, umožňující jeho aktivity a přežití. Proto má včasná diagnóza a úprava poruch VP zásadní význam.

Metody: Sdělení hodnotí problematiku VP ze tří hledisek:

Uvádí závažné poruchy parametrů VP, které vedou ke komatózním stavům a jsou spojeny s rizikem úmrtí.
Upozorňuje na provázanost vztahů mezi parametry, vyžadující komplexní hodnocení nálezů. To se týká např. vztahů mezi kalemií a pH nebo mezi iontovými systémy a acidobazickou rovnováhou (ABR). Za jejím zdánlivě fyziologickým nálezem se mohou skrývat dvě těžké poruchy, metabolická acidóza “kompenzovaná” stejně závažnou metabolickou alkalózou. Nálezy iontogramu upozorňují na řadu patologických vlivů na ABR. Informaci zkvalitní výpočty: diference silných iontů, neměřených aniontů, anion gap. Při hypo a hypernatremiích se zpravidla stejným směrem pohybují i hodnoty chloridů, ale pokud je jejich výchylka větší nebo menší než odpovídá změně natremie, lze to jednoduchým výpočtem zjistit. Taková změna chloridů potencuje nebo tlumí poruchu ABR, k níž při dysnatremií došlo. Toto poznání má význam pro výběr infuzí solných roztoků. Další vztahy plynou ze změn efektivní osmolality. Např. hyperglykemie přetahuje vodu z buněk do extracelulárního prostoru a natremii naředí.
Parametry VP nelze hodnotit bez znalosti příčin poruch a dalších údajů anamnestických a klinických. To se týká např. rychlosti úpravy dysnatremie (délka trvání) i hodnocení vývoje poruch ABR.

Výsledky: častá závažnost poruch VP, provázanost vztahů mezi parametry a propojení VP s klinickým průběhem vyžadují komplexní přístup k diagnóze i terapii.

Závěr: Spolupráce biochemika s klinickými lékaři formou konzultací, účasti na vizitách a seminářích je přínosná nejen pro pacienty, ale i obě profesní strany.

B1-3

Vnitřní prostředí organismu pohledem diabetologa – hyperosmolární hyperglykemický stav a diabetická ketoacidóza

Internal environment of the organism viewed by a diabetologist – hyperosmolar hyperglycemic state and diabetic ketoacidosis

Kopecký J.

Centrum Diabetologie IKEM, Praha

e-mail: jan.kopecky@ikem.cz

Hyperglykemický hyperosmolární stav je komplikací především diabetu 2. typu a je charakterizován hyperglykémií, těžkou dehydratací, často renální insuficiencí a v závislosti na závažnosti změn poruchami vědomí různé intenzity. Typickou příčinou je relativní nedostatek inzulínu v kombinaci se stavem znemožňujícím dostatečný přísun tekutin při narůstající osmotické diuréze z hyperglykemie. Množství inzulínu však stále dostačuje na zabránění výraznější ketogeneze. Klinicky dominuje žízeň, polyurie a progredující porucha vědomí až kóma. Laboratorně nalezneme sérovou hyperosmolaritu danou hyperglykemií a dehydratací. Diferenciálně diagnosticky je závažná záměna s cerebrovaskulární příhodou, stav je zároveň stran rozvoje tromboembolických příhod velmi rizikový. Diabetická ketoacidóza je komplikací častější u diabetu 1. typu, deficit inzulínu je zde výraznější, oproti výše uvedenému stavu již nestačí na potlačení ketogeneze a rozvíjí se zde kromě hyperglykemie i acidóza z produkce ketolátek. Mastné kyseliny jsou uvolňovány ve zvýšené míře do krevního oběhu, oxidovány v játrech, konečný produkt (acetyl-CoA) ale není při deficitu inzulínu utilizován v citrátovém cyklu ale tvoří silné organické kyseliny, acetoacetát a 3-hydroxybutyrát. Klinické obtíže spojené s acidózou – nevolnost, zvracení a dušnost mohou přivést pacienta k lékaři dříve, než se stačí rozvinout výrazná hyperglykémie a dehydratace. V laboratorním nálezu dominuje metabolická acidóza se zvýšením „anion gap“ v důsledku hromadění organických kyselin. Diferenciální diagnóza zahrnuje m. j. některé typy otrav (methylalkohol, ethylenglykol, salicyláty), alkoholickou ketoacidózu, laktátovou acidózu a uremii. Mezi oběma uvedenými stavy není ostrá hranice, plynule mezi sebou přecházejí. Léčba je v základních principech stejná, spočívá zejména v úhradě deficitu vody, elektrolytů a podání inzulínu.

B2-1

Metabolismus kostní tkáně a možnosti jeho sledování

Bone metabolism and its laboratory reflection

Palička V.

ÚKBD Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: palicka@lfhk.cuni.cz

Metabolismus kostní tkáně je složitou orchestrací dějů uvnitř kosti, ale i jejich ovlivnění ostatními systémy a orgány těla. Klinická potřebnost detekce kostního metabolismu vyplývá ze snahy:

a) včas a správně diagnostikovat případnou poruchu,
b) odhadnout její další rozvoj,
c) pokud možno predikovat odpověď na léčbu,
d) monitorovat efekt léčby.

Zobrazovací metody jsou v tomto smyslu prozatím málo přínosné, především pro „statický obraz“, k jehož změně obvykle dochází až za poměrně dlouhou dobu (včetně měření kostní minerální hustoty). Laboratorní metody poskytují daleko dynamičtější obraz a mohou přispět k řešení všech čtyř výše uvedených požadavků. Jejich zásadními nedostatky ale jsou:

a) zastaralost spektra – klasické kostní markery je potřeba doplňovat novými, navazujícími na nové patofyziologické poznatky o metabolismu kostní tkáně (například FGF23, sklerostin a další),
b) klinicky zcela nevyhovující standardizace a nepřenositelnost výsledků mezi jednotlivými metodami,
c) vysoká biologická i analytická variabilita.

Postupné odstraňování zmíněných nedostatků s lepší reflexí novinek a specifikace požadavků pro jednotlivé chorobné stavy mohou přinést zásadní zlepšení laboratorní podpory diagnostiky, predikce i monitorování metabolických kostních chorob.

B2-2

Význam laboratorních vyšetření v klinické osteologii

Clinical utility of laboratotory assessment in osteologic patients

Pikner R.

Odbor Klinických laboratoří, Klatovská nemocnice a.s

e-mail: pikner@nemkt.cz

Laboratorní vyšetření je nedílnou součástí péče o pa-cienty s osteoporózou. Stejně tak jako denzitometrické vyšetření mají laboratorní parametry své indikace a limitace. Mezi základní vyšetření patří běžné biochemické parametry (ionty, jaterní, ledvinné testy, ELFO bílkovin), dále vyšetření kalcio-fosfátového metabolismu (Ca, P, 25 OH vit D, PTH, Ca/kreat v moči) a i vyšetření markerů kostního obratu (PINP, kostní ALP, Crosslaps, Osteokalcin, TRAP5b). I přes řadu nevýhod pomáhají laboratorní vyšetření při diagnostice sekundárních příčin osteoporózy optimalizovat příjem vápníku a vitaminu D, poskytují dynamické informace o efektivitě terapie a upozorňují na nedostatečnou adherenci pacientů k léčbě.

Cílem prezentace je tedy poskytnout stručný přehled indikací a limitací laboratorních vyšetření. Kdy a kde jaké parametry je možné indikovat se zaměřením na parametry kostního metabolismu, jejich hodnocení.

B2-3

Požadavky na analytickou a postanalytickou kvalitu laboratorního vyšetření markerů kostní formace

Requirements on analytical and postanalytical quality for the analysis of bone markers turnover

Friedecký B.

SEKK s.r.o., Pardubice

e-mail: friedecky@sekk.cz

Ukazatele formace a resorpce kostní hmoty (BMT-bone markers turnover) jsou užitečným nástrojem predikce rizika fraktur u subpopulací s osteoporózou a zejména slouží ke sledování efektu její terapie. Pracovní skupina IOF-IFCC hodnotila v letech 2011 a 2014 požadavky na kvalitu měření BMT. Důraz byl kladen zejména na dva ukazatele, považované za klíčové: P1NP a CTx. Za limity efektivního použití BMT je považován nedostatek standardizace a nedostatečnost kontroly kvality. Data českého programu EHK ukazují závažné poznatky, které by mohly být využity k okamžitému zlepšení současné situace. U klíčových analytů CTx a P1NP je možné docílit harmonizace výsledků pouhým výběrem metod měření, respektive ostražitým vztahem k případným nabídkám nových diagnostik. Toto stanovisko je již z pouhé inspekce výsledků kontrolních cyklů SEKK-BM zcela zřejmé. Při měření PTH, ukazatele vztahu mezi kostním metabolismem a renálními funkcemi, by měla být významně realizována orientace na metody třetí generace, vykazující vyšší specifičnost a užší vztah ke standardizaci. Vzorovým příkladem nezbytnosti standardizace je mezinárodní program standardizace u vitaminu D (VDSP). Reakce na jeho výsledky by měla být součástí hodnocení kvality. Základem postanalytické kvality vyšetřování BMT, podmiňující přenosnost výsledků mezi laboratořemi a klinickými centry, je používání správných jednotek měření. V současnosti dosahuje používání různých jednotek, a tím i číselných hodnot výsledků v laboratořích 14-50 %. Situace vyžaduje rychlé řešení na úrovni oficiálního doporučení. Analytická kvalita vyšetření BMT vyžaduje použití kritérií biologické variability, postanalytická kvalita pak udávání hodnot RCV. Program EHK by měl kombinovat hlediska analytické a postanalytické kvality.

B2-4

Vitamin D – možnosti stanovení a jejich specifika pro interpretaci hodnot u pacientů

Vitamin D – possibilites of determination and their specific features for interpretation of values in patients

Vávrová J., Friedecký B., Pavlíková L., Palička V.

ÚKBD Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: vavrovaj@lfhk.cuni.cz

Zařazení pacienta do ambulantního léčení v osteologické poradně je spojeno s podrobným biochemickým laboratorním vyšetřením. Již vstupní panel vyšetřovaných parametrů zahrnuje požadavek na vyšetření aktuální saturace organismu 25-hydroxyvitaminem D. Aktivní forma 1,25 dihydroxyvitamin D je vyšetřována s významně nižší frekvencí požadavků. Analytické zázemí metody stanovení 25 hydroxyvitaminu D je dlouhodobě diskutovanou otázkou. Laboratorně dostupné imunoanalytické metody (zastoupeny 90,7 % v systému EHK DEQAS) a separační techniky (LC MS/MS a HPLC využívá 9,3 % účastníků DEQAS) jsou na cestě postupného procesu standardizace 25 hydroxyvitaminu D. Laboratorně se začínají prosazovat také diagnostické soupravy stanovení 1,25 dihydroxyvitaminu D pro imunochemické analyzátory, které jsou využívány paralelně s předchozí generací RIA postupů, metody LC-MS/MS ani v této oblasti prozatím běžnou rutinní praxí v našich laboratořích nejsou.

Pro interpretaci výsledků je stále nedořešeným problémem rozpětí fyziologických hodnot 25 hydroxyvitaminu D vzhledem k věku a ročnímu období. Většina výrobců diagnostických souprav vychází z číselných hodnot původní RIA metody, klinici tedy často rozhodují na podkladě číselných hodnot číselně nesrovnatelných diagnostických postupů. Nejasnosti přetrvávají rovněž v informacích, ke kterému vitaminu D se laboratorní výsledky vztahují. Pro hodnocení saturace je důležité vzít v potaz také typ preparátu, kterým je pacient suplementován. Aktivní spolupráce laboratorních pracovníků s ambulantními lékaři má v těchto situacích, stejně tak jako při řešení atypických nálezů, velký význam.

B2-5

Metabolismus kosti, funkce ledvin a odraz v laboratorních výsledcích

Bone metabolism, kidney function and reflection in laboratory results

Dusilová Sulková S., Palička V.

Hemodialyzační středisko Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: sylvie.dusilova@fnhk.cz

Metabolismus kosti je změněn v časných fázích chronických onemocnění ledvin (CKD), a to vlivem snížené/chybějící renální eliminace i snížené/chybějící metabolické a endokrinní funkce ledvin. Výsledné kostní změny jsou především spojeny se sekundární hyperparathyreózou. Laboratorním odrazem je zvýšená/vysoká koncentrace parathormonu, normální/zvýšená hodnota kostního izoenzymu ALP, normokalcémie, hyperfosfatémie a nízká koncentrace kalcitriolu. V současné době se na metabolické kostní změny při CKD nahlíží v komplexnějším pohledu: zvažuje se, jakou roli mohou mít kostní změny u daného pacienta, bez závislosti na onemocnění ledvin (postmenopausální osteoporóza, jiné metabolické osteopatie). Role klasických (P1NP, CTX, TRAP a další) i nových (sklerostin) kostních biomarkerů není pro CKD plně objasněna a je v současné době intenzivně studována. Nové eliminační metody, které se stále více uplatňují v léčbě selhání ledvin, zejména selhání chronického, mají vyšší propustnost membrány. Ukazuje se, že sérové koncentrace vybraných osteomarkerů (CTX) se výrazně mění při konvektivních, avšak nikoliv difusivních procedurách. Dalším faktorem, který výrazně ovlivňuje akutní a zřejmě i dlouhodobý vývoj kostních ukazatelů v čase u dialyzovaných pacientů, je složení dialyzačního roztoku (typ přidané kyselé složky k bikarbonátové bázi, tj. citrát vs acetát, a koncentrace difusibilního kalcia v roztoku). Pacienti s chronickým onemocněním mají nižší hladiny nativního vitaminu D ve srovnání s běžnou populací. Tato skutečnost může přispívat k tomu, že hladiny kalcitriolu jsou nižší než by odpovídalo stupni poškození ledvin. Dalším důvodem, proč je kostní metabolismus narušen již v časných fázích renálního onemocnění, je kompenzatorní odezva organismu na retenci resp. nálož fosfátů. Při snížené funkci ledvin je fosfatémie dlouho udržena v referenčním rozmezí, protože stoupá exkreční frakce fosfátů. Do nedávna byla kompenzatorní fosfaturie považována se důsledek hyperparathyreózy, dnes je zřejmé, že se podílí i nadprodukce druhého fosfatoninu, FGF-23 v kostních buňkách. FGF-23 je významným inhibitorem 1-alfa-hydroxylázy, což dále snižuje koncentrace kalcitriolu. Při jakémkoliv onemocnění ledvin se sníženou funkcí je nejistá interpretace koncentrací látek v moči, resp. močových odpadů a odvozených indexů. Zejména nepřesná je kalciurie, neboť renální tubulární funkce mohou ovlivnit jen to množství látky, které bylo vyloučeno glomerulární filtrací. Spolehlivá diagnostika kostních změn a určení možností léčby u nefrologických nemocných vyžaduje spolupráci nefrologa, osteologa, biochemika a dalších medicínských oborů.

B3-1

Srdeční troponiny v diagnostice strukturálních změn myokardu v klinické praxi v roce 2015

Cardiomarkers in the diagnostics of structural changes of the myocardium in a clinical practice

Pudil R.

I. interní kardioangiologická klinika, FN a LF UK v Hradci Králové

e-mail: pudilr@lfhk.cuni.cz

Stanovení hladin srdečních troponinů vysoce/ultrasenzitivními metodami se stalo zavedenou součástí běžné klinické praxe. Hlavní indikací jejich využití je průkaz myokardiální nekrózy v diagnostice akutních koronárních syndromů (s nebo bez elevací ST segmentů). Jejich stanovení také významně přispívá k určení správné diagnózy v diferenciální diagnostice bolestí na hrudi v prostředí urgentních provozů. V této souvislosti vzbuzují velkou pozornost tzv. rule-in/rule-out protokoly, které mají potenciál klinického využití. Stanovení srdečních troponinů je v některých případech součástí tzv. multimodální strategie, která zlepšuje parametry senzitivity a specificity v některých akutních stavech (např. současné stanovení copeptinu či mastné kyseliny vážícího proteinu). Dalšími oblastmi klinické medicíny, ve kterých se využívá stanovení srdečních troponinů při stratifikaci rizika, jsou: embolizace do plic, plicní hypertenze, srdeční selhání, myo/perikarditidy, průkaz poškození myokardu toxickými látkami (onkologická terapie, toxicita psychofarmak a některých dalších látek). Na pomezí kliniky a experimentu probíhají některé experimentální studie, které využívají stanovení troponinů při porovnání různých terapeutických přístupů. Příkladem je například využití stanovení troponinů při různých metodách vedení kardiochirurgických operací.

B3-2

Kardiomarkery v diagnostice kardiotoxicity onkologické léčby – přehled a vlastní zkušenosti

Cardiomarkers in the diagnostics of cardiotoxicity of oncology treatment – review and own experience

Horáček J. M.^1,2, Vašatová M.³, Tichý M.³, Pudil R.⁴

1Katedra vojenského vnitřního lékařství a vojenské hygieny, FVZ UO Hradec Králové, 2IV. interní hematologická klinika, FN a LF UK v Hradci Králové, 3Ústav klinické biochemie a diagnostiky, FN Hradec Králové, 4I. interní kardioangiologická klinika, FN a LF UK v Hradci Králové

e-mail: jan.horacek@unob.cz

Kardiotoxicita je jedním z nežádoucích účinků onkologické léčby. Největší riziko pro rozvoj kardiotoxicity představují antracykliny, cyklofosfamid, taxany, 5-fluo-rouracil, trastuzumab a některé kinázové inhibitory. K rozvoji kardiotoxických projevů může dojít v akutní fázi nebo až s dlouhým časovým odstupem po léčbě, proto má včasná detekce kardiotoxicity mimořádný význam. Z diagnostických metod kardiotoxicity se v našich podmínkách nejčastěji používá echokardiografie a elektrokardiografie. Z biochemických markerů kardiálního postižení se v této indikaci používají především kardiální troponiny (cTnT, cTnI) a natriuretické peptidy (NT-proBNP, BNP), se kterými je nejvíce zkušeností. V poslední době jsou rovněž studovány další perspektivní kardiomarkery, zejména glykogenfosforyláza BB (GPBB), kardiální typ proteinu vázajícího mastné kyseliny (H-FABP) a další, ale zkušenosti jsou limitované a běžně se v klinické praxi zatím nepoužívají. Kromě aktuálního přehledu o dané problematice budou prezentovány i dlouholeté vlastní zkušenosti s využitím kardiomarkerů v diagnostice kardiotoxicity hematoonkologické léčby, jak konvenční chemoterapie obsahující antracykliny, tak vysokodávkované chemoterapie s následnou transplantací krvetvorných buněk.

Práce byla podpořena z DZRO 1011 (FVZ) a MZ ČR – RVO (FNHK, 00179906).

B3-3

Kardiální markery u pacientů s jaterní cirhózou

Cardiac markers in cirrhosis patients

Vašatová M.¹, Pudil R.²

¹Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice, Hradec Králové, ²1. interní kardioangiologická klinika, Fakultní nemocnice, Hradec Králové

e-mail: vasatova.martina@seznam.cz

Úvod: Více než čtyři desetiletí je známo, že jaterní cirhóza souvisí s abnormalitami kardiovaskulárního systému. Transjugulární intrahepatický portosystémový zkrat (TIPS) je široce rozšířenou metodou pro léčbu systémové portální hypertenze u cirhotických pacientů.

Metody: Testovali jsme markery kardiální ischemie a nekrózy ve vztahu k echokardiolografickým a hemodynamickým parametrům u cirhotických pacientů léčených TIPS.

Výsledky: Zvýšení hs-cTnT and FABP koncentrací bylo ve spojení s horším přežitím pacientů s TIPS. GPBB koncentrace po TIPS signifikantně korelovala se systémovou vaskulární rezistencí a srdečním indexem a sérový hs-cTnT s vlnou pozdního plnění a průměrem levé komory měřených před TIPS.

Závěr: Měření kardiálních markerů by mohlo být užitečné pro monitorování ischemie myokardu během procedury TIPS.

B3-4

Role srdečních troponinů v experimentální kardiologii

Role of cardiac troponins in experimental cardiology

Adamcová M.

Ústav fyziologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze

e-mail: adamcova@lfhk.cuni.cz

Srdeční troponiny jsou využívány jako biochemické markery myokardiálního poškození i v experimentální medicíně u celé řady srdečních onemocnění jako je srdeční selhání, kardiomyopatie, arytmie, chlopenní onemocnění, experimentálně-navozený AIM, ale i u infekčních onemocnění, septických stavů a respiračních onemocnění jako je plicní embolie, plicní hypertenze aj. Stanovují se i při studiích in vitro, které využívají model izolovaného srdce nebo při pokusech s izolovanými kardiomyocyty. Troponiny byly navíc studovány u širokého spektra zvířat, včetně myší, laboratorních potkanů, morčat, křečků, králíků, psů, koček, prasat, koní, ovcí a opic. Srdeční troponiny jsou v poslední době rovněž považovány za jedny z nejdůležitějších biochemických ukazatelů myokardiálního poškození při hodnocení kardiotoxického účinku léčiv. Doposud nejvíce pozornosti bylo věnováno studiu troponinů na modelu akutní toxicity vyvolané katecholaminy a na modelu chronické kardiotoxicity po podání antracyklinů, event. při monitorování léčiv s potenciálně kardioprotektivním účinkem. „Diagnostické okno“ troponinů v toxikologických studiích se výrazně liší od akutního infarktu myokardu a svědčí pro jejich rychlou kinetiku, protože zvýšené hladiny přetrvávají většinou jen 48 až 72 hod po podání. Výběr vhodné eseje v experimentu však zůstává stále otevřenou otázkou. Z proteomické analýzy vyplývá, že i řada hs esejí pro humánní účely využívá protilátky proti epitopům, které jsou značně homologní u člověka i u jednotlivých druhů laboratorních zvířat. Vzhledem k závažnosti celé problematiky je výzkum v této oblasti koordinován pracovní skupinou HESI Cardiac Troponins Biomarker Working Group ve spolupráci s FDA.

B3-5

Využití proteomických nástrojů pro identifikaci markerů kardiovaskulárních chorob

Application of proteomic tools for identification of cardiovascular disease markers

Řehulková H.¹, Fučíková A.¹, Řehulka P.¹, Řeháček V.², Pudil R.³, Stulík J.¹

¹Katedra molekulární patologie a biologie, Fakulta vojenského zdravotnictví, Univerzita obrany, Třebešská 1575, 500 01 Hradec Králové, ²Transfuzní oddělení, Fakultní nemocnice Hradec Králové, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové, ³I. Interní kardioangiologická klinika, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Karlova univerzita v Praze, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové

e-mail: helena.rehulkova@unob.cz

Budou shrnuty některé proteomické metody sloužící k odhalení změn v zastoupení proteinů v plazmě u pacientů s kardiovaskulárním onemocněním a bude ukázána aplikace proteomické analýzy u hypertrofické kardiomyopatie (HCM). Pro proteomickou analýzu byly použity tryptické digesty proteinů imunodepletované plasmy odebrané jak od pacientů s HCM, tak od jedinců ze srovnávacích skupin. K relativní kvantifikaci byla použita proteomická technika iTRAQ (Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation) založená na chemickém značení peptidů stabilními izotopy a také technika SWATH (Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra) využívající kvantifikace bez izotopického značení. Bioinformatické zpracování výsledků obou technik umožňuje sledovat změny zastoupení proteinů v jednotlivých analyzovaných skupinách. Byl získán seznam potenciálních proteinových markerů sledovaného onemocnění. Vybrané proteiny vykazující statisticky významné rozdílné zastoupení mezi skupinou pacientů a kontrolní skupinou budou zařazeny mezi potenciální kandidáty k validační analýze pomocí cílené hmotnostně-spektrometrické analýzy. Použité proteomické metody umožnily najít potenciální proteinové markery u HCM.

Tato práce byla podpořena grantem č. NT/13721 Interní grantové agentury Ministerstva zdravotnictví České republiky.

B4-1

Pokroky v léčbě virové hepatitidy C

Recent advances in chronic hepatitis C antiviral treatment

Urbánek P.

Interní klinika 1. LF UK a ÚVN Praha

e-mail: petr.urbanek@uvn.cz

Virus hepatitidy C (HCV) byl identifikován v roce 1989. Jde o RNA virus řazený do čeledi Flaviviridae jako jediný zástupce rodu Hepacivirus. Úspěch protivirové léčby chronické HCV infekce je definován jako setrvalá virologická odpověď (SVR). Základem protivirové léčby již od okamžiku identifikace viru byl interferon-α (IFN-α). V roce 2010 vstoupily do rutinního užití první zástupci skupiny přímo působících virostatik (DAA). Jde o rozsáhlou skupinu látek, které specificky inhibují jeden ze tří enzymů podílejících se na replikaci HCV. Boceprevir a telaprevir patří do skupiny inhibitorů virové proteázy. Jde o léčiva účinná pouze proti HCV genotypu 1, mají značné množství nežádoucích účinků. Nutná je jejich kombinace s PEG-IFN a RBV. Teoretické předpoklady pro „ideální“ virostatikum splňuje inhibitor virové RNA polymerázy (RdRp) sofosbuvir (SOF). SOF v kombinaci s PEG-IFN a RBV umožnila zkrátit dobu celé protivirové léčby na 12 týdnů. Jeho nežádoucí účinky jsou srovnatelné s placebem. Jako efektivní se ukázala i jeho kombinace s jinými virostatiky bez zařazení PEG-IFN. Tyto režimy jsou obrovským pokrokem zejména pro pacienty s pokročilou jaterní cirhózou při chronické HCV infekci či pro pacienty před a po transplantaci jater. Další kombinací, je tzv. 3D kombinace – dasabuvir, ombitasvir, paritaprevir/ritonavir. Dasabuvir není určen k podávání v monoterapii, striktně je třeba jej kombinovat s ombitasvirem a paritaprevirem/ritonavirem. Kombinací dochází ke spojení tři přímo působících antivirotik s různými mechanismy účinku a nepřekrývajícími se profily rezistence vůči cílovému HCV. Ukázalo se, že u cirhotiků je účinnější režim trvající 24 týdnů nežli režim trvající pouze 12 týdnů (SVR12 96 % vs. 92 %). Účinnost 12týdenního režimu u pacientů s genotypem 1a byla 89 %, u genotypu 1b pak 98,5 %. Účinnost půlročního režimu byla u genotypu 1a 94,2 % a u 1b dokonce 100 %. V současnosti je jisté, že budoucnost protivirové léčby chronické HCV infekce spočívá v kombinacích několika virostatik různých tříd, které budou podávány po dobu několika málo týdnů (4-6) a jejichž účinnost měřená pomocí SVR bude kolem 95-100 %. Zdá se tedy, že otázka léčby chronické HCV infekce již byla vyřešena, problémem ale zůstává cena a s tím související široká dostupnost protivirových kombinací.

B4-2

Bilirubin, stále nepoznaný žlučový pigment

Bilirubin, stil unkonown bile pigment

Vítek L.

4. interní klinika a Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK v Praze

e-mail: vitek@cesnet.cz

Oxidační stres hraje významnou roli v patogenezi celé řady civilizačních onemocnění, kardiovaskulárními chorobami počínaje, přes nemoci nádorové až po onemocnění autoimunitní a neurodegenerativní. Bilirubin je hlavním produktem katabolické dráhy hemu v krevním řečišti. Po dlouhou dobu byl považován pouze za odpadní produkt katabolismu hemu, data z posledních dvaceti let však prokazují jeho významné antioxidační vlastnosti, kterými se spolupodílí na ochraně před zvýšeným oxidačním stresem. Existuje dnes již mnoho desítek experimentálních i klinických studií dokumentujících asociaci mezi nízkými koncentracemi bilirubinu v cirkulaci a nemocemi srdce a cév, cukrovkou, metabolickým syndromem, některými zhoubnými nádory, autoimunitními nemocemi, jako jsou lupus erythematodes, nebo revmatoidní artritida, či neurologicko-psychiatrickými chorobami, jako je například schizofrenie. Naopak jedinci s mírně zvýšenými koncentracemi bilirubinu v krvi, typicky pozorovanými například u Gilbertova syndromu, mají rizika těchto chorob výrazně snížena. Z posledních epidemiologických studií vyplývá, že bilirubin má negativní vztah i k celkové mortalitě, pozoruhodné jsou také souvislosti mezi systémovými koncentracemi bilirubinu a cirkadiánními rytmy. Bilirubin tak představuje významnou molekulu uplatňující se v obraně před zvýšeným oxidačním stresem i v buněčné signalizaci.

B4-3

Molekulární diagnostika metabolických nemocí jater

Molecular testing for metabolic liver diseases

Jirsa M.

IKEM, Praha, a Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LFUK v Praze

e-mail: milan.jirsa@ikem.cz

Molekulární diagnostika metabolických nemocí jater s typickou manifestací v dospělém věku či ve druhé dekádě, tj. Wilsonovy chodoby, HFE hemochromatózy, dědičných forem jaterní porfyrie, deficitu alfa1-antitrypsinu, erytropoetické protoporfyrie a dědičných hyperbilirubinémií slouží především k potvrzení diagnózy a ke skríningu v rodinách. Prvotní úlohu v diagnostice jmenovaných onemocnění však stále hrají vyšetření biochemická. Naopak u dědičných cholestáz, non-HFE hemochromatózy a familiární cholelitiázy jsou molekulární metody nepostradatelným diagnostickým nástrojem, neboť pro tato onemocnění zatím neexistují spolehlivé testy na úrovni proteinu či metabolitu. V přednášce bude prezentován přehled postupů laboratorní diagnostiky uvedených onemocnění s důrazem na indikaci a interpretaci výsledků molekulárních vyšetření.

B5-1

Od analytické kvality ke kvalitě postanalytické fáze laboratorních vyšetření

From analytiocal quality to quality of postanalytical processes

Friedecký B., Kratochvíla J.

SEKK s.r.o., Pardubice

e-mail: friedecky@sekk.cz

Základním předpokladem ceny laboratorních vyšetření je jejich kvalita. Kvalita je v podstatě efektivita výsledku vyšetření v procesu diagnostiky chorob a kontroly jejich terapie. Zásadním předpokladem je zde dosažení harmonizace výsledků měření. Cesty k dosažení harmonizace jsou v současnosti velmi silně diskutovány a testovány jednak v mezinárodním měřítku, jednak napříč všemi fázemi laboratorního vyšetřování (preanalytickou, analytickou, postanalytickou). Je mnoho různých cest, vedoucích k harmonizaci. Ideální je standardizace, založená na metrologické návaznosti. Mnohdy je neschůdná, a pak je třeba pracovat s dobře promyšlenými konsensuálními postupy. K nim patří především harmonizovaná postanalytická fáze. Je třeba opakovaně zdůrazňovat, že metrologická návaznost je sice základem harmonizace/standardizace, avšak skutečným cílem laboratorní medicíny jsou harmonizované výsledky, nikoliv výrobci/laboratořemi prezentované řetězce návaznosti, občas pochybné platnosti. Proto je nutné dosahovat vyšší úrovně harmonizace také v procesech hodnocení výsledků. To obnáší harmonizaci akceptovatelných limitů při hodnocení výsledků EHK a nalezení všeobecně platného a použitelného indikátoru kvality. Není pochyb o tom, že by takovým nástrojem mohla být sigmametrie. Její aplikaci a implementaci bude nutné věnovat nemalé úsilí. Harmonizované výsledky by pak mohly být dobrým podkladem ke kvalitní postanalytické fázi. Zatím je založena na prezentaci málo srovnatelných a často zmatených hodnot referenčních intervalů různé provenience. Harmonizace postanalytické fáze, založená na harmonizovaných výsledcích měření s dosaženou vhodně vysokou hodnotou sigmametrie by měla být založena na hodnotách rozhodovacích limitů (cut off), harmonizovaných s mezinárodními doporučeními, založenými na EBM a na dosahovaných hodnotách RCV. To vše by mělo mít za cíl prospěch pacientů a redukci rizika péče o ně. Popsané postupy a problémy demonstrujeme na příkladech vyšetření nefrologických, kardiovaskulárních a diabetických laboratorních ukazatelů. Cílem je ukázat, co může kvalitní laboratorní vyšetření poskytnout pacientovi, jaké jsou meze těchto možností a jak je třeba přitom postupovat.

B5-2

Problémy analytické kvality vyšetření v režimu POCT

Problems on the analytical quality of laboratory analysis by POCT

Špirková J., Friedecký B., Pavlíková L.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: jana.spirkova@fnhk.cz

Počty vyšetření POCT v celém světě neustále rostou a přírůstek se odhaduje na 10-20 % ročně. Finanční obraty a náklady se celosvětově pohybují v řádu stovek miliard USD, proto je nutné znát, monitorovat a zlepšovat kvalitu POCT. Normativním základem kvality je ISO 22870:2012 a doporučení odborných společností. V našem sdělení pojednáme zejména o kvalitě POCT vyšetření nezbytných pro péči v intenzivní medicíně, kde je její role naprosto klíčová. Podrobněji rozebereme problémy stanovení glukózy glukometry, parametry acidobazické rovnováhy a také zmíníme problémy měření HbA1c a kardiálních markerů. Vyhodnotíme potřebnost řádné analytické kontroly jak interní, tak i externí. Bude zdůrazněna potřeba koordinace POCT mezi klinickou laboratoří, klinickými odděleními a informačními systémy, koordinace při pořizování potřebné POCT techniky. Je velmi důležité při realizaci POCT režimu sledovat výsledky testování přístrojů v referenčních institucích (SKUP, Rilibäk, NRL ČR). Důležité pro zajištění kvality POCT jsou procesy edukace a přezkušování způsobilosti obsluhujícího personálu.

B5-3

Nový pohled na vnitřní kontrolu kvality v molekulární biologii

A new view of the internal quality control in molecular biology

Plíšková L., Kutová R., Pavlíková L.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: pliskova@lfhk.cuni.cz

Vnitřní kontrola kvality u molekulárně biologických metod musí vždy obsahovat kontrolu amplifikace, kontrolu negativní a kontrolu přítomnosti inhibitorů polymerázy. Autoři si kladou otázku, zda takto pojatá VKK je dostačující a rozšiřují kontrolu amplifikace o další aspekty u všech metod využívajících metodu real-time PCR, zejména pak u metod kvantitativních. Běžně používané kontroly amplifikace (tzv. pozitivní kontroly) nesledují standardnost běhů v čase, což se jeví u většiny metod jako nezbytné. Ve sdělení ukazujeme možnosti využití části QC – kontrola kvality laboratorního systému OpenLims a zpracování kontrol amplifikace pomocí Levey-Jenningsova grafu.

B6-1

PCSK9 - rozhodný pokrok v možnostech ovlivnění metabolizmu LDL-cholesterolu

PCSK9 - its tole in the treatment of LDL metabolism disorders

Bláha V.

III. interní gerontometabolická klinika Lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice, Sokolská 581, 500 05 Hradec Králové

e-mail: blaha@lfhk.cuni.cz

Proprotein konvertáza subtilisin/kexin typu 9 (PCSK9) je protein rozhodujícího významu v metabolismu LDL cholesterolu, neboť má klíčovou úlohu v procesu degradace LDL receptoru. Řada experimentálních studií in vitro i klinických studií in vivo z posledních let významně přispěla k objasnění úlohy PCSK9 v humánní biologii a patologii. PCSK9 po vazbě na LDL receptor navozuje degradaci LDL receptoru v lysosomech. Aktivitu PCSK9 určuje hlavně jaterní clearance plasmatického LDL. V širším evolučním slova smyslu funkce PCSK9 zasahuje i do dalších dějů v metabolismu lipoproteinů. Cirkulující PCSK9 se váže na apolipoprotein B100 částic LDL cholesterolu, což inhibuje vazebnou schopnost PCSK9 na LDL receptory povrchu buněk. Negativní zpětnovazebná regulace sekreční aktivity PCSK9 prostřednictvím LDL ovlivňuje remodelaci lipoproteinů. Na expresi PCSK9 v hepatocytech mají vliv nutriční a hormonální signály a akutní zánět. Ačkoliv byl význam PCSK9 objeven relativně nedávno - teprve v roce 2003, představuje inhibice PCSK9 zcela nový terapeutický prostředek v léčbě zvýšených koncentrací LDL-C. Dostupná data z klinických studií prokazují, že PCSK9 inhibitory představují novou a slibnou léčebnou modalitu v léčbě dyslipidémií a s ní asociovaných kardiovaskulárních onemocnění.

Práce byla podpořena projekty IGA MZ ČR NT/12287-5 a PRVOUK P 37/12 LF UK Hradec Králové.

B6-2

Lp-PLA2 a Lp(a) - co si počít s výsledky měření?

LP-PLA2 and LP(a) – what to do with the results of measurement

Vrablík M.

Abstrakt nedodán.

B6-3

LDL-cholesterol nebo apolipoprotein B?

LDL-cholesterol or apolipoprotein B?

Soška V.

Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice U sv. Anny v Brně

e-mail: vladimir.soska@fnusa.cz

Cíl: porovnat klinickou využitelnost LDL-cholesterolu ve srovnání s apolipoproteinem B.

Metody: přehledový referát vycházející z recentních publikací a odborných doporučení.

Výsledky: jsou porovnány výhody a nevýhody využití LDL-cholesterolu a apolipoproteinu B v diagnostice dyslipidémií, odhadu individuálního rizika kardiovaskulárních onemocnění, posuzování indikace k léčbě hypolipidemiky a k hodnocení účinnosti léčby z hlediska dosahování tzv. cílových hodnot. Diskutovány jsou dále možnosti, jak využít v určitých klinických situacích jako jejich náhradu či zpřesnění informací i další měřené nebo vypočtené parametry, jako je non HDL-cholesterol, celkový cholesterol, HDL-cholesterol a poměr celkový cholesterol/HDL-cholesterol. U vypočteného LDL-cholesterolu jsou porovnány výhody a nevýhody klasického vzorce podle Friedewalda s nověji navrhovanými způsoby jeho výpočtu.

Závěry: i přes zlepšující se kvalitu a pokrok ve standardizaci apolipoproteinu B a metod přímého měření LDL-cholesterolu zůstává LDL-cholesterol, vypočtený vzorcem podle Friedewalda, stále velmi rozšířeným laboratorním parametrem, standardně používaným pro klinické studie i běžnou klinickou praxi.

B6-4

Kam dospěla standardizace měření LDL cholesterolu, apolipoproteinu B a lipoproteinu (a)

Standardization of LDL cholesterol, apolipoprotein B and lipoprotein (a) measurements: current state

Novotný D.¹, Budina M.²

¹Oddělení klinické biochemie, Fakultní nemocnice Olomouc; ²SEKK s.r.o., Pardubice

e-mail: dalibor.novotny@fnol.cz

Cíl: Přednáška podává přehled současného stavu standardizace stanovení uvedených lipidových a lipoproteinových parametrů, včetně významu pro harmonizaci laboratorních výsledků a problémů při měření analytů v rutinní praxi.

Metody: Sdělení je koncipováno jako přehledový souhrnný referát.

Výsledky: Jsou uvedeny základní principy standardizace stanovení LDL cholesterolu, apolipoproteinu B a lipoproteinu (a), včetně referenčních systémů. Dále jsou diskutovány aspekty stanovení LDL cholesterolu tzv. homogenními metodami, zejména u dyslipidemických pacientů, využití výpočtových metod pro rutinní diagnostiku a jejich limitujících omezení. V rámci sdělení autoři popisují vývoj standardizace lipoproteinu (a) a všímají si mj. i možného klinického dopadu zavádění metod navázaných na referenční materiál WHO SRM2B do rutinní praxe. Jsou rovněž prezentovány výsledky dotazníkové akce provedené v rámci cyklu SEKK RFA1/2015, která mapovala situaci v oblasti laboratorní interpretace lipidových parametrů.

Závěry: I přes uspokojivou relativní úspěšnost stanovení LDL cholesterolu, apolipoproteinu B a lepšící se kvalitu měření lipoproteinu (a) v cyklech mezilaboratorního porovnání zkoušek existuje řada problémů, které je nutné mít při stanovení těchto analytů na paměti.

B7-1

Automatizace po roce 2000

Automation after the year 2000

Štern P.

e-mail: petr.stern@atlas.cz

Automatizované prvky našich analytických linek mají dva až tři stupně volnosti, zatímco robot by měl mít alespoň schopnosti lidské ruky, tj. pět stupňů volnosti. Klíčové faktory ovlivňující budoucnost klinické biochemie jsou pokrok v automatizaci, konvergence technologií a snížení potřeby statimových analyzátorů. Z toho vyplývá výroba zařízení pro mezioborové použití a školení personálu pro mezioborovou práci. Při nákupu automatické linky nutno vzít v úvahu, mimo jiné, pracovní náplň v dalších třech až pěti letech. Úplná automatizace zpracuje alespoň 80 % pracovní zátěže. Jak velký spojený systém, tak konfigurace několika menších modulů mají své výhody i nevýhody. Používání dopravníků je rentabilní při analýze alespoň 500 vzorků denně. Externí chyby v preanalytické fázi převažují nad laboratorními chybami v preanalytice. Přestože je výčet chyb preanalytické jednotky značný, je jejich četnost malá. Preanalytická stanice dosahuje optimální funkce v sériích 200 a více vzorků. Automatická centrifugace a dávkovač do sekundárních zkumavek jsou předpokladem efektivní preanalytiky (představuje 60 % času laboratorního procesu). Biochemický analyzátor by měl být částečně otevřený. 75 % chyb analyzátoru je v referenčním intervalu a zůstanou nepoznané. LIS by měly zajišťovat alespoň dva počítače, přičemž každý z nich by měl být schopný zvládnout celou pracovní zátěž. Výhledy do roku 2035 předpokládají vývoj technologií, které sníží cenu vyšetření a spojení POCT s telemedicínou. Nižší ceny lze dosáhnout seskupením vyšetření (např. průtoková mikroanalýza na destičkách), nebo nanolitrovou imunoanalýzou. Uvažuje se také o zařazení LC-MS/MS do automatizovaných linek. Vyžaduje to velké investice, a dosud se jen 20 % výrobců MS zabývá aplikacemi pro klinickou biochemii (MS představuje 1 % analýz KB). Automatizace není všelék, a když je špatně naplánovaná, nesplní očekávání (zvážit výhody, nevýhody, možnosti a rizika).

B7-2

Automatizace a robotizace laboratorních provozů ve velkých laboratořích - poslední trendy z pohledu společnosti Roche

Automation and robotization in a big laboratory -last trends from Roche perspective

Kopecký P., Klimíček I.

Roche s.r.o., Diagnostická divize

e-mail: petr.kopecky@roche.com

Hlavní produkty reprezentující inovaci v oblasti velkých laboratoří:

preanalytický systém cobas 8100,
nový výkonný imunochemický modul cobas e 801,
řídící software cobas IT middleware.

Preanalytický systém cobas 8100

Modulární systém provádějící všechny preanalytické kroky. Využívá 3D inteligentní dvousměrný transportní systém, jehož dráhy vedou ve dvou úrovních, což zajišťuje vysokou propustnost.

Má velmi vysoký výkon při přepočtení na jednotku plochy, kterou zabírá. Cobas 8100 lze připojit k analyzátorům cobas pro klinickou chemii, imunoanalýzu, koagulační vyšetření, močovou analýzu, hematologii a k modulu pro archivaci vzorků.

Software cobas IT middleware

Jedná se o novou generaci middleware produktů Roche. Je to integrační prvek, který je z hlediska datových a řídících procesů pro pohyb vzorku umístěn mezi LIS a preanalytické, analytické a postanalytické systémy. Připojené analyzátory mohou být různých typů a od různých dodavatelů. Z hlediska distribuce vzorků zajišťuje řízení pohybu primárního vzorku, vytváření a distribuci aliquotů v automatickém i v manuálním provozu a archivaci. Pro správu dat se pak používají moduly pro kontrolu kvality, automatickou validaci výsledků a statistiku laboratoře.

Imunochemický modul cobas e 801

Rodina nejvyšší výkonové řady cobas 8000 bude v průběhu příštího roku rozšířena o imunochemický modul s názvem cobas e 801, který bude možné libovolně kombinovat s ostatními zástupci této série. Systém bude založen opět na osvědčené technologii elektrochemiluminiscence a také na reagenčním, kalibračním a kontrolním konceptu shodném s jeho současníky řady cobas e. Dosahuje téměř dvojnásobného výkonu – 300 testů/hod. na stejném počtu cel a stejné ploše jako cobas e 602 a má zároveň možnost analýzy až 48 parametrů v rámci jednoho modulu. Má možnost průběžného doplňování reagencií a spotřebního materiálu za provozu.

B7-3

Možnosti automatizace pro různé segmenty laboratoří

Automation for various lab size

Čech M.

Siemens Healthcare Diagnostics

e-mail: michal.cech@siemens.com

Společnost Siemens nabízí široké možnosti automatizace laboratorního provozu: od bezpásové automatizace propojením až tří analyzátorů pomocí systému VersaCell X3 až po linku Aptio s plným spektrem pre- a post- analytických modulů a propojením analytických systémů pomocí dopravníků.

Řešení VersaCell X3 spojuje až tři analyzátory Siemens přes jediné robotické rozhraní. Díky řízení vzorku jedním dotekem mohou laboratoře konsolidovat a přizpůsobovat výběr biochemických, imunochemických i integrovaných systémů a související nabídku metod. Výsledkem je robustní řešení, které podporuje nárůst produktivity, rychlejší a předvídatelnější TAT a zjednodušené pre- a post- analytické procesy.

Aptio nabízí konfigurace, které se hodí téměř do každé laboratoře. Široká nabídka zapojitelných přístrojů Siemens usnadňuje zavedení nebo expanzi mezioborových testů. Velký rozsah dostupných pre- a post-analytických modulů dále zvyšuje efektivitu Vaší laboratoře. Flexibilita automatické linky Aptio umožňuje postupné zavádění ve fázích k hladké adaptaci na potřeby v budoucnu. Aptio poskytuje kapacitu pro vysoký výkon k optimalizovanému průběhu práce a konzistentní průchodnost k zajištění požadovaného času k vydání výsledku u všech vzorků. Možnosti hromadného vstupu vzorků podporují různorodost příchodu vzorků a nastavení jejich vstupu. Aptio kombinuje rutinní a statimové požadavky pro vydávání výsledků v souladu se specifickými laboratorními standardy a spotřebami. Aptio nabízí adaptabilní konfigurace s využitím následujících modulů pro jakýkoli typ laboratoře — od oblastních po univerzitní nemocnice, referenční, komerční, privátní a speciální laboratoře.

B7-4

Redukce chybovosti a optimalizace pre- a postanalytické práce se vzorky pomocí systému INDEXOR

Reduction of error rate and optimalization of pre- and postanalytical work with samples by the INDEXOR system

Humpl M.

Abbott Laboratories

Firma Abbott Laboratories uvedla na trh zařízení INDEXOR Sorter System, které pracovníkům laboratoří zjednodušuje manipulaci se vzorky v pre-analytické i v post-analytické fázi. Zařízení slouží především k optimalizaci manuální práce se vzorky, čímž přispívá k redukci chybovosti, úspoře času a zvýšení efektivity laboratoře (TAT). INDEXOR System se skládá z PC s dotykovou obrazovkou, čtečky čárového kódu a až 16 modulů se čtečkou RFID čipů, do kterých se vkládají stojánky na zkumavky označené unikátními RFID štítky. Tyto moduly dále obsahují červené led diody umístěné pod každou pozicí zkumavky vložené ve stojánku a tlakové senzory zaznamenávající přítomnost vložené zkumavky. Diody slouží obsluze k rychlému nalezení konkrétních zkumavek tím, že po zadání požadavku na vyhledání začnou hledané zkumavky postupně blikat. Do jednoho INDEXOR modulu lze postupně vkládat neomezeně velké množství INDEXOR stojánků za předpokladu, že každý stojánek je označen unikátním RFID čipem. Software zařízení INDEXOR v pre-analytické a analytické fázi neustále komunikuje s LIS, díky čemuž má vždy přehled o stavu zpracovaných vyšetření z dané zkumavky. Obsluze tak říká, do kterých analyzátorů je třeba vzorek ještě vložit. Zařízení generuje „Worklisty“, které seskupují aktuálně vložené zkumavky s nevyřízenými požadavky na vyšetření pro dané analyzátory. Poté, co jsou všechna požadovaná vyšetření ze vzorku provedena, zařízení pracovníkům laboratoře umožní archivaci vzorků v originálních INDEXOR stojáncích. Využití zařízení INDEXOR v post-analytické fázi spočívá především v eliminaci zdlouhavého vyhledávání archivovaných vzorků – INDEXOR má neustále přehled o tom, ve kterém stojánku, na jaké pozici, se jakýkoli laboratorní vzorek nachází. Praktické zkušenosti se zařízením INDEXOR Sorter System u nás ukazují, že v laboratorním provozu skutečně došlo k významnému zlepšení organizace práce se vzorky v pre- i post-analytické fázi, k redukci chybovosti, úspoře času i práce, a tudíž ke zvýšení celkové efektivity laboratoře (TAT). Zařízení je vhodné pro malé, střední i velké laboratoře, kde je potřeba manuální práce se vzorky.

B7-5

Nové trendy v automatizaci Beckman Coulter

New trends in Beckman Coulter automation

Bischof M.

Beckmann Coulter

Abstrakt nedodán.

B7-6

Elektronická žádanka – krok k automatizaci přijetí laboratorního vzorku

Electronic requisition - a step towards automating acceptance of the laboratory sample

Stávek P., Táborský L.

IKEM Praha, Nemocnice Na Homolce

e-mail: petr.stavek@ikem.cz

Jedním z důležitých procesů preanalytické fáze je registrace laboratorního vzorku do LIS tj. zadání potřebných dat – identifikačních údajů pacienta, typ a vlastnosti vzorku, požadované analyty atd. Při manuálním zpracování vyžaduje tato činnost nezanedbatelný čas a navíc jsou zde rizika vzniku chyb. Proces je možné automatizovat zavedením elektronické žádanky spolu se značením vzorků čárovým kódem v místě odběru.

První použití elektronických žádanek v českých laboratořích se datuje do 2. poloviny 90. let. Přesto do dnešního dne nedošlo k takovému rozšíření, které by odpovídalo aktuálnímu stavu dostupných technologií. Přitom zavedení elektronické žádanky řeší největší slabiny oproti manuálnímu příjmu vzorku - je rychlejší a vylučuje chyby přepisu. Mimo to je vhodně koncipovaná aplikace tvorby požadavku schopna eliminovat další chyby již v místě odběru. Lze kontrolovat správnost a kompletnost nutných údajů, množství potřebného materiálu, určit typ odběrových zkumavek, upozornit na výjimečné podmínky odběru některých analytů. Při správné spolupráci s LIS pak lze ihned při registraci vzorku, která se omezí na pouhé pípnutí scaneru, tento automaticky zatřídit, upozornit na výjimečné analyty, na nedodržení časových posloupností atd. Mimo to je zcela přesně zaznamenáno kdy, kdo a co – zadání, uzavření a odeslání žádanky, čas náběru, přijetí vzorku v laboratoři.

Přehledná přednáška je shrnutím dlouholetého vývoje a používání aplikace pro tvorbu elektronické žádanky v Nemocnici na Homolce a IKEM Praha. U jednotlivých kroků, od odběru vzorku až po jeho přijetí laboratoří, jsou pak rozebrány možnosti řešení, které by měly co nejvíce urychlit a zefektivnit tuto část preanalytické fáze zpracování laboratorního vzorku.

B8-1

Odpovědnost laboratoří za systémy POCT - Příklad z Finska

Laboratories responsibility of POCT – Example from Finland

Wahlstedt J.

Labquality Finland

e-mail: Juha.Wahlstedt@labquality.fi

Point-of-care testing is spreading out everywhere in Europe. At the same time the number of clinical laboratories is decreasing due to consolidation and international private laboratory chains. Huge analyzers and automated sample processing make consolidation economically tempting, but everything cannot be centralized. Specimen collection and emergency analytics have to stay near patient. There is a great need for point-of-care testing and it is growing out of control.

An increasing number of decisions concerning patient care and diagnosis are based on point-of-care test results. Therefore the results of rapid tests have to be as reliable and as accurate as traditional laboratory tests and the quality requirements have to be set on the same level. But how can we organize users training, orientation, instrument selection and validation, internal and external quality assessment? How we build the quality system and according to which standard?

By means of legislation and recommendations point-of-care test users can be forced to use controls and participate to external quality assessment programs, but reporting and certifying the results from analytical phase of the test doesn´t tell the full story of the whole testing process. Most of the errors in point-of-care testing occur in preanalytical phase, especially in spe-cimen collection and specimen handling. To be able to ensure the quality of point-of-care testing, we need trained laboratory professionals and multi-professional co-operation.

B8-2

Systémy POCT a jejich výsledky v EHK

Results of POCT systems in EQA

Budina M.

SEKK s.r.o., Pardubice

e-mail: budina@sekk.cz

Programů EHK se v současné době účastní i celá řada pracovišť, která své výsledky měření získávají na systémech POCT. Mezi tyto účastníky patří uživatelé POCT systémů z řad praktických lékařů, jednotlivá oddělení nemocnic i běžné laboratoře.

Mezi programy EHK, kterých se účastní větší počet uživatelů systémů POCT, patří zejména tyto: Parametry acidobazické rovnováhy, Stanovení CRP, D Dimery, Stanovení glukózy, Glykovaný hemoglobin, Kardiální markery, Analýza moče testovacími proužky, Okultní krvácení, Hemokoagulační stanovení (protrombinový test) a Sedimentační rychlost erytrocytů.

V některých případech je možné srovnávat výkon účastníků, kteří použili POCT systémy, s výkonem laboratoří, a to buď nepřímo (na základě porovnání rozptylu výsledků nebo celkové úspěšnosti v podobných cyklech), nebo i přímo (tehdy, pokud byly pro obě skupiny účastníků použity shodné vzorky).

Zásadní otázkou, kterou je v případě systémů POCT a jejich účasti v EHK nutné řešit, jsou vhodné vzorky. V řadě případů vzorky, které se v EHK standardně používají, nejsou pro některé systémy POCT použitelné. V takových případech je nutné hledat pro určité systémy speciální vzorky a setkali jsme se již s případy, kde se vhodné vzorky najít nepodařilo, a tudíž nebylo možné daný systém do EHK zařadit právě z důvodu neexistence vzorků vhodných pro EHK.

Poměrně velký problém v případě uživatelů POCT představuje i řídká účast v EHK a na ni navazující větší počet formálních chyb a nedopatření při odesílání výsledků poskytovateli. Pravděpodobně ze stejného důvodu uživatelé POCT také preferují zasílání výsledků na papíře před použitím webové aplikace Cibule (v duchu: nestojí mi za to učit se tu aplikaci ovládat), a tím se sami připravují o některé výhody, které použití Cibule přináší (kontrola hrubých chyb, chybějících dat apod.).

V rámci sdělení bude výše uvedené dokumentováno praktickými ukázkami a přehledy dat z různých programů EHK.

B8-3

POCT analýza FIT testů pro screening KRCA v České republice

POCT analysis of FIT tests for CRC screening in the Czech republic

Kocna P.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, VFN Praha

e-mail: kocna@lf1.cuni.cz

Riziko karcinomu tlustého střeva v populaci v České republice trvale narůstá a v roce 2010 dosáhlo hodnoty 80/100 tisíc obyvatel. V celopopulačním screeningu má význam nejen výtěžnost ověřená na principu vědeckých důkazů, ale také cena a způsob provedení, který musí být pro většinu populace dobře přijatelné. Doporučení EU zahrnuje i podmínky zajištění kvality, včetně systému externí kontroly kvality-EQAS.

POCT analýza zahrnuje provádění testů v místě péče o pacienta. Výhodou je snížení doby odezvy a okamžitý kontakt s pacientem. Nevýhodou je vyšší cena analýzy při porovnání s laboratorním provozem. POCT analýza zahrnuje při screeningu KRCA testy kvalitativní (hodnocené subjektivně) i kvantitativní. Kvalitativní rapid testy používá 66 % praktických lékařů podle statistiky z března 2014. Kvalitativní testy jsou kritizovány především pro vysokou falešnou pozitivitu, která je na rozdíl od individuální diagnostiky v populačním screeningu větším rizikem než falešná negativita, vede ke zvyšování nákladů, zbytečnému vyšetřování a negativnímu ovlivnění kvality života zdravých lidí. Kritikou pro populační screening v ČR je pak navíc možnost používat libovolné FIT testy se značně rozdílnou senzitivitou.

Stanovení Hb ve stolici kvantitativní imunochemickou technologií je v současné době nejpřesnější metodou stanovení okultního krvácení, vhodnou pro screening KRCA. Kvantitativní analýza umožňuje definovat optimální cut-off hodnotu a nabízí možnost zahrnout hodnoty FIT testu do rizika algoritmu KRCA screeningu. Systém externí kontroly kvality je dostupný od ledna 2012 ve dvou variantách, včetně POCT. Posledního cyklu v říjnu 2014 se účastnilo již 82 pracovišť, provádějících kvantitativní FIT. Variabilita FIT testů (CV) je 8,37-14,49 % při laboratorní analýze a 28,65-63,88 % při POCT.