Neurofilamenta u traumatického poškození mozku – současné znalosti

Súhrn

Neurofilamenta jsou neurocytoskeletální struktury, soustředěné zejména v axonech neuronů. Změny hladin neurofilament v biologických tekutinách jsou studovány u různých neurologických onemocnění. V tomto přehledném článku jsou uváděny poznatky ze studií věnovaných stanovení jednotlivých řetězců neurofilament v mozkomíšním moku a v séru u pacientů s poraněním mozku. Hladiny neurofilament se po úrazu mozku signifikantně zvyšují ve srovnání s kontrolními skupinami. Na rozdíl od některých jiných biomarkerů (např. protein S100b), jejichž hladiny dosahují vrcholových hodnot během 1 až 2 dnů po úrazu, neurofilamenta vrcholí po více než jednom týdnu. Výsledky studií u pacientů s těžkým i mírným poraněním mozku naznačují, že vyšetřování neurofilament by mohlo mít i prognostický potenciál.

Na základě povzbudivých výsledků dosavadních studií se zdá, že vyšetření neurofilament v séru, popř. mozkomíšním moku by mohlo představovat vhodný test, který by přispěl k odhadu závažnosti úrazu a prognózy u poranění CNS. Stanovení neurofilament v séru by doplňovalo vyšetření dosavadních biomarkerů neurotraumatu a stejně tak i zobrazovací vyšetřovací metody.

Klíčová slova:

neurofilamenta – mozkomíšní mok – sérum – traumatické poškození mozku.

Úvod

Akutní poškození mozku zahrnuje závažné stavy končící smrtí nebo zanechávající trvalé zdravotní následky. Hlavními příčinami akutního poškození mozku bývá úraz nebo cerebrovaskulární onemocnění.

Poranění mozku jako následek úrazu patří k významným příčinám mortality a morbidity u dospělých i u dětí. V diagnostickém procesu zaujímají významné místo zobrazovací metody, ale k diagnóze mohou přispět i biochemická vyšetření. Při poškození mozku narůstají v mozkomíšním moku i séru hladiny různých proteinů. Jedním z nich je neuron-specifická enoláza, jejíž zvýšené hladiny jsou popisovány nejen u neurotraumatu, ale i u cévních mozkových příhod, nebo protein 14-3-3, prokazatelný u různých neurologických onemocnění spojených s rozpadem neuronů [1, 2]. V současnosti se stanovuje protein S100b, jehož tkáňová specifita není ale omezena pouze na nervovou tkáň [3, 4]. Cenné informace o destrukci nervové tkáně může přinést i vyšetření méně specifických, ale běžně dostupných analytů jako jsou některé enzymy (aspartátaminotransferáza, laktátdehydrogenáza nebo kreatinkináza a její izoenzym CK-BB) [5-7].

Stále se hledají další biochemické ukazatele poškození mozku traumatem, jejichž využití by mohlo být užitečné v upřesnění diagnózy, závažnosti poranění i posouzení prognózy [8].

Jsou studovány různé proteiny, zejména ty, které jsou specifické pro nervovou tkáň. Ze znalostí patofyzio-logických dějů spojených s úrazem mozku vyplývá, že vhodnými kandidáty na biomarkery neurotraumatu jsou neurocytoskeletální struktury. Významným patofyzio-logickým projevem poškození mozku v důsledku úrazu je difúzní axonální poranění (DAP), které ovlivňuje konečný klinický výsledek. DAP se po mechanickém inzultu postupně vyvíjí a prochází několika stádii. Je spojeno s narušením struktury axonů, charakterizovaném zprvu reverzibilními poruchami neurocyto-skeletu a později doprovázeném proteolýzou hojně zastoupených cytoskeletálních struktur [9]. Součásti neurocytoskeletu jako jsou řetězce neurofilament, popř. jejich degradační produkty, se mohou uvolňovat z poškozených axonů a vstupovat do extracelulární tekutiny [10].

Struktura neurofilament vykazuje uspořádání typické pro střední filamenta. Na jejich polymerní struktuře se účastní tři základní součásti, kterými jsou lehké (NFL), střední (NFM) a těžké řetězce (NFH) označované jako neurofilamentový triplet [11].

Poruchy neurofilament jsou popisovány u různých neurologických chorob. Zahrnují změny struktury, které jsou podmíněné mutací genů pro neurofilamentové řetězce nebo abnormálními posttranslačními modifikacemi. Často jsou spojené s akumulací neurofilament (např. Charcot-Marie-Tooth choroby, amyotrofická laterální skleróza, Alzheimerova nemoc) [12, 13]. Při poškození axonů nebo jejich degeneraci může docházet k dezintegraci neurofilament. Jednotlivé řetězce se uvolňují z cytoskeletálních struktur a po přestupu do mozkomíšního moku (MMM) a krve mohou být jejich hladiny vyšetřovány [11].

Klinickým přínosem stanovení jednotlivých řetězců neurofilament v mozkomíšním moku i v séru po traumatu mozku se již zabývala řada studií. Nespornou výhodou neurofilament je jejich specifita pro nervovou tkáň na rozdíl od jiných proteinů rovněž analyzovaných u pacientů s traumatickým poškozením mozku.

Lehké řetězce neurofilament u poranění mozku

Dosud publikované studie zaměřené na stanovení NFL u poranění mozku poskytují informace o jejich hladinách v extracelulární tekutině poškozeného mozku, mozkomíšním moku a v séru (Tabulka 1).

Magnoni et al. [14] testovali hladiny NFL společně s proteinem tau a amyloidem β u 16 pacientů s těžkým traumatickým poškozením mozku. Stanovení proteinů bylo prováděno v extracelulární tekutině poškozeného mozku získané prostřednictvím mikrodialýzy. Jde o metodu využívanou v neurotraumatologii, pomocí níž se získávají vzorky extracelulární tekutiny v mozkové tkáni pro vyšetření různých analytů [15]. Dle očekávání byly hladiny NFL vyšší u pacientů, u nichž byl mikrodialyzační katétr uložen blízko oblasti kontuze. Iatrogenní trauma mozkové tkáně při zavádění katétru autoři považují za málo pravděpodobné. V porovnání s proteinem tau vykazovaly hladiny NFL vyšší variabi-litu, ale dynamika obou proteinů byla charakterizována poklesem v průběhu několikadenního sledování. Studie naznačila, že NFL a protein tau mohou doplnit informace o stavu bílé mozkové hmoty po traumatu.

V další studii byly hladiny NFL v MMM, ale i v séru analyzovány retrospektivně u větší kohorty pacientů s traumatickým poraněním mozku. Mezi nimi byly zastoupeny osoby s různě závažným traumatem mozku s převahou pacientů s hodnotami GCS (Glasgow Coma Scale) 3 – 8 [16]. Během prvních 15 dnů po neurotraumatu zůstávaly hladiny NFL v séru i v mozkomíšním moku u jednotlivých pacientů v tomto období poměrně stabilní. Sérové hladiny NFL, stejně jako protein S100b byly nezávislým prediktorem klinického výsledku traumatického poranění mozku hodnoceného pomocí GOS (Glasgow Outcome Score) v 6. – 12. měsíci po úrazu. Nebyl ale prokázán vztah mezi hladinami NFL a rozsahem difúzního axonálního poškození podle výsledků magnetické rezonance nebo poškozením hodnoceným pomocí CT (výpočetní tomografie). Absenci výše uvedeného vztahu autoři zdůvodňují heterogenitou souboru, ale i omezenými možnostmi neuroradiologických metod stanovit přesně rozsah axonálního poškození. Sérové hladiny slabě, ale významně korelovaly s hladinami v MMM.

V další dlouhodobé longitudinální studii byly analyzovány sérové hladiny NFL u 72 pacientů s těžkým poraněním mozku v prvních 12 dnech po úrazu a vzorek krve byl odebrán i po 12 měsících klinického sledování [17]. Na rozdíl od předchozí studie byla pro stanovení hladin NFL v séru použita řádově citlivější imunoanalytická metoda. Od pacientů, u nichž byla provedena ventrikulostomie, byly získány i vzorky MMM. V obou biologických tekutinách byly ve vzorcích odebraných v akutním stavu do 12. dne po úrazu hladiny NFL signifikantně zvýšené a v období sledování narůstaly (do 12. dne po úrazu). Diagnostická účinnost testu poskytovala velice dobré hodnoty – 97% citlivost a 96% specificitu. V průběhu roku po úrazu se sérové hladiny NFL vrátily k normálnímu rozmezí. Stanovení sérových hladin za 24 hodin po přijetí se jevilo jako přínosné i z hlediska odhadu prognózy. NFL v séru byly signifikantně vyšší u pa-cientů, kteří nepřežili, a korelovaly s hodnotami GOS skóre zjišťovanými po jednom roce.

Dostupné jsou i informace o hladinách NFL u osob s lehkým poraněním mozku. Sportovci, kteří se věnují kontaktním sportům, představují skupinu jedinců vystavených opakovaným úderům do hlavy. Jedna z prvních prací se zaměřila na stanovení NFL v MMM společně s proteinem tau, gliálním fibrilárním kyselým proteinem a β amyloidem u malé skupiny 14 amatérských boxerů [18]. V období 7 – 10 dnů po zápase hodnoty NFL v MMM několikanásobně převyšovaly hladiny u kontrolní skupiny a zvýšení odráželo závažnost a počet úderů do hlavy. Zvýšení NFL v MMM bylo nejvýraznější ze všech testovaných biomarkerů. Během tříměsíčního přerušení sportovní aktivity hladiny výrazně poklesly, ale přesto zůstaly signifikantně vyšší než u kontrolní skupiny.

Pozdější studie sledovala přínos stanovení hladin NFL v mozkomíšním moku boxerů – olympioniků [19]. I v této studii se NFL jevily jako nejcitlivější biomarker axonálního poškození ve srovnání s dalšími mozkovými biomarkery. Hladiny NFL v MMM u boxerů, u nichž nedošlo ke ztrátě vědomí, s normálním neurologickým nálezem a bez strukturních změn při vyšetření magnetickou rezonancí, byly signifikantně zvýšené v průběhu 1. až 6. dne po posledním zápase. Zvýšení, i když menší, přetrvávalo dalších minimálně 14 dnů v období bez zápasů, což může svědčit o probíhajících neurodegenerativních změnách. Výše hladin NFL v MMM korelovala s odhadnutým rizikem poškození mozku v souvislosti s boxem. Na rozdíl od zvýšených hladin NFL v MMM ovlivnila opakovaná lehká traumata mozku výsledky pouze vybraných neuropsychologických testů (např. prodloužení jednoduchého reakčního času při neuropsychologickém vyšetření) [20].

Nárůst hladin NFL v mozkomíšním moku byl zaznamenán i u některých dalších sportů. U profesionálních hokejistů, u nichž po otřesu mozku přetrvávaly post-kontuzní příznaky déle než rok, bylo pozorováno signifikantní zvýšení NFL v MMM ve srovnání s hokejisty s rychlejším odezníváním symptomů nebo s kontrolní skupinou [21].

Na rozdíl od profesionálních hokejistů nebylo u amatérských fotbalistů 7 až 10 dnů po tréninku, který zahrnoval nácvik hlaviček, pozorováno zvýšení NFL v mozkomíšním moku v porovnání s kontrolní skupinou. Výše hladin NFL v MMM v této studii nebyla přesně kvantifikována vzhledem k tomu, že se pohybovaly pod detekčním limitem použité ELISA metody [22].

Dlouhodobější sledování vývoje hladin NFL u poranění hlavy u sportovců bylo publikováno ve formě kazuistiky jednoho boxera. MMM byl u něho odebrán dva týdny po zápase, v jehož průběhu došlo k bezvědomí. Téměř desetinásobně zvýšené hladiny NFL v MMM při prvním odběru se normalizovaly až ve 36. týdnu [23].

Cenné jsou výsledky nedávných studií, které uvádějí, že vzestup hladin NFL u závodníků v kontaktních sportech je prokazatelný nejen v MMM, ale i v séru [24, 25]. Stanovení sérových hladin NFL pomocí ultrasenzitivní imunoanalytické metody na bázi Simoa (Single Molecule Array) poskytlo podobnou informaci jako stanovení NFL v MMM [24]. U amatérských boxerů byly sérové hladiny NFL signifikantně vyšší v období mezi 7 až 10 dny po zápase ve srovnání s kontrolní skupinou a i po tříměsíčním klidovém období. Diagnostická efektivita stanovení NFL v séru po zápase i po klidovém období dosáhla vysokých hodnot (0,97 a 0,96) pro plochu pod ROC křivkou (Receiver Operating Characte-ristic curve). V průběhu tříměsíčního přerušení závodní činnosti sérové hladiny NFL poklesly, ale stále zůstávaly signifikantně zvýšené v porovnání s kontrolní skupinou. Sérové hladiny diferencovaly i boxery podle závažnosti úderů do hlavy při zápase. Rovněž u kohorty profesionálních hokejistů s otřesem mozku byly zvýšené hladiny NFL ve vzorcích sér, které ve sledovaném období (1 až 144 hodin po otřesu) narůstaly zejména u hokejistů s pomalu odeznívajícími postkontuzními symptomy. Zvýšení NFL v séru bylo pozorováno i u dalších skupin sportovců vystavených poraněním hlavy jako jsou fotbalisté. Sérové hladiny NFL byly vyšší u hrajících fotbalistů ve srovnání s nehrajícími sportovci a zvyšovaly se v průběhu sezóny [25].

Těžké řetězce neurofilament u poranění mozku

Vyhodnocení přínosu stanovení NFH u poranění mozku bylo předmětem několika studií, které nám poskytují představu o jejich hladinách v různých biologických tekutinách (Tabulka 2).

U pacientů s těžkým poraněním mozku se v průběhu 24 až 96 hodin po úrazu zvyšovaly různě fosforylované formy NFH (pNFH) v MMM [26]. Hladiny pNFH narůstaly i v séru, i když dosažení vrcholových hladin nastalo později. V prvních 10 dnech po traumatu bylo difúzní axonální poškození mozku doprovázeno významnějším vzestupem hladin pNFH v séru ve srovnání s ložiskovým poraněním [27]. Výraznější vzestup u obou forem poranění byl pozorován mezi 4. až 10. dnem hospitalizace. Přítomnost expanzní kontuze neovlivňovala významně sérové koncentrace pNFH.

Podobné výsledky jako u dospělých pacientů byly získány i u dětí. U dětských pacientů po těžkém úrazu mozku se lišila dynamika sérových hladin pNFH podle prognózy [28]. U pacientů, kteří na následky úrazu zemřeli, byly sérové hladiny již od 1. dne po poranění vyšší a rychleji stoupaly do 3. dne a poté se již výrazně neměnily až do ukončení sledování, konkrétně do 6. dne. U dětí, které přežily, stoupaly hladiny pNFH v séru až od 2. dne a mírné zvyšování hladin pokračovalo do 6. dne sledování. Z výsledků ROC analýzy vyplynulo, že pro predikci špatné prognózy jsou vhodné výsledky hladin pNFH v séru vyšetřené 2. až 6. den po úrazu. Hladiny pNFH v séru byly signifikantně vyšší u skupiny dětí s hodnotou GOS = 1 (úmrtí) a u pacientů, u nichž vstupní CT zobrazilo difúzní axonální poškození [29].

U těžkých forem poranění mozku dosahují sérové hladiny pNFH vyšších hladin než u lehčího mozkového poranění [30]. Ve srovnání s kontrolami se signifikantní zvýšení sérových hladin pNFH, které negativně korelovaly s výsledky GCS skóre, projevilo i u lehkého traumatického poranění mozku v 1. a 3. dnu po traumatu [31]. Významně vyšší hladiny pNFH v séru byly zaznamenány u pacientů s pozitivním nálezem na CT provedeném 1. den ve srovnání s pacienty s negativními nálezy na CT. Rozdíl v hladinách pNFH v séru mezi skupinami s pozitivním a negativním výsledkem na CT přetrvával i 3. den, ale již nedosáhl statistické významnosti [31]. Přítomnost polytraumatu ani chirurgického ošetření neovlivňovala hladiny pNFH v séru [30]. Analogicky s dětskými pacienty i u dospělých nemocných sérové hladiny pNFH stanovené po úrazu poukázaly na možnost predikce dlouhodobějšího stavu pacientů po mozkovém traumatu [30].

NFH, i když v menší míře než NFL, byly také analyzovány u sportovců vystavených poraněním mozku. U boxerů bylo možné prokázat pomocí zvýšených hladin pNFH takové poškození mozku, které neodhalilo klinické vyšetření ani anamnestické údaje [32]. U skupiny 30 amatérských boxerů účastnících se vrcholových soutěží bylo zjištěno signifikantní zvýšení pNFH v MMM odebraném v rozmezí 1. až 6. dne po zápase. Po 14denním období, ve kterém byla přerušena závodní činnost, hladiny v MMM významně poklesly, ale stále byly signifikantně vyšší v porovnání s kontrolní skupinou. Na rozdíl od NFL výše hladin nekorelovala s počtem úderů do hlavy, které boxeři inkasovali v průběhu týdne před odběrem.

Střední řetězce neurofilament (NFM) u poranění mozku

O průběhu hladin NFM u poranění mozku máme podstatně méně informací než o NFL nebo NFH (Ta-bulka 2). V nedávné studii byly longitudinálně sledovány sérové hladiny NFM u pacientů s těžkým poraněním mozku [33]. Počáteční hladiny v séru byly signifikantně vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou, ale nediferencovaly mezi pacienty s příznivou a nepříznivou prognózou. Signifikantně zvýšené sérové hladiny NFM, i když méně výrazné, doprovázely i lehké poranění mozku. Podrobnější analýza ukázala na signifikantně vyšší sérové hladiny u pacientů s polytraumatem, ale negativním CT vyšetřením hlavy než u pacientů s izolovaným poraněním mozku a rovněž negativním CT hlavy. Podle autorů studie mohou k výraznějšímu zvýšení NFM u pacientů s polytraumatem přispívat i NFM uvolněné z periferních nervů poškozených při polytraumatu.

Diskuse a závěr

Neurofilamenta jsou struktury vyznačující se vyso-kou neuronální specifitou. Představují proto vhodné biomarkery pro poškození nervové tkáně, zejména axonů, v nichž se neurofilamenta soustřeďují [11, 13]. Hladiny jednotlivých řetězců neurofilament jsou již řadu let intenzivně zkoumány u různých neurologických onemocnění vyvolaných odlišnými patofyziologickými mechanismy, ale spojených s poškozením axonů [34-36]. Poškození CNS jako následek úrazu je jedním ze stavů, v nichž by stanovení neurofilament mohlo být přínosné.

Z dosud publikovaných studií vyplynuly informace o hladinách jednotlivých řetězců u těžkých i méně závažných poranění mozku. První studie se soustřeďovaly na vyšetřování NFL v mozkomíšním moku [18, 19]. V poslední době se zájem obrací na stanovení neurofilament v séru, neboť pro odběr krve není zapotřebí invazivní výkon. Po analytické stránce je vyšetřování sérových koncentrací obtížnější vzhledem k tomu, že v krevní cirkulaci se uvolněné řetězce neurofilament naředí. Hladiny neurofilament v séru jsou potom řádově nižší než v MMM a k přesnému stanovení jsou zapotřebí citlivější metody [37]. Vyvinutí vysoce citlivých imunoanalytických metod na bázi chemiluminiscence nebo Simoa umožnilo provedení studií, z nichž máme kvalitní informace i o změnách hladin v séru [24]. Tyto imunoanalytické metody poskytují přesné výsledky i pro nižší koncentrace, což přispívá ke zvýšení diagnostické účinnosti testu. Vzhledem k opakovaně zjišťovaným pozitivním korelacím mezi hladinami NFL v MMM a séru lze předpokládat, že výsledky klinických studií prováděných v různých biologických tekutinách budou obdobné [16, 24].

Hladiny neurofilament se po poranění mozku signifikantně zvyšují ve srovnání s kontrolními skupinami. Přetrvávání zvýšených hladin neurofilament delší dobu po úraze výrazně odlišuje neurofilamenta od jiných biomarkerů (např. protein S100b), jejichž hladiny dosahují maximálních hodnot během 1 až 2 dnů po úrazu [4]. Neurofilamenta vrcholí po více než jednom týdnu a jsou zvýšená v MMM i v séru minimálně 10 až 12 dnů [17]. Z toho vyplývá, že i hladiny NFL měřené v delším odstupu od úrazu, mohou odrážet rozsah počátečního děje vedoucího k poškození mozku na rozdíl od biomarkerů s kratším poločasem [16]. Na zvýšených hladinách ne-lze však vyloučit ani podíl neurodegenerativních změn probíhajících po úrazu.

Výsledky studií u pacientů s těžkým i mírným poraněním mozku naznačují, že vyšetřování neurofilament by mohlo mít i prognostický potenciál [17, 21, 28]. Stanovení neurofilament v séru by mohlo přispět ke zhodnocení závažnosti poranění mozku.

Výsledky studií u sportovců s vysokým rizikem poranění mozku ukazují, že i u osob s fyziologickým nálezem může opakovaná expozice drobnějším zraněním vyvolat změny v mozkové tkáni, dosud obtížně prokazatelné jinými metodami. Některé z mozkových biomarkerů, včetně neurofilament, by mohly být vhodné k monitorování minimálního poškození mozku, včetně odhadnutí délky období, po které by měl sportovec přerušit účast na zápasech a kdy by se stav mozkové tkáně normalizoval [19, 23]. Neurofilamenta by se mohla uplatnit i v péči o osoby, u nichž je zvýšené riziko opakovaných úrazů mozku.

Na základě dosavadních slibných výsledků a jejich potvrzením rozsáhlejšími prospektivními studiemi by vyšetření neurofilament v séru, popř. mozkomíšním moku, mohlo představovat nenáročný test využitelný k upřesnění diagnostiky a odhadu závažnosti úrazu a prognózy u neurotraumatu. Stanovení neurofilament v séru by doplňovalo vyšetření dosavadních biomarkerů a stejně tak i zobrazovací vyšetřovací metody.

Střet zájmů: Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Práce byla podpořena projekty PROGRES Q25 a MZ ČR – RVO VFN 64165, Všeobecná fakultní nemocnice v Praze.

Do redakce došlo 23. 10. 2017

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Lenka Fialová, CSc.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky,

1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze,

Kateřinská 32, 12108 Praha 2

E-mail: lfial@lf1.cuni.cz