Detekce opiátů v moči po jednorázovém požití máku setého v kuchyňské úpravě

Súhrn

Cíl studie: Česká republika patří k největším světovým producentům máku setého. Tato plodina je kromě medicínského využití součástí tradičních pokrmů. Mák setý obsahuje řadu alkaloidů, včetně morfinu a kodeinu. Cílem práce bylo zjistit, zda lze prokázat opiáty v moči po jednorázovém požití semen máku setého v potravinářské úpravě u souboru dobrovolníků.

Typ studie: prospektivní

Název a sídlo pracoviště: Psychiatrická a psychoterapeutická ambulance, Slovanská tř. 69, Plzeň,  MedAvante Inc., Smrková 23, Plzeň a Ústav klinické biochemie a hematologie LF UK a FN v Plzni

Materiál a metody: Opiáty v moči byly vyšetřeny kvalitativní a semikvantitativní imunochemickou metodou u 14 dobrovolníků 15 hodin po jednorázovém požití definovaného množství máku v makových koláčích. Byl sledován vztah mezi množstvím požití máku a koncentrací opiátů v moči.

Výsledky: U 12 osob byla prokázána přítomnost opiátů kvalitativním imunochemickým testem. Při užití semikvantitativního imunochemického testu byla zjištěna významná korelace mezi koncentrací opiátů v moči (po korekci na koncentraci kreatininu v moči) a množstvím požitého máku. U dvou jedinců byla zjištěna koncentrace opiátů vyšší než 300 μg/L, která je považována za pozitivní při kontrole osob závislých na opiátech.

Závěr: Na základě výsledků studie a na případu pacienta v bezvědomí s pozitivním nálezem opiátů v moči je ukázáno, že při hodnocení tohoto nálezu musíme vzít v úvahu vliv předchozího požití pečiva s obsahem máku. 

Klíčová slova:

mák setý – opiáty – morfin – kodein – imunochemické stanovení.

Úvod – kazuistika 

87letý pacient žijící v domově pro seniory, hypertonik, diabetik, trvale warfarinizovaný po plicní embolii, s kognitivním deficitem byl v pozdních nočních hodinách přijatý na neurologickou kliniku pro krátké bezvědomí s pádem bez úrazu hlavy; postupně se probíral. Podle zdravotnické dokumentace záchranné služby somnolentní, hypotenzní (90/50 mm Hg), subfebrilní 37 °C, s normální saturací hemoglobinu a glykémií. Primárně byl vyšetřen na interní ambulanci pro suspektní kolapsový stav, bez shledání interní příčiny obtíží. S cílem ozřejmit poruchu vědomí bylo provedeno i toxikologické vyšetření; poskytlo pozitivní výsledek – v moči byly prokázány opiáty (obr. 1). K vyšetření byl užit orientační imunochemický test (Multiparameter Dip Test, Ulti Med Products GmbH (Ahrensburg, Německo).

Pacient opiáty neužíval ani nebyly podány během transportu do nemocnice, k večeři však snědl talíř makových buchet. Pomocí LC-HRMS byly později v moči pacienta prokázány morfin, kodein, thebain a papaverin (RNDr. Petr Šimek, CSc., vedoucí Laboratoře analytické biochemie a metabolomiky, Oddělení biochemie a fyziologie, Entomologický ústav, Biologické centrum Akademie věd ČR, České Budějovice). Byl tedy potvrzen zdroj opiátů – mák v potravě.

Náš nemocný vzhledem k věku a anamnéze těžko připomínal toxikomana; jako příčina stavu byl odhalen objemný meningeom vpravo parietálně a pacient byl hospitalizován na neurologické klinice. Pokud by se podobná příhoda stala mladému jedinci či došlo ke kontrole toxikomana v odvykací léčbě nebo účastníka dopravní nehody, mohl by být názor na výsledek toxikologické analýzy zcela jiný.

Heroin a další opiáty jsou celosvětově jednou z nejčastěji zneužívaných psychoaktivních látek. V léčbě pacientů závislých na opiátech se rutinně provádí toxikologické vyšetření moči. U pacientů se místy vyskytuje tvrzení (anebo výmluva), že pozitivita opiátů v moči je způsobena požitím výrobků ze zralého máku (koláče a další výrobky). K dalším osobám, které mohou být testovány na přítomnost drog, patří nemocní s poruchou vědomí na oddělení akutního příjmu, účastníci dopravních nehod a sportovci v rámci antidopingových kontrol. Využití máku v potravinářství má v našich oblastech dlouholetou tradici a mák je součástí řady pokrmů. Mák setý však obsahuje i celou řadu alkaloidů, které spolu metabolicky souvisí (obr. 2); nejvýznamnější a farmakologicky nejúčinnější je skupina opiátů, především morfin, kodein a thebain [1]; logicky se objevuje otázka, zda může předchozí požití stravy s mákem vést k pozitivitě testu na opiáty v moči.

Ke stanovení opiátů jsou při prvém kontaktu obvykle používány orientační kvalitativní imunochemické testy, někdy doplněné semikvantitativní metodou na imunochemických analyzátorech. Jako biologický materiál slouží vzorek moči. Moeller a spol. prokázali orientačním imunochemickým testem opiáty v moči pěti dobrovolníků po požití různého množství makového pečiva [2]. Další autoři užili k vyšetření dobrovolníků po požití máku nebo potravin s mákem semikvantitativní imunochemické metody: EMIT [3 – 6], RIA [3, 4, 7, 8], FPIA [3, 9, 10] nebo CEDIA [11 – 13] a ve většině případů získali rovněž pozitivní výsledky. Protože imunochemické stanovení nerozliší jednotlivé opiáty, je třeba k odlišení toxikomanů užívajících morfin, kodein či dokonce heroin a pacientů léčených opiáty, přistoupit k chromatografické metodě: užívá se obvykle plynová či kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (GC/MS, LC/MS); tu užili téměř všichni citovaní autoři. Jako nezbytné doplnění imunochemického průkazu ho požaduje i Metodický pokyn pro postup při toxikologickém vyšetření specifikovaných návykových látek v krvi a/nebo v moči [14].

Cíl práce

Primárním cílem naší práce bylo ověření, zda po požití obvyklého množství potravin obsahujících mák lze v našich podmínkách v moči detekovat běžnými laboratorními metodami přítomnost opiátů. Jak bylo výše uvedeno, celá řada autorů prokázala imunochemickými (většinou semikvantitativními) testy přítomnost opiátů v moči různou dobu po požití makového pečiva. Na druhé straně v konzumovaném pečivu je obvykle poměrně málo máku a mák určený pro potravinářské účely v Evropské unii (a tedy i v České republice) patří mezi tzv. nízkomorfinové odrůdy [15].

Výběr a charakteristika souboru

Do studie bylo zařazeno 14 dobrovolníků (7 mužů a 7 žen) ve věku od 26 do 59 let, průměrný věk souboru byl 35,9 roku, hmotnost 55 – 120 kg. Jednalo se o dobrovolníky z řad lékařů Psychiatrické kliniky Fakultní nemocnice v Plzni, studenty Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Plzni a rodinné příslušníky. Za vylučující kritéria bylo považováno užívání nebo užití opiátů a požití potravin obsahujících mák v posledním týdnu před účastí ve studii. Studie byla schválena společnou etickou komisí Lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice v Plzni pod číslem 72/2011.

Metodika a časový plán

V experimentu jsme použili vlastní vyrobené koláče o obsahu máku 12 g/koláč v klasické úpravě. Použitý mák byl zakoupen v maloobchodě, země původu máku byla Česká republika; koncentrace opiátů v máku nebyla měřena. Dobrovolníci snědli libovolné množství makových koláčů (Tabulka 1) v odpoledních hodinách (mezi 15 a 17 h odpolední) a 15 hodin po požití máku (druhý den ráno) byl odebrán vzorek moči ke stanovení přítomnosti opiátů. Ranní moč byla zvolena vzhledem k její vyšší hustotě, a tím i větší pravděpodobnosti pozitivní detekce opiátů. Uspořádání studie navíc simuluje stav, kdy jedinec povečeří mák a ráno je jeho moč vyšetřena.  

Opiáty v moči byly stanoveny kvalitativní imunochemickou metodou, která je v praxi běžně užívána pro rychlé orientační vyšetření, a následně i semikvantitativní imunochemickou metodou. Dále byl sledován vztah mezi množstvím požitého máku a hladinou opiátů v moči po její korekci na koncentraci kreatininu.

Laboratorní vyšetření

Byly použity orientační testy k důkazu opiátů Drug Control Morphine (MOR) 300 µg/L od firmy Ulti Med Products GmbH (Ahrensburg, Německo). Jsou založeny na imunochromatografické metodě a jako mez detekce je uváděna koncentrace 300 μg/L. V příbalovém letáku se uvádí, že metoda stanovuje především morfin a kodein (reaktivita protilátky pro tyto alkaloidy je 100 %, pro thebain jen 5 %).

Ke stanovení koncentrace opiátů v moči byla použita souprava Opiates firmy Abbott Laboratories (Abbott Park, IL, USA), k měření byl užit analyzátor AxSYM téže firmy. Jedná se o fluorescenčně polarizační imunoanalýzu (FPIA). Za pozitivní výsledek je považována hladina opiátů nad 300 μg/L, mez stanovitelnosti je však značně nižší – 50 μg/L. I zde reaguje především morfin a kodein.

Ke stanovení kreatininu v moči byla užita souprava firmy Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Německo) pracující s Jaffého činidlem a analyzátor c 701 jako součást linky Cobas 8000 téže firmy.

Výsledky

Kvalitativní imunochemická metoda dala pozitivní výsledek u 12 ze 14 testovaných vzorků moči. Koncentrace nad 300 μg/L po požití máku byla prokázána semikvantitativní imunochemickou metodou u dvou jedinců, ostatní vzorky vyšetřených jedinců tuto hodnotu nepřekročily. Zdá se tedy, že mez detekce je u kvalitativního důkazu ve skutečnosti nižší, než uvádí firma. Výsledky při použití semikvantitativní imunochemické metody shrnuje Tabulka 1. Při hodnotě nad 300 μg/L je výsledek považován za pozitivní. U dvou pozitivních jedinců jsme provedli opakovaný odběr moči (po dalších 12 a 24 hodinách); s odstupem času došlo k poklesu hodnot a vzorky byly již negativní (Tabulka 2).

Při užití Spearmanovy pořadové korelace jsme prokázali významnou korelaci mezi množstvím požitého máku a hladinou opiátů v moči po korekci na koncentraci kreatininu v moči (obr. 3). Jedinci s pozitivním nálezem v moči požili nejvyšší množství máku.

Diskuse

V posledních letech došlo k nárůstu pěstování máku setého v České republice; v současnosti patří naše republika k největším evropským i světovým producentům této plodiny. Pěstování máku na ploše větší než 100 m² podléhá v ČR povinnému hlášení podle zákona č. 167/1998 Sb. Od r. 2014 začala platit Vyhláška č. 399/2013 Sb., vydaná podle zákona o potravinách, která v příloze č. 9 limituje obsah morfinových alkaloidů na nejvýše 25 mg/kg máku, neuvádí však výčet těchto alkaloidů [16]. Pod pojmem „morfinové alkaloidy“ se obvykle rozumí alkaloidy fenanthrenového typu (morfin, kodein, thebain). Vedle nich se v máku vyskytují také alkaloidy benzylizochinolinového typu (papaverin, noskapin) [17]. Limit 25 mg „morfiových alkaloidů“ uvedený ve vyhlášce nebyl stanoven s přímou vazbou na závěry z hodnocení zdravotních rizik, jde tedy o tzv. administrativní limit, vycházející z jiných poznatků, např. distribuce naměřených hodnot obsahu v máku. Na obsah morfinu a kodeinu v máku setém působí řada faktorů, které mohou následně ovlivnit i jejich detekci. Roli hraje nejen kvalita (zralost) máku, jeho druh (nízkomorfinové odrůdy pro potravinářské účely vs. odrůdy pro využití ve farmaceutickém průmyslu), klimatické podmínky, zpracování při sklizni, příměs tzv. makoviny [1], ale také doba vyšetření od jeho požití, kuchyňská úprava a další faktory ovlivňující laboratorní stanovení opiátů v moči, jako je možnost detekce jiných opiátů bez psychoaktivního vlivu, falešná pozitivita, hydratace nemocného s ovlivněním hustoty moči aj. [18]. Svou roli hraje i způsob přípravy potravin s mákem, který může obsah opiátů významně snížit až o 90 % [19].

Vzhledem k tomu, že mák i potraviny, ve kterých se používá, jsou tučné, trvá trávení delší dobu, evakuace žaludku může trvat několik hodin. Opiáty se vstřebávají v tenkém střevě, proto je nutné vyšetření moči provést v odstupu několika hodin, aby bylo možné opiáty již v moči detekovat. Pacient popsaný v kazuistice měl pozitivní nález opiátů v moči 6 h po požití makových buchet.

Studie, které byly dosud publikovány, měly někdy rozporuplné výsledky, většinou se však shodují v tom, že po požití máku lze v biologickém materiálu (obvykle v moči) přítomnost opiátů prokázat. Pettitt a spol. již v r. 1987 pozorovali po požití moučníku se 70 g máku opiáty v moči. Naměřili až koncentraci 4 500 µg/L, koncentrace > 300 µg/L přetrvávala 35 hodin; k vyšetření použili enzymovou imunoanalýzu (EMIT) [6]. Hayes a spol. prokázali opiáty v séru i moči (v koncentraci > 300 µg/L) metodou EMIT a RIA až 48 h po jídle: vyšetřili čtyři dobrovolníky po požití 25 g máku a dvě osoby po požití 40 g máku [4]. ElSohly a spol. vyšetřili dva muže a dvě ženy po požití jednoho, dvou a tří makových závinů; moč vyšetřovali až čtyři dny, vyšetřili celkem 264 vzorků – v 16 z nich byla koncentrace opiátů > 300 µg/L. Jako metodu užili tři druhy imunoanalýzy: RIA, EMIT a FPIA [3]. Selavka prokázal u dobrovolníků po různém pečivu s mákem v moči odebrané do 1 až 3 dnů po požití máku opiáty metodou RIA, v mnohých vzorcích byla koncentrace opiátů opět vyšší než 300 µg/L [8]. Angelo a spol. prokázali RIA metodou opiáty ve všech vzorcích moči, odebraných šesti a sedmi dobrovolníkům po požití 10 resp. 25 g máku [7]. Pelders a Ros měli jen jednoho dobrovolníka, kterému po požití 4 g máku prokázali opiáty v moči metodou FPIA, i když koncentrace nepřesáhla 300 µg/L [9]. Meadway a spol. vyšetřili čtyři osoby po požití různého množství pečiva s mákem: po větším množství pečiva byla koncentrace opiátů v moči stanovená metodou EMIT 6 h po jídle až 832 µg/L [5]. Moeller a spol. měli pět dobrovolníků, u nichž vyšetřili moč 4 h po požití různého množství makového pečiva; užili imunoanalýzu a opiáty prokázali v moči u všech dobrovolníků [2]. Smith a spol. podávali 22 dobrovolníkům 2 x 48 g máku v intervalu osmi hodin a sledovali metodou CEDIA vylučování opiátů močí; moč byla sbírána do 32 h po první dávce. Koncentrace opiátů v moči > 300 µg/L byla v 96 % vzorků vyšetřených metodou firmy Roche a v 91 % vzorků při užití souprav firmy Thermo Fisher [12]. Semano vyšetřil sliny a moč 12 osob v intervalech 2, 4, 6 a 20 h po požití asi 15 g máku syrového nebo v pečivu; koncentrace morfinu v moči dosáhla až 4 219 µg/L po syrovém máku a 1 408 µg/L po máku v pečivu; byla opět užita metoda CEDIA [13]. Jankovičová a spol. pozorovali pozitivní výsledek metodou FPIA u jednoho ze čtyř dobrovolníků 7 h po požití 100 g máku, nejvyšší koncentrace morfinu v moči byla 4 – 5 h po požití, a to 1788 µg/L; tytéž osoby po požití 50 g máku poskytly negativní výsledek [10]. Özbunar a spol. pozorovali u 10 dobrovolníků pozitivní nález opiátů metodou CEDIA v moči až 48 h po požití 100 g makové pasty [11].

Jak je z uvedeného patrné, různí autoři užili různé množství máku, syrového nebo v pečivu; rovněž doby odběru se dost lišily. Vyšetření prováděli různými imunoanalytickými metodami, GC/MS byla v některých případech užita pro konfirmaci výsledků. Jen někteří z autorů měřili koncentraci opiátů v máku; pohybovala se ve velmi širokém rozmezí: morfin 2 – 294 µg/g, kodein 0,4 – 57 µg/g. 

Cílem naší práce bylo určit, zda požití běžně dostupného potravinového máku může mít za následek pozitivní průkaz opiátů v moči běžnými imunochemickými testy. Nestanovovali jsme proto ani koncentraci opiátů v máku samotném, ani jsme výsledek neověřovali chromatografickou metodou.  

Naší studie se zúčastnilo 14 dobrovolníků, což je výrazně vyšší počet než ve většině ostatních studií. Za další výhodu našeho sledování považujeme i známé množství požitého máku vzhledem k vlastní přípravě pečiva. Použité množství máku bylo vyšší než v zakoupených výrobcích, nicméně se jednalo o stále běžně dostupné a stravitelné množství. Použitý mák byl zakoupen v prodejní maloobchodní síti a jeho odlišnost od vzorků z ostatních studií není pravděpodobná.

Nejprve jsme zvolili orientační kvalitativní testy, které se užívají i v praxi; negativní výsledek poskytly jen dva vzorky, u ostatních byl výsledek jasně pozitivní. Proto jsme výsledek ověřili druhou metodou, která poskytuje semikvantitativní výsledky, i když se rovněž jedná a imunochemickou detekci a tedy stanovuje se celá skupina opiátů. Zde se ukázalo, že hodnotu 300 μg/L  přesáhly jen dva vzorky. Ostatní výsledky lze tedy považovat za falešně pozitivní resp. orientační testy poskytují pozitivní výsledek i u nižší koncentrace opiátů, než uvádí výrobce.

Během naší studie jsme došli k závěrům, že po požití dostupné dávky máku setého v běžné kuchyňské úpravě lze detekovat orientační imunochemickou metodou opiáty v moči. Tyto výsledky závisí na množství požitého máku, obsahu opiátů v máku, odstupu vyšetření od požití, koncentrace moči, hmotnosti probanda, aktivitě enzymů metabolizujících opiáty, koncentraci moči dané různou hydratací nemocného a na použité laboratorní metodě [18, 20]. Možnost ovlivnění výsledku předchozím požitím pečiva s mákem tak musíme vzít v úvahu při hodnocení nálezu opiátů v moči u pacientů na oddělení akutního příjmu, u toxikomanů, řidičů i u sportovců při antidopingové kontrole [21]. Protože imunochemické stanovení nerozliší jednotlivé opiáty (i když je citlivost výrazně nejvyšší pro morfin a kodein), je třeba k odlišení toxikomanů užívajících morfin, kodein nebo dokonce heroin či pacientů léčených opiáty přistoupit k chromatografické metodě: užívá se obvykle plynová či kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií (GC/MS, LC/MS) [14]. Pro původ opiátu z máku svědčí průkaz jiných opiátů, především thebainu; analýza se však musí provést brzy po požití máku, protože thebain má velmi krátký biologický poločas, řádově v hodinách [22]. Pro heroin svědčí nález 6-acetylmorfinu, který má však také velmi krátký biologický poločas; hledají se i jiné metabolity, žádný však nemá ideální vlastnosti pro detekci delší dobu po expozici [23].

Závěr

Na základě výsledků studie a na případu pacienta v bezvědomí s pozitivním nálezem opiátů v moči při užití kvalitativní i semikvantitativní imunochemické metody je ukázáno, že při hodnocení tohoto nálezu musíme vzít v úvahu vliv předchozího požití pečiva s obsahem máku.

Poděkování

Rádi bychom poděkovali dobrovolníkům, kteří se experimentu zúčastnili, a RNDr. Petru Šimkovi, CSc. z Biologického centra Akademie věd ČR v Českých Budějovicích za provedení LC/MS analýzy vzorku pa-cienta uvedeného v kazuistice.

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Podpořeno Programem rozvoje vědních oborů Univerzity Karlovy (Progres Q39).

Adresa pro korespondenci:

prof. MUDr. Jaroslav Racek, DrSc.

Ústav klinické biochemie a hematologie

Lékařské fakulty UK a Fakultní nemocnice v Plzni

alej Svobody 80

304 60 Plzeň

e-mail: racek@fnplzen.cz