Pilotná analýza mutácií génov asociovaných s Lynchovym syndrómom u slovenských pacientov s rakovinou prsníka

Súhrn

Východiská: Lynchov syndróm (LS) je autozomálne dominantné dedičné ochorenie, ktoré sa prejavuje zvýšením rizika vzniku nádorových ochorení, a to predovšetkým kolorektálneho a endometriálneho karcinómu. Nedávne štúdie preukázali aj asociáciu medzi LS a nádorovým ochorením prsníka. Cieľom tejto štúdie je poukázať na možný výskyt prítomnosti mutácií v génoch asociovaných s LS u pacientov s rakovinou prsníka a na potrebu zahrnúť vyšetrenie Lynch asociovaných génov u pacientov s familiárnym a opakovaným výskytom rakoviny prsníka ako aj s výskytom ďalších Lynch asociovaných nádorových ochorení. Materiál a metódy: Analyzovali sme vzorky nádorového tkaniva od 78 pacientov s primárnym nádorom prsníka. U pacientov sme analyzovali panel génov asociovaný s rizikom vzniku rakoviny prsníka, pričom sme sa v rámci našej štúdie sústredili primárne na výskyt mutácií v mismatch-repair génoch. DNA izolovaná z nádorového tkaniva bola sekvenovaná pomocou metódy sekvenovania novej generácie (next generation sequencing – NGS) a podrobená analýze pomocou nástroja Ingenuity Variant Analysis. Na potvrdenie zárodočnej mutácie sme vyšetrili krvnú vzorku pacientky pomocou NGS. Výsledky: V rámci našej analýzy sa nám v nádorovom tkanive prsníka podarilo identifikovať variant v géne PMS2 u jednej pacientky. Prítomnosť mutácie naznačuje, že vzniknuté nádorové ochorenie môže byť následkom LS. Z hľadiska patogenity sa jednalo o pravdepodobne patogénny variant, nakoľko sme odhalili deléciu v exónovej oblasti, ktorá viedla k frameshift mutácii. Navyše sme identifikovali aj jednonukleotidové patogénne varianty v génoch TP53 a PIK3CA. Pre definitívne stanovenie diagnózy LS u pacientky sme vyšetrili krvnú vzorku, kde sme tiež identifikovali mutáciu génu PMS2. Záver: LS je u mnohých Lynch asociovaných nádorových ochorení poddiagnostikovaný. V prípade familiárneho výskytu rakoviny prsníka a ďalších Lynch asociovaných génov je však dôležité myslieť aj na možnú diagnózu LS a v prípade, že pacient spĺňa diagnostické kritéria, uskutočniť aj genetické vyšetrenie Lynch asociovaných génov.

Klíčová slova:

Lynchov syndróm – rakovina prsníka – MMR gény – MLH1 – MSH2 – MSH6 – PMS2

Úvod

Lynchov syndróm

Lynchov syndróm (LS) je autozomálne dominantné dedičné ochorenie, pri ktorom je typicky pozorovaná zárodočná mutácia v tzv. Lynch asociovaných génoch MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2 nazývaných mismatch-repair (MMR) gény. Tie sú zodpovedné za reparáciu chybne včlenených nukleotidov a tiež malých inzercií a delécií, vznikajúcich počas replikácie DNA [1]. To vedie k hromadeniu mutácií v genóme MMR deficientných buniek, pričom k najvýraznejšiemu prejavu dochádza v krátkych repetitívnych sekvenciách DNA tvoriacich tzv. mikrosatelity [2]. Mutácie MMR génov sú asociované so signifikantne zvýšeným rizikom vzniku kolorektálneho karcinómu (colorectal cancer – CRC) a endometriálneho karcinómu (endometrial cancer – EC). Okrem toho mutácie v MMR génoch vedú aj k zvýšenému riziku vzniku nádorov vaječníkov, tenkého čreva, urotelu, obličiek, mozgu, pečene, žlčových ciest a žalúdka, ktoré spoločne nazývame aj nádory asociované s LS [3].

Asociácia LS s rakovinou prsníka

Niektoré štúdie preukázali aj asociáciu medzi rakovinou prsníka a LS. Retrospektívna štúdia od Roberts et al z roku 2018, poukázala na prepojenie medzi Lynch asociovanými génmi MSH6 a PMS2 a rizikom vzniku rakoviny prsníka. V štúdii boli analyzované vzorky od vyše 50 000 pacientok, medzi ktorými detegovali mutáciu v MMR génoch u 423 z nich, pričom vyše 25 % z nich (107/423) malo počas života rakovinu prsníka. V rámci tejto štúdie boli najčastejšie objavené mutácie v už spomínaných génoch MSH6 (33,1 %) a PMS2 (29,3 %) [4]. Taktiež retrospektívna štúdia od Schwartz et al (2022) dokázala etiologické prepojenie medzi deficienciou MMR mechanizmu a vznikom rakoviny prsníka. Štúdia analyzovala vyše 20 000 pacientov oboch pohlaví s nádorovým ochorením, identifikovaných bolo 272 pacientov s LS, pričom 5 % z nich boli pacientky s nádorovým ochorením prsníka [5]. Vzhľadom na skutočnosť, že LS sa najčastejšie prejavuje vznikom kolorektálneho a endometriálneho karcinómu, uskutočňuje sa skríning deficiencie MMR génov najbežnejšie u pacientov postihnutých CRC a EC, v niektorých krajinách dokonca u všetkých pacientov, zatiaľ čo skríning LS pri ďalších Lynch asociovaných nádorových ochoreniach sa v klinickej praxi rutinne nevykonáva. To môže viesť k poddiagnostikovaniu LS pri jednotlivých typoch nádorových ochorení. [4]. Prevalencia LS v populácii sa odhaduje približne 1: 279 jedincov. U pacientov sa môže toto ochorenie prejaviť niektorým z Lynch asociovaných nádorových ochorení [6]. Z mnohých štúdií vyplýva, že zatiaľ čo pri CRC sú pozorované mutácie prevažne v génoch MLH1 a MSH2, so zvýšením rizika rakoviny prsníka sú asociované najmä mutácie génov PMS2 a MSH6 [4].

Význam diagnostiky LS u pacientov s rakovinou prsníka

Podľa celosvetovej štatistiky GLOBOCAN 2020 uverejnenej Medzinárodnou agentúrou pre výskum rakoviny, ktorá vypracováva štatistiky incidencie a mortality nádorových ochorení je rakovina prsníka pri vyše 2,25 milióna novodiagnostikovaných prípadoch z hľadiska incidencie na prvom mieste. Z hľadiska mortality nádorových ochorení sa rakovina prsníka nachádza celosvetovo na piatej priečke a tvorí pri celkovom počte necelých 685 tisíc, takmer 7 % z celkového počtu úmrtí na nádorové ochorenia [7]. Vzhľadom na celosvetový nárast incidencie aj mortality rakoviny prsníka stojí určite za zmienku výskum mutácií Lynch asociovaných génov u pacientok s anamnézou spĺňajúcou kritériá pre jeho diagnostiku. Problémom však často býva skutočnosť, že pre nedostatok času nie je u pacientok s rakovinou prsníka zisťovaná rodinná anamnéza dostatočne aj so zreteľom na výskyt iných nádorových ochorení. Pritom už len samotná hereditárna forma rakoviny prsníka býva v nezanedbateľnom množstve zapríčinená LS, na čo poukazuje štúdia autorov Nikitin et al (2020), kde bolo v rámci pozorovanej skupiny 711 pacientok s hereditárnou formou nádorového ochorenia prsníka identifikovaných až 32 pacientok s patogénnym alebo pravdepodobne patogénnym variantom MMR génov [8]. Rozhodli sme sa preto v rámci našej analýzy mutačného profilu zo vzoriek nádorového tkaniva prsníka od 78 slovenských pacientok s potvrdeným primárnym nádorovým ochorením prsníka zamerať aj na pilotný výskum prítomnosti mutácii v MMR génoch.

Materiál a metódy

Táto štúdia bola schválená Nezávislou etickou komisiou Národného onkologického ústavu na Slovensku (Bratislava, Slovenská republika). Pred zaradením do štúdie bol od každého účastníka získaný písomný informovaný súhlas.

V rámci nášho výskumu sme použili tkanivo primárneho nádoru prsníka od 78 pacientok s primárnym nádorom prsníka, ktoré boli súčasťou štúdie autorov Mego et al (2020) [9], odobraté počas operácie a následne uskladnené v tekutom dusíku. Jednalo sa o náhodný súbor pacientok s nádorovým ochorením prsníka v štádiách I–III, ktoré boli ochotné zúčastniť sa na štúdii, pričom pacientky podstúpili diagnostické vyšetrenia pre vylúčenie prítomnosti vzdialených metastáz. Zmrazené nádorové tkanivo sme homogenizovali v trecích miskách pomocou mažiara. Následne sme z buniek izolovali DNA pomocou kitu DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) podľa protokolu uvádzaného výrobcom. Na vychytanie a obohatenie úsekov nami vybraných analyzovaných génov, ktoré sme zvolili na základe najvýznamnejšej klinickej relevancie v súvislosti s rakovinou prsníka podľa Lawrence et al [10], sme použili kit SureSelect^QXT (Agilent Technologies), pričom sme postupovali podľa pokynov udávaných výrobcom. Následne sme vytvorili DNA knižnicu využitím SureSelect ^QXT Target Enrichment Kit (Agilent Technologies) na prípravu knižníc podľa protokolu pre Illumina Multiplex sekvenovanie. Finálne knižnice sme nariedili na koncentráciu 13–20 pmol/l. Na sekvenovanie sme využili MiSeq reagent Kit v3 150 cycles (Illumina). Čítania získané NGS sekvenovaním boli následne namapované na ľudský referenčný genóm, pričom oblasti, v ktorých boli sekvenovaním zistené varianty boli anotované a filtrované pomocou nástroja Ingenuity Variant Analysis (Qiagen), pričom sme sa zamerali na Lynch asociované gény MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2. Identifikované patogénne a pravdepodobne patogénne varianty sme verifikovali vizualizáciou pomocou nástroja Integrative Genomics Viewer (Broad Institute). Vzorku pacientky č. 63, v ktorej sme identifikovali mutáciu v géne PMS2 sme následne podrobili aj analýze DNA izolovanej z periférnej krvi aby sme zistili, či sa jedná o zárodočnú mutáciu. DNA sme izolovali pomocou kitu DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) podľa protokolu uvádzaného výrobcom. Následne sme amplifikovali vybraný fragment génu PMS2 pomocou nami navrhnutého páru primerov (forward: CAGGAGTATGCCAAAATGGTCCAGGTCTTACATG, reverse: GGGCCATCTGCGGTAGA CTTCTGTAAATG) pomocou kitu na long range plymerase chain reaction (PCR): LA PCR Kit, Version 2.1 pričom sme postupovali podľa pokynov udávaných výrobcom. Knižnicu sme vytvorili využitím Nextera XT DNA Library Preparation Kit a fragment sme následne osekvenovali pomocou Illumina NextSeq 2000 podľa pokynov výrobcu a čítania boli namapované na ľudský referenčný genóm a vizualizované pomocou nástroja Integrative Genomics Viewer.

Výsledky

Pri analýze variantov nachádzajúcich sa v nádorovom tkanive sme detegovali množstvo mutácií v génoch asociovaných so vznikom rakoviny prsníka (graf 1). Zo súboru sme museli vylúčiť 6 vzoriek v dôsledku nedostatočnej kvality DNA pre analýzu. Našim hlavným cieľom bolo zamerať sa na detekciu mutácií asociovaných s LS, teda na základe výsledkov z publikácie od Roberts et al (2018) išlo predovšetkým o mutácie v génoch MSH6 a PMS2 [4]. V géne MSH6 sa nám nepodarilo v skúmaných vzorkách identifikovať ani jednu mutáciu. Podarilo sa nám detegovať mutáciu v géne PMS2 u pacientky č. 63. Identifikovaná mutácia v géne PMS2 bola delécia v exónovej oblasti a viedla k frameshift mutácii (tab. 1). Na základe získaných dát zo sekvenovania DNA, program Ingenuity Variant Analysis vyhodnotil identifikovaný variant z hľadiska patogénnosti ako pravdepodobne patogénny.

Okrem variantu identifikovanom v géne PMS2 u pacientky č. 63 sme detegovali aj variant v géne TP53, pričom sa jednalo o nonsense mutáciu (tab. 1). Identifikovaný variant vyhodnotil program Ingenuity Variant Analysis z hľadiska patogénnosti ako patogénny.

U pacientky č. 63 sa nám tiež podarilo identifikovať patogénny variant v géne PIK3CA, ktorý sa nachádzal v oblasti exónu. Konkrétne sa jednalo o transkripčný variant c.3140A>G, ktorý zapríčinil missense mutáciu, konkrétne zámenu histidínu za arginín (tab. 1).

Prítomnosť zárodočnej mutácie génu PMS2 sme potvrdili následným vyšetrením krvnej vzorky pacientky.

Diskusia

Úroveň diagnostiky LS

Hoci nádorové ochorenie prsníka nepatrí v prípade LS k tým najčastejším, je určite potrebné poukázať na fakt, že v prípade pacientov, u ktorých má rakovina prsníka familiárny výskyt, môže byť tento zapríčinený aj mutáciou v Lynch asociovaných génoch. Roberts et al (2018) poukázali na zvýšené kumulatívne riziko vzniku rakoviny prsníka u pacientov s patogénnymi variantmi v génoch MSH6 a PMS2 vo veku > 60 rokov a to až na 31,1 resp. 37,7 % oproti odhadovanému riziku v bežnej populácii [4].

V prípade nami analyzovaných pacientov sme sa nezameriavali na analýzu pacientov s familiárnym výskytom rakoviny prsníka, nakoľko sme sa snažili detegovať výskyt týchto mutácií v bežnej vzorke pacientov s rakovinou prsníka. Cieľom našej práce bolo najmä poukázať na to, že pri analýze náhodných vzoriek pacientov s rakovinou prsníka sa môžu vyskytnúť mutácie v MMR génoch, čo by si mali uvedomovať najmä lekári pri odoberaní anamnézy u onkologického pacienta, ktorí rozhodujú o tom, či bude pacient zaslaný na genetické vyšetrenie. U takejto pacientky sa pritom nemusí jednať o familiárny výskyt rakoviny prsníka, ale LS sa v danej rodine môže prejavovať širším spektrom Lynch asociovaných nádorových ochorení.

Hoci sa nám podarilo v analyzovanej skupine pacientov identifikovať len jednu pacientku s mutáciou v Lynch asociovaných génoch spojených s rizikom vzniku rakoviny prsníka, je potrebné upozorniť na fakt, že práve mutácie v génoch MSH6 a PMS2 tvoria len 10 % mutácií MMR génov u všetkých pacientov s LS a zvyšných približne 90 % mutácií je lokalizovaných v génoch MLH1 a MLH2 asociovaných prevažne s rizikom vzniku CRC [3], čo znamená, že aj výskyt rakoviny prsníka v súvislosti s LS bude nižší ako v prípade CRC. Hoci by sa mohlo zdať, že diagnostika LS u pacientov s rakovinou prsníka nemá široké využitie, vyššie spomenutá štúdia od Roberts et al (2018) poukazuje na fakt, že v štúdii s pacientmi, ktorá sa nezameriavala na pacientov s rodinným výskytom nádorových ochorení, bolo identifikovaných približne 0,85 % jedincov, ktorí mali aspoň jednu mutáciu v MMR génoch [4].

Práve pomerne slabé povedomie o asociácii LS s menej častými nádorovými ochoreniami vyskytujúcimi sa pri LS má za následok, že sa diagnostika tohto ochorenia u pacientov s rakovinou prsníka nerealizuje v potrebnom množstve, hoci po podrobnom zisťovaní anamnézy by pacient spĺňal diagnostické kritéria a to najmä, ak by sa jednalo rodinnú anamnézu vzhľadom na výskyt CRC a EC. Súčasná diagnostika LS tak prebieha najmä u pacientov, u ktorých sa aktuálne vyskytuje nádorové ochorenie, najmä CRC, a to hlavne v mladšom veku, než je priemerný vek nástupu ochorenia, prípadne, ak je v rodine viacero členov postihnutých nádormi asociovanými s LS alebo v prípade, že je v rodine postihnutých viacero generácií jedným typom nádorového ochorenia [11].

Potenciál diagnostiky LS

Vzhľadom na potenciál prevencie nádorových ochorení identifikáciou LS u pacientov, u ktorých sa ešte nádorové ochorenie nevyskytlo sa však toto ochorenie javí značne poddiagnostikované. Odhaduje sa, že len u 2 % pacientov trpiacich LS je toto ochorenie aj reálne diagnostikované. Včasná diagnostika pritom môže pomôcť aj pacientom s nádorovým ochorením podniknutím krokov v prevencii rozvinutia ďalších Lynch asociovaných nádorových ochorení [12,13]. Pre tento účel je však potrebné neustále zvyšovať povedomie o LS medzi lekármi. Prekážkou pri identifikácii LS a postúpenie pacienta na genetické testovanie je často nedostatočná úroveň povedomia poskytovateľov zdravotnej starostlivosti o možnostiach genetického testovania a tiež limitovaný čas, ktorý môžu lekári pacientovi venovať a získať detailnú rodinnú anamnézu [14]. Keďže LS je hereditárne ochorenie, diagnostikovanie tohto syndrómu u príbuzných pacienta môže včasne upozorniť na zvýšené riziko možnosti rozvinutia nádorových ochorení, ktoré predstavuje u pacientov s LS v niektorých prípadoch až 80 % [12,13].

Pre správnu diagnostiku je potrebné vyšetriť krvnú vzorku pacienta, vďaka ktorej je možné u pacienta potvrdiť zárodočnú mutáciu MMR génov. Tento spôsob diagnostiky patrí medzi neinvazívne diagnostické metódy a nepredstavuje pre pacienta zvýšenú fyzickú ani psychickú záťaž ako je tomu v prípade diagnostiky pomocou biopsie pri už vzniknutom nádorovom ochorení.

Záver

V rámci pilotnej analýzy sa nám pomocou NGS sekvenovania podarilo identifikovať spomedzi 78 vzoriek mutáciu v géne PMS2 u jednej pacientky s rakovinou prsníka. Jednalo sa o pravdepodobne patogénny variant, ktorý na úrovni proteínu viedol k frameshift mutácii. Napriek tomu, že bol nami analyzovaný počet vzoriek len 78, pričom sa nejednalo o pacientky, u ktorých by bola potvrdená pozitívna rodinná anamnéza rakoviny prsníka, podarilo sa nám identifikovať mutáciu v géne asociovanom s LS. Vzhľadom na fakt, že nádorové ochorenie prsníka je najčastejším z hľadiska incidencie, bolo našim cieľom najmä poukázať na dôležitosť vyhľadávania pacientov s LS, čo je však možné najmä po dôkladnom anamnestickom vyšetrení a dostatočnom povedomí lekárov aj o menej častých Lynch asociovaných nádorových ochoreniach.

Podporujúce agentúry a sponzori

Táto publikácia vznikla vďaka podpore v rámci podpory projektu APVV-16-0010 and APVV-14-0327 financovanou Agentúrou na podporu výskumu a vývoja a Operačného programu Integrovaná infraštruktúra pre projekt: Dlhodobý strategický výskum a vývoj zameraný na výskyt Lynchovho syndrómu v populácii SR a možnosti prevencie nádorov spojených s týmto syndrómom, kód ITMS: 313011V578, spolufinancovaný zo zdrojov Európskeho fondu regionálneho rozvoja.

Mgr. Lucia Krasničanová
Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a UN
Bratislava
Sasinkova 4
811 08 Bratislava
Slovenská republika
e-mail: luciakrasnicanova@gmail.com

Obdrženo/Submitted: 6. 9. 2022
Přijato/Accepted: 29. 12. 2022

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

The authors declare that they have no potential confl icts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Klin Onkol 2023; 36(2): 130– 134