Aktuality z Národního ústavu pro výzkum rakoviny

Precision immuno-oncology approach for four malignant tumors in siblings with constitutional mismatch repair deficiency syndrome

Palova H, Das A, Pokorna P et al.
NPJ Precis Oncol 2024; 8 (1): 110. doi: 10.1038/s41698-024-00597-8.

Vzácný syndrom konstitučního deficitu v mismatch repair opravném systému (constitutional mismatch repair deficiency syndrome – CMMRD) je charakterizován zvýšeným výskytem nádorů u postiženého jedince. Je způsoben bialelickými zárodečnými mutacemi v jednom ze čtyř genů pro mismatch repair (MMR): MLH1, MSH2, MSH6 nebo PMS2. Přesná diagnóza doprovázená adekvátním molekulárně genetickým vyšetřením hraje zásadní roli ve sledování a léčbě nádorových onemocnění postiženého jedince a má význam i pro ostatní členy rodiny. V článku autoři popisují diagnostický proces a klinický management dvou bratrů s CMMRD, kteří jsou nositeli složené heterozygotní varianty v genu PMS2. Bratři pocházejí od pokrevně nepříbuzných rodičů, bez rodinné anamnézy nádorových onemocnění. U obou bratrů se CMMRD manifestoval různými fenotypovými projevy a nádorovým spektrem. Prvnímu z bratrů byl ve 14 letech diagnostikován adenokarcinom tlustého střeva, přičemž po hemikolektomii a standardní chemoterapii FOLFOX dosáhl kompletní remise. Následně se u něj o 4 roky později vyvinul difuzní high-grade gliom pediatrického typu (pediatric-type diffuse high-grade glioma – PDHGG). Sekvenování zárodečného exomu potvrdilo CMMRD způsobenou dvěma odlišnými patogenními variantami PMS2, z nichž každá byla zděděna od asymptomatických rodičů. Oba nádory byly hypermutované s mutačním podpisem (mutational signature) deficitu MMR, ztrátou exprese proteinu PMS2 a vysokou mírou mikrosatelitové nestability (microsatellite instability – MSI). PDHGG vykazoval extrémně vysokou mutační nálož (tumor mutational burden – TMB), a sice 338 mut/Mb. Z toho důvodu byl u pacienta použit kombinovaný imunoterapeutický režim. Pacient byl zařazen do klinické studie s protinádorovou vakcínou založenou na dendritických buňkách (5 dávek) a dále léčen inhibitorem kontrolního bodu imunitní odpovědi nivolumabem. Po léčbě nivolumabem dítě dosáhlo kompletní remise. Léčba byla podávána 24 měsíců. Bohužel 5 měsíců po ukončení podávání nivolumabu byla potvrzena diseminovaná recidiva PDHGG s hypermutací a vysokou MSI. Po 43 měsících od stanovení diagnózy PDHGG došlo k úmrtí. U bratra prvního pacienta byla potvrzena stejná složená heterozygotní varianta v genu PMS2 a diagnostikován CMMRD a nastaven příslušný režim sledování. Následně byla zjištěna asymptomatická abdominální lymfadenopatie. Biopsie potvrdila high-grade zralý B-buněčný lymfom s aberací 11q, ale bez přestavby MYC/8q24. Pacient podstoupil dva cykly intenzivní chemoterapie spolu s rituximabem. Byla zjištěna vysoká mutační nálož a mutační podpis deficitu MMR, ztráta exprese proteinu PMS2 a vysoká míra MSI. Chemoterapie byla ukončena a pacient byl po multidisciplinárním konsenzu léčen nivolumabem. Při trvalé remisi trvající > 24 měsíců bylo rozhodnuto o ukončení podávání nivolumabu. Po 9 měsících byl diagnostikován PDHGG s odpovídajícími mutačními znaky a vysokou mírou MSI. Po odstranění nádoru a ozáření byla opětovně zahájena léčba inhibitory kontrolních bodů imunitní odpovědi ipilimumabem a nivolumabem, která musela být pro toxicitu ukončena. Pacient je v současné době 13 měsíců po ukončení imunoterapie, > 23 měsíců od diagnózy PDHGG a 5 let od diagnózy lymfomu sledován pomocí zobrazovacích metod bez známek nádorového onemocnění. Léčba zahrnující inhibitory kontrolních bodů imunitního systému významně přispěla k prodloužení přežití obou pacientů postižených letálními gliomy. Hypermutovanost nádoru rovněž umožnila v léčbě B-buněčného lymfomu použití imunoterapie pomocí nivolumabu, čímž se omezila expozice intenzivní chemoterapii u tohoto mladého pacienta.

Small protein blockers of human IL-6 receptor alpha inhibit proliferation and migration of cancer cells

Groza Y, Lacina L, Kuchař M et al.
Cell Commun Signal 2024; 22 (1): 261. doi: 10.1186/s12964-024-01630-w.

Interleukin-6 (IL-6) je multifunkční cytokin, který řídí imunitní odpověď a jehož role byla popsána při vzniku autoimunitních onemocnění. Signalizace prostřednictvím komplexu receptoru IL-6 (IL-6R) je rozhodující pro progresi nádorů, a proto IL-6R představuje důležitý terapeutický cíl. K výběru proteinů cílených na IL-6R alfa (IL-6Ra) byla v publikované práci použita vysoce komplexní kombinatorická knihovna proteinů odvozených od domény streptokokového proteinu G vázající lidský albumin vytvořených in vitro ribozomálním komplexem. Rozsáhlý screening bakteriálních lyzátů jednotlivých klonů byl proveden pomocí metody ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) a jejich blokační potenciál pro IL-6Ra byl ověřen kompetitivní metodou ELISA. Vazba proteinů na buňky byla sledována pomocí průtokové cytometrie a konfokální mikroskopie na transfektovaných buňkách HEK293T a inhibice signální funkce byla zkoumána prostřednictvím HEK-Blue IL-6 reportérových buněk. Vazebná kinetika proteinů k živým buňkám byla měřena pomocí LigandTraceru, proliferace a toxicita buněk byly analyzovány pomocí iCELLigence a Incucyte, migrace buněk byla sledována testem hojení škrábnutí (scratch wound healing assay) a predikce vazebných pozic proteinů byla provedena dokováním pomocí molekulárního modelování. Autoři prezentují soubor proteinových variant NEF ligandů vybraných z kombinatorické knihovny odvozené od albumin vážících domén s průkazem jejich vazebné specifity k lidskému IL-6Ra a antagonistického účinku v HEK-Blue IL-6 reportérových buňkách. Tři nejslibnější varianty – NEF108, NEF163 a NEF172 – inhibovaly proliferaci buněk maligního melanomu (G361 a A2058) a buněk karcinomu slinivky břišní (PaTu a MiaPaCa) a potlačovaly migraci buněk maligního melanomu (A2058), karcinomu slinivky břišní (PaTu) a glioblastomu (GAMG) in vitro. Vazebné proteiny NEF také rozpoznávaly expresi IL-6Ra primárních lidských B buněk. Proteiny NEF tak představují slibnou třídu netoxických protinádorových látek s migrastatickým potenciálem.

Stromal cells engineered to express T cell factors induce robust CLL cell proliferation in vitro and in PDX co-transplantations allowing the identification of RAF inhibitors as anti-proliferative drugs

Hoferkova E, Seda V, Kadakova S et al.
Leukemia 2024; [online]. Available from: https: //www.nature.com/articles/s41375-024-02284-w.

Stromální buňky, upravené tak, aby produkovaly cytokiny z T lymfocytů, stimulují proliferaci buněk chronické lymfocytární leukemie (CLL) při kokultivaci in vitro a v PDX myších, přičemž tento model umožňuje odhalit anti-proliferační aktivitu inhibitorů RAF kináz na buňky CLL. Množení a přežívání buněk CLL závisí na interakcích v mikroprostředí, především v lymfatických uzlinách. Míra zrodu CLL buněk je zde 0,5–3 % denně a nově vzniklé CLL buňky jsou odtud vyplavovány do periferní krve. Předpokládá se, že prostředí v lymfatických uzlinách podporuje proliferaci CLL prostřednictvím faktorů, jako jsou CD40, toll-like receptory (TLR) a aktivace B-buněčného receptoru (B-cell receptor – BCR). Samostatná aktivace BCR signalizace pomocí antigenu in vitro však k vyvolání proliferace CLL buněk nestačí, což naznačuje, že k proliferaci CLL jsou zapotřebí ještě další faktory mikroprostředí, pravděpodobně produkované CD4+ T lymfocyty. Prakticky nulová (< 5 %) proliferace primárních CLL buněk in vitro je překážkou pro studium tohoto procesu, zásadního pro pochopení progrese a agresivity onemocnění. Již dříve bylo vyvinuto několik in vitro modelů mikroprostředí CLL užitečných pro studium biologie CLL a pro screening sloučenin potenciálně vhodných pro terapii. Většina těchto modelů zahrnuje lidské nebo myší stromální buňky podobné fibroblastům, které zvyšují přežívání CLL buněk nebo simulují adhezí zprostředkovanou lékovou rezistenci, ale nevyvolávají proliferaci CLL. K vyvolání proliferace se v modelech se stromálními buňkami exprimujícími CD40L obvykle ještě zvlášť přidávají rekombinantní faktory, jako jsou interleukiny, které jsou však velice drahé, a i za takových podmínek je míra proliferace CLL v těchto modelech relativně nízká a variabilní. V publikované studii autoři vytvořili model mikroprostředí CLL založený na napodobení interakcí CLL buněk s T lymfocyty, a to při kokultivaci in vitro a v imunodeficientních myších (patient derived xenografts – PDX). Bylo připraveno šest různých podpůrných buněčných linií odvozených z buněčné linie stromálních buněk HS-5. Tyto linie stabilně exprimují lidský CD40L, IL-4, IL-21 a jejich kombinace. Při kultivace CLL buněk s HS-5 exprimujícími CD40L a IL-4 proliferovalo po 7 dnech asi 7 % buněk CLL, avšak s HS-5 exprimujícími CD40L, IL-4 a navíc IL-21 to bylo už 44 % buněk, což je pro CLL in vitro nebývale vysoká míra proliferace. Buňky CLL v těchto modelech vykazovaly změny genové exprese podobné těm, které lze zjistit v buňkách CLL vystavených skutečnému mikroprostředí v lidském těle. Experimenty na buňkách CLL v tomto modelu také poprvé ukázaly, že proliferaci CLL zcela blokují inhibitory RAF kináz. Vyvinutý model lze pro účely velkého screeningu léčiv zmenšit do objemu 5 μl nebo jej lze naopak využít pro vytvoření myšího modelu CLL-PDX. Společná transplantace buněk CLL a HS5-CD40L-IL4, příp. HS5-CD40L-IL4-IL21 na kolagenovém scaffoldu do imunodeficientních myší vedla k přihojení v 47 % (82 %) případů, přičemž v ~20 % myší byly přihojené buňky klonálně příbuzné CLL, což naznačuje, že upravené HS5 by v PDX modelech potenciálně mohly nahradit autologní T lymfocyty.