Odlišná exprese genů spojených se signální drahou UPR u pacientů s mnohočetným myelomem a extramedulárním onemocněním

Súhrn

Východiska: Signální dráha UPR (unfolded protein response, tj. odpověď na chybně složené proteiny) pomáhá myelomovým buňkám vyrovnat se se stresovými podmínkami vzniklými v důsledku nadměrné proteosyntézy, a představuje tak pro myelomové buňky prostředek umožňující jejich přežití. Extramedulární onemocnění je agresivnější forma mnohočetného myelomu, při které myelomové buňky ztrácí svoji závislost na mikroprostředí kostní dřeně a mohou infiltrovat jiné tkáně a orgány. Patogeneze vzniku extramedulárního onemocnění není dosud zcela objasněna. Cílem této studie bylo zjistit, zda existuje rozdíl v expresi genů spjatých s UPR mezi plazmatickými buňkami kostní dřeně od pacientů s mnohočetným myelomem a extramedulárním onemocněním. Materiál a metody: Pomocí reverzní transkripce ve spojení s kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí byla analyzována exprese šesti genů spjatých s UPR (ERN1, DDIT3, EIF2AK3, TUSC3, XBP1, HSPA5). Použito bylo celkem 76 vzorků plazmatických buněk kostní dřeně, z toho 44 bylo od pacientů s mnohočetným myelomem a 32 od pacientů s extramedulárním onemocněním. Výsledky: Byl pozorován statisticky významný rozdíl v expresi genů HSPA5, DDIT3, EIF2AK3 a ERN1 mezi skupinou mnohočetného myelomu a extramedulárního onemocnění; exprese byla ve všech případech vyšší u vzorků od pacientů s extramedulárním onemocněním. V případě genů XBP1 a TUSC3 nebyl pozorován statisticky významný rozdíl. Prokázáno bylo také několik statisticky významných korelací mezi hladinou exprese analyzovaných genů a klinickými daty pacientů. Závěr: Výsledky poukazují na možný význam signální dráhy UPR v patogenezi extramedulárního onemocnění. UPR se jeví jako vhodný směr dalšího výzkumu.

Klíčová slova:

mnohočetný myelom – signální dráha UPR – plazmatické buňky – extramedulární onemocnění

Úvod

Mnohočetný myelom (MM) je hematoonkologické onemocnění charakterizované klonální proliferací maligního klonu plazmatických buněk v kostní dřeni pacientů. Tyto buňky, označované jako buňky myelomové, produkují monoklonální imunoglobulin prokazatelný v krvi a/nebo moči pacientů. Z klinického hlediska je MM provázen skupinou typických příznaků označovaných souhrnně zkratkou CRAB – hyperkalcemie, renální insuficience, anemie a kostní léze [1,2]. Medián věku pacientů v ČR je v době diagnózy 70 let, přičemž jen přibližně 17 % je v době diagnózy mladších 60 let a necelé 1 % mladší 40 let [3]. Pro MM jsou typické některé chromozomální aberace, které lze rozlišit na hyperdiploidní (obvykle trizomie lichých chromozomů) [4] a nonhyperdiplodní (např. translokace chromozomu 14) [2,5].

Extramedulární onemocnění (extramedullary disease – EMD) je forma MM, při níž dochází ke ztrátě závislosti myelomových buněk na mikroprostředí kostní dřeně [6]. Tato ztráta závislosti má souvislost se sníženou expresí některých adhezivních molekul na myelomových buňkách v případě EMD (zatímco u klasického MM zajišťují tyto molekuly adhezi myelomových buněk v kostní dřeni) [7–9]. Kromě toho se na patogenezi EMD, která však dosud není zcela objasněna, podílejí např. cytokiny [10] či některé mikroRNA [6,11,12]; popsán byl také zvýšený výskyt určitých chromozomálních aberací [13].

Nezávislost myelomových buněk na kostní dřeni umožňuje jejich vycestování a diseminaci v jiných tkáních a orgánech. Vychází-li nádor z původní kostní léze, jedná se o EMD paraskeletální. Jsou-li zasaženy měkké tkáně, označuje se jako EMD extraskeletální. Dále lze EMD rozdělit také na primární (stanoveno již s prvotní diagnózou MM) a sekundární (stanoveno při relapsu MM) [6,14]. EMD se v porovnání s MM vyznačuje větší agresivitou [6]. Zatímco doba přežití u pacientů s MM se pohybuje od 2 let u těžkých forem onemocnění [15] a může přesáhnout až 8 let u pacientů dobře odpovídajících na léčbu [2], doba přežití pacientů s EMD je kratší [16]. Nedávný systematický přehled udává, že nejhorší prognózu mají pacienti s extraskeletálním EMD. Jedna ze zmiňovaných studií zaměřující se na nově diagnostikované pacienty s MM uvádí pro extraskeletální EMD medián přežití 27,8 měsíce, zatímco u paraskeletálního EMD se jedná o 54,2 měsíce. Je však podstatné podotknout, že závěry jednotlivých studií se liší [17].

Vzhledem k tomu, že myelomové buňky vznikají maligní transformací buněk plazmatických, jejichž hlavní funkcí je tvorba imunoglobulinů, probíhá v myelomových buňkách intenzivní proteosyntéza [18]. Tvorba sekrečních proteinů, mezi které imunoglobuliny patří, je spojena s ribozomy drsného endoplazmatického retikula (ER), v jehož lumen následně dochází ke skládání vznikajících proteinů, které tak získávají správnou terciární strukturu [19,20]. Skládání proteinů je proces náchylný na chyby a při zvýšené proteosyntéze roste také riziko vzniku nesprávně poskládaných proteinů. Takové proteiny jsou v lumen ER zadržovány, může dojít k jejich nahromadění, a tím také k rozvoji stavu označovaného jako stres ER, který může vést až ke smrti buňky [18,21]. Aby buňka dokázala zachovat svou funkčnost, dochází v ní k aktivaci mechanizmů, které umožňují obnovit homeostázu v buňce. Takovým mechanizmem je aktivace signální dráhy UPR (unfolded protein response, tj. odpověď na chybně složené proteiny). Jedná se o proces, který prostřednictvím transkripčních faktorů ovlivňuje genovou expresi v buňce způsobem vedoucím ke zvýšení kapacity ER skládat proteiny a ke snížení proteinové zátěže [18,21]. Celý proces UPR je umožněn kaskádou reakcí, na jejichž začátku je aktivace některého ze tří transmembránových proteinů IRE1a (inositol-requiring enzyme 1a), PERK (protein kinase R-like ER kinase) či ATF6 (activating transcription factor 6), které slouží jako senzory přítomnosti nesprávně poskládaných proteinů v lumen ER [21,22]. Aktivací i průběhem UPR se detailně zabývá např. Hetz et al. [21]. Vzhledem k intenzivní proteosyntéze (a tedy i zvýšenému riziku rozvoje stresu ER) představuje UPR pro myelomové buňky důležitý nástroj přežití [23]. UPR je ve vztahu k MM zkoumáno také z hlediska možného využití v léčbě, přičemž souvisí s odpovědí na léčbu proteazomovými inhibitory [19].

Cílem této studie bylo vyhodnotit hladinu exprese vybraných genů spjatých s UPR u myelomových buněk pacientů s MM a EMD.

 

Materiál a metody

Zpracováno bylo celkem 76 vzorků CD138⁺ plazmatických buněk kostní dřeně, z toho 44 od pacientů s MM a 32 od pacientů s EMD. Všechny vzorky pocházely od pacientů z Fakultní nemocnice Brno. Studie byla schválena Etickou komisí Fakultní nemocnice Brno a zahrnutí pacientů do studie bylo podmíněno podepsáním informovaného souhlasu. Bližší charakteristika souboru pacientů je uvedena v tab. 1.

 

Izolace RNA z plazmatických buněk kostní dřeně

Ze vzorků byla izolována RNA pomocí miRNeasy Mini Kitu (Qiagen, Německo) a miRNeasy Micro Kitu (Qiagen, Německo) v závislosti na množství buněk. Koncentrace a čistoty všech vzorků byly změřeny pomocí spektrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, USA). Následně byla koncentrace změřena prostřednictvím fluorimetru Qubit 4.0 a kitů Qubit RNA HS Assay nebo Qubit RNA BR Assay (Thermo Fisher Scientific, USA).

 

Reverzní transkripce ve spojení s kvantitativní PCR (RT-qPCR)

RNA získaná ze vzorků byla transkribována do cDNA pomocí High-Capacity cDNA Reverse Transcription kitu (Thermo Fisher Scientific, USA). cDNA byla následně využita k analýze genové exprese prostřednictvím kvantitativní polymerázové řetězové reakce (quantitative polymerase chain reaction – qPCR). Měřena byla hladina exprese šesti genů spjatých s UPR (ERN1, DDIT3, EIF2AK3, TUSC3, XBP1, HSPA5), jako referenční gen byl použit RPLP0. Ke qPCR byly použity TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, USA), TaqMan Gene Expression Assays (Thermo Fisher Scientific, USA) a QuantStudio 3 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA).

 

Statistické vyhodnocení

Data získaná pomocí qPCR byla vyhodnocena s použitím softwaru MS Excel (Microsoft Corporation, USA) a GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, USA). Hodnoty Ct byly normalizovány k hladině referenčního genu RPLP0 pomocí metody 2-DCt, přičemž DCt je rozdíl Ct hodnoty cílového a referenčního genu. Na základě výpočtu interkvartilového rozsahu (IQR) byly identifikovány a ze souboru normalizovaných Ct vyřazeny odlehlé hodnoty.

Hladiny exprese zkoumaných genů mezi skupinou MM a EMD byly srovnány pomocí Mann-Whitneyho testu. Za statisticky významné byly považovány výsledky s p hodnotou < 0,05. Pokud byl zjištěn statisticky významný rozdíl v expresi, byla pro daný gen provedena také ROC (receiver operating characteristic) analýza, která hodnotí, s jakou senzitivitou a specificitou lze na základě daného parametru odlišit dvě skupiny. Za dobrý biomarker je považován takový parametr, u kterého je hodnota plochy pod křivkou (area under the curve – AUC) > 0,8 [24].

Pomocí Spearmanova korelačního koeficientu byly porovnány hladiny exprese všech zkoumaných genů s klinickými daty pacientů. Korelace byly provedeny zvlášť pro kohortu MM a EMD. Normalizované Ct hodnoty byly korelovány s těmito klinickými parametry pacientů: věk v době stanovení diagnózy, stadium onemocnění dle prognostických systémů ISS (International Staging System) [25], R-ISS (Revised International Staging System) [26], systém dle Durieho a Salmona [27], poměr volných lehkých řetězců imunoglobulinů, hladina monoklonálního proteinu v séru, procentuální zastoupení plazmatických buněk v kostní dřeni, množství hemoglobinu a trombocytů, sérová hladina vápníku, albuminu, kreatininu, beta-2-mikroglobulinu, laktátdehydrogenázy a C-reaktivního proteinu. Za statisticky významné byly považovány korelace s p hodnotou < 0,05.

 

Výsledky

Srovnání hladin exprese genů spjatých se signální drahou UPR

Hladiny exprese jednotlivých genů byly srovnány mezi skupinou MM a EMD. Statisticky významný rozdíl v expresi byl pozorován u genů HSPA5 (p = 0,0274), DDIT3 (p = 0,0012), EIF2AK3 (p = 0,0106) a ERN1 (p = 0,0135). Ve všech případech byla hladina exprese analyzovaného genu vyšší u kohorty EMD. V případě genů XBP1 a TUSC3 nebyl rozdíl v expresi statisticky významný. Výsledky jsou znázorněny pomocí krabicových grafů (obr. 1).

 

ROC analýza

Pro geny, jejichž rozdíl v expresi mezi oběma skupinami byl statisticky významný (HSPA5, DDIT3, EIF2AK3 a ERN1), byla provedena také ROC analýza. Žádný z genů nesplňoval kritéria dobrého biomarkeru. Výsledky byly následující: HSPA5 (AUC = 0,6602), DDIT3 (AUC = 0,7294), EIF2AK3 (AUC = 0,6827), ERN1 (AUC = 0,6817).

 

Korelační analýza

V kohortě MM byly pozorovány statisticky významné korelace pouze některých parametrů s hladinami exprese genů HSPA5 a TUSC3. Konkrétně se jednalo o pozitivní korelaci se sérovou hladinou beta-2-mikroglobulinu (p = 0,011) a C-reaktivního proteinu (p = 0,044) a negativní korelaci s množstvím hemoglobinu (p = 0,021), obojí pro gen HSPA5. V případě genu TUSC3 hladina exprese pozitivně korelovala s procentuálním zastoupením plazmatických buněk v kostní dřeni (p = 0,039), sérovou hladinou kreatininu (p = 0,033) a beta-2-mikroglobulinu (p = 0,037) a negativně s množstvím hemoglobinu (p = 0,002). Jediná statisticky signifikantní korelace v kohortě EMD byla pozorována mezi hladinou exprese genu TUSC3 a věkem pacientů (p = 0,033). Uvedené výsledky jsou shrnuty v tab. 2.

 

Diskuze

Cílem této studie bylo pomocí RT-qPCR analyzovat expresi vybraných genů spjatých s UPR u plazmatických buněk kostní dřeně od pacientů s mnohočetným myelomem (MM) a extramedulárním onemocněním (EMD). Geny byly vybrány na základě preliminárních dat. Naší hypotézou byla existence rozdílu v expresi daných genů mezi kohortou MM a EMD. Takový výsledek by mohl poukazovat na význam UPR v patogenezi EMD.

Mezi vybrané geny patří gen XBP1 (X-box binding protein 1), DDIT3 (DNA damage-inducible transcript 3), TUSC3 (tumor suppressor candidate 3), HSPA5 (heat shock protein family A member 5), EIF2AK3 (eukaryotic translation initiation factor 2 alpha kinase 3) a ERN1 (endoplasmic reticulum to nucleus signaling 1).

Gen XBP1 kóduje protein, který je štěpen v rámci IRE1a větve UPR kaskády. Výsledkem štěpení je vznik aktivního transkripčního faktoru, který se podílí na snížení proteinové zátěže a zvýšení schopnosti ER skládat proteiny [21]. V myelomových buňkách byla prokázána zvýšená exprese XBP1 v porovnání s normálními plazmatickými buňkami [28,29].

Gen DDIT3 kóduje transkripční faktor CHOP (C/EBP homologous protein), který má proapoptotický účinek. Exprese může být indukována vlivem hyperaktivace PERK větve UPR [30,31].

Gen TUSC3 kóduje stejnojmenný protein, který se nachází v membráně ER a podílí se na procesu skládání proteinů. Dysfunkce tohoto proteinu může vést k hromadění nesprávně poskládaných proteinů v lumen ER a rozvoji stresu ER [32]. Význam TUSC3 je u některých nádorových onemocnění pronádorový (např. kolorektální karcinom), u jiných protinádorový (např. karcinom prsu) [33].

Gen HSPA5 kóduje protein BiP (binding immunoglobulin protein), který se coby chaperon podílí na skládání proteinů v ER [34]. Byla prokázána jeho zvýšená exprese u buněk MM, přičemž nejvyšší exprese byla pozorována u refrakterních myelomových buněk a buněk EMD [35,36].

Gen EIF2AK3 kóduje transmembránový protein PERK, jeden ze tří proteinů, jejichž aktivací dochází ke spuštění UPR kaskády [22,37]. PERK je exprimován myelomovými buňkami a jeho inhibice měla na myelomové buňky antiproliferativní až proapoptotický účinek [38].

Gen ERN1 kóduje další z transmembránových proteinů aktivujících UPR – protein IRE1a [21]. Existují studie prokazující jeho význam pro růst MM [39].

Analýza genové exprese těchto genů na souboru 76 vzorků plazmatických buněk kostní dřeně (44 MM a 32 EMD) vedla k následujícím zjištěním. Signifikantně rozdílná exprese mezi MM a EMD byla pozorována u genů HSPA5, DDIT3, EIF2AK3 a ERN1. Zvýšená exprese genů HSPA5, EIF2AK3 i ERN1 je u myelomových buněk spojena s pronádorovým účinkem [35,38,39] a u všech těchto genů byla pozorována vyšší exprese u kohorty EMD. Takový výsledek by mohl poukazovat na význam dysregulace UPR pro rozvoj EMD. Zvýšená exprese těchto genů v kohortě EMD v porovnání s MM koresponduje se zjištěními, že při rozvoji EMD dochází k dalšímu hromadění genetických či epigenetických změn a ke změnám v buněčné signalizaci [10,12,13,36,40]. Nicméně zvýšená exprese u EMD v porovnání s MM byla pozorována i v případě genu DDIT3, který má u MM protinádorový účinek, a v souladu s předchozí úvahou by tak bylo možné očekávat spíše jeho nižší expresi u EMD ve srovnání s MM.

U genů XBP1 a TUSC3 nebyl pozorován signifikantní rozdíl v expresi mezi MM a EMD. Gen XBP1 byl druhý nejsilněji exprimovaný gen z celé zkoumané skupiny (po genu HSPA5). Naproti tomu exprese genu TUSC3 byla v obou skupinách nízká (ve skupině MM i EMD byl medián Ct hodnoty > 32). Vzhledem k tomuto zjištění by bylo možné uvažovat o tumor supresorové funkci TUSC3 v patogenezi MM (resp. EMD).

Korelace výsledků analýzy genové exprese s klinickými daty pacientů poukázala na některé statisticky významné vztahy. Ve skupině MM se jednalo o pozitivní korelaci mezi hladinou exprese genu HSPA5 a sérovou hladinou beta-2-mikroglobulinu a C-reaktivního proteinu a hladinou exprese genu TUSC3 a procentuálním zastoupením plazmatických buněk v kostní dřeni, sérovou hladinou beta-2-mikroglobulinu a kreatininu. Zvýšená hodnota všech těchto parametrů (procentuální zastoupení plazmatických buněk v kostní dřeni, sérová hladina beta-2-mikroglobulinu, C-reaktivního proteinu a kreatininu) je u MM spojena s těžší formou onemocnění a horší prognózou [26,41–43]. Negativní korelace pak byla pozorována pro hladinu exprese HSPA5 a TUSC3 a množství hemoglobinu, přičemž snížená hodnota hemoglobinu (anemie) patří mezi typické projevy MM [2]. Ve skupině EMD byla pozorována jediná statisticky významná korelace, a to pozitivní korelace mezi hladinou exprese TUSC3 a věkem pacientů.

Limitací této studie je množství vzorků; analýzu by bylo vhodné rozšířit o další vzorky, zejména v kohortě EMD.

 

Závěr

Cílem práce bylo zjistit, zda existuje rozdíl v expresi vybraných genů spjatých s UPR mezi skupinou MM a EMD. Statisticky významný rozdíl v expresi byl prokázán u čtyř z šesti zkoumaných genů (HSPA5, DDIT3, EIF2AK3 a ERN1). V případě genů XBP1 a TUSC3 nebyl rozdíl v expresi statisticky významný. Získaná data byla dále srovnána s klinickými daty pacientů. Toto srovnání prokázalo několik statisticky významných korelací.

Výsledky této studie poukazují na možný význam UPR v patogenezi EMD. UPR by potenciálně mohlo představovat vhodný cíl léčby a pomoci zejména v případech, kde stávající léčebné režimy nedosahují dobrých výsledků. UPR se jeví jako vhodný směr dalšího výzkumu v oblasti patogeneze MM a EMD.