Kontrola kvality eluátu ²²³Ra

Súhrn

Úvod:
Využití radionuklidů má v medicíně nezastupitelnou roli. Jejich použití však podléhá Zákonu o léčivech a dalším předpisům, včetně standardizovaných výrobních postupů, které vždy zahrnují kontrolu radionuklidové čistoty. V případě ²²³Ra (T_1/2 = 11,435 dne) je prováděna pomocí alfa a gama spektrometrie. Při provádění kontroly kvality je důležité věnovat pozornost zejména radionuklidům s dlouhým poločasem přeměny, např. ²²⁷Ac (T_1/2 = 21,773 let) či ²²⁷Th (T_1/2 = 18,72 dní).

Metoda:
²²³Ra bylo získáno z generátoru ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra (²²⁷Ac na iontoměniči Dowex-1). Eluce byla prováděna jak za optimálních podmínek (0,7M HNO₃ a 80% MeOH), tak i podmínek simulujících přítomnost radionuklidových nečistot. Eluáty byly analyzovány pomocí alfa a gama spektrometrie. Jako alternativní metoda kontroly kvality ²²³Ra byla vyvinuta metoda analýzy pomocí papírové chromatografie (TODGA impregnovaný papír Whatman-1, mobilní fáze 1M HNO₃) a následného proměření na NaI(Tl) krystalu.

Výsledky:
Čistota eluátu byla ověřena alfa a gama spektrometrií a pomocí papírové chromatografie. Směs ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra byla úspěšně rozdělena na jednotlivé složky, proměřena na TLC skeneru a následně rozstříhána a stanovena čistota eluátů. Za optimálních elučních podmínek bylo detekováno ²²³Ra a jeho dceřiné nuklidy (²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Pb). Při změně podmínek pak bylo detekováno i ²²⁷Th. Ani v jednom případě však aktivita nečistot nepřesáhla 3,5 %.

Závěr:
Eluáty ²²³Ra získané za obou typů podmínek měly radionuklidovou čistotu vyšší než 96 %. Zvolené analytické metody vzájemně potvrdily stanovené výsledky. Lze tedy konstatovat, že papírová chromatografie je pro separaci a analýzu složení směsi ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra vhodnou alternativní metodou a po následné validaci je použitelná pro kontrolu radionuklidové čistoty preparátů ²²³Ra.

Klíčová slova:
²²³Ra, radionuklidová čistota, spektrometrie, papírová chromatografie, kontrola kvality

Úvod

²²³Ra (T_1/2 = 11,435 dní) ¹ jako jeden z produktů rozpadové řady ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra (Obr. 1) je v poslední době využíváno v nukleární medicíně. Přeměnou ²²³Ra nedochází pouze k emisi jedné alfa částice a odraženého atomu, ale díky následným přeměnám jeho dceřiných produktů (Obr. 1) dochází k uvolnění kaskády několika alfa částic. ²²³Ra emituje 95,3 % energie ve formě alfa částic (energetické rozmezí 5,0–7,5 MeV), 3,6 % jako beta částice (průměrné energie jsou 0,445 MeV a 0,492 MeV) a 1,1 % jako gama záření (rozmezí energie 0,01–1,27 MeV). ² Pod komerčním označením Xofigo^® je dodáván ²²³RaCl₂, který je schváleným radiofarmakem jak Food and Drugs Administration (FDA) ³ a European Medicines Agency (EMA) ⁴, tak i Státním ústavem pro kontrolu léčiv (registrován od 11/2013, dostupný od 8/2014). ² Léková forma přípravku je injekční roztok dodávaný v balení 1 x 6 ml, aplikován injekčně v šesti opakováních po čtyřech týdnech, jednotlivá dávka představuje 50 kBq/kg. ² Přípravek je používán pro paliativní léčbu kostních metastáz při karcinomu prostaty. ⁵ Díky analogii ²²³Ra²⁺ s ionty Ca²⁺ dochází k jeho distribuci na trámčitý povrch kostí. Zde je pozorována vyšší retence ²²³Ra právě v oblastech tumorů, kde alfa částice mohou efektivně zasáhnout rakovinové buňky. ^4,5 Jedním ze zdrojů ²²³Ra je ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra generátor. ^6,7

Využití radionuklidů v medicíně, jak v diagnostice (PET, SPECT), tak i v terapii, upravuje Zákon o léčivech (378/2007 Sb.) ⁸ společně s vyhláškami Státního ústavu pro kontrolu léčiv (Správná laboratorní praxe, SLP-8 ⁹; Výroba léčiv, VYR-40 ¹⁰, také vyhláška SÚJB o radiační ochraně 307/2002 Sb. ¹¹ a další). Mezi sledované parametry radionuklidových preparátů patří zejména radiochemická a radionuklidová čistota, která vždy podléhá procesní kontrole u výrobce. Radionuklidová čistota je v Českém lékopise (2009) definována jako poměr radioaktivity daného radionuklidu k celkové aktivitě radiofarmaka a je vyjadřována v procentech. ¹² Radiochemická čistota je definována jako poměr aktivity daného radionuklidu v dané chemické formě a celkové aktivity tohoto radionuklidu. Též se vyjadřuje v procentech. ¹² Radionuklidová čistota bývá stanovována po eluci radionuklidu z generátoru s využitím gama i alfa spektrometrie, kapalinové scintilační spektrometrie, ale také kombinací spektrometrických technik s vhodnou separační metodou (nejčastěji chromatografie). ¹² Aby radiofarmakum mohlo být využito, nesmí celkové množství aktivity gama záření nečistot přesáhnout hodnotu uvedenou v Českém lékopise (2009). Tyto hodnoty se liší pro každé radiofarmakum, avšak pro ²²³Ra tato hodnota není stanovena Českým lékopisem ani EMA či FDA. ^3,4,12 Jako majoritní radionuklidové nečistoty se mohou v eluátu z radionuklidového generátoru nacházet hlavně mateřské nuklidy ²²⁷Ac (T1/2 = 21,773 let) a ²²⁷Th (T1/2 = 18,72 dne). Průběh separace ²²³Ra od ²²⁷Th a ²²⁷Ac byl popsán chromatografií na hydrofobizovaném papíře impregnovaném N,N,N´,N´-tetraoktyldigylokolamidem. ¹³ (Obr. 2) V kombinaci s gama a alfa spektrometrií poukazujeme na potenciální využití papírové chromatografie s modifikovanou stacionární fází jako validovatelné metody pro stanovení radionuklidové čistoty ²²³RaCl₂. Uvedená metoda by tak mohla být využívána přímo na pracovištích nukleární medicíny pro stanovení radionuklidové čistoty ²²³RaCl₂ a to i bez použití gama spektrometrie.

Metody a chemikálie

Pro experimenty byly použity následující chemikálie: N,N,N´,N´-tetraoktyldigylokolamid (TODGA, připravený v naší laboratoři), HNO₃ (65%, p. a., Lachner), methanol (MeOH) (99,5%, p.a., Lachner), NaCl (p.a., Lachner) a ²²⁷Ac (vzorek komerčního preparátu, Amersham, UK).

²²³Ra bylo získáno elucí z generátoru ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra. Roztok radionuklidu ²²⁷Ac (ve formě dusičnanu) byl sorbován na iontoměnič Dowex-1 s 0,7M HNO₃ v 80% methanolu podle Gusevy a kol. ⁷ Získané frakce byly analyzovány pomocí papírové chromatografie, alfa a gama spektrometrie.

Gama spektra byla měřena na mnohokanálovém analyzátoru (Ortec 919 Spectrum Master propojeným s řídícím programem Maestro v PC) a koaxiálním polovodičovým detektorem HPGe (Princeton Gamma Technologies) v rozmezí energií fotonů 0-2000 keV. Jednotlivé vzorky nebyly před měřením nijak upravovány.

K měření alfa spekter byl využit alfa-spektrometrický systém Octete (Ortec, USA). Před samotným měřením byly vzorky naneseny odpařením příslušného alikvotu (10 μl) na kovovou podložku.

Ke stanovení radionuklidové čistoty pomocí papírové chromatografie byly využity papíry Whatman-1 impregnované N,N,N´,N´-tetraoktyldigylokolamidem (TODGA) jako stacionární fáze. Jako mobilní fáze byla využita 1M kyselina dusičná. ¹³ Chromatogramy byly po vysušení měřeny na plynovém proporcionálním detektoru AR-2000 (Bioscan) s čítacím plynem P10 (argon-methanová směs, Linde) propojeným přes sériové rozhraní s PC a SW WinScan. Podle získaných dat byly papíry rozstříhány na příslušné úseky (celkem 4 z každé separace, např. 0–3,5; 3,5–7; 7–14 a 14–20 cm měřeno od spodního okraje, startovní linie byla naznačena ve vzdálenosti 2 cm od spodního okraje) ¹³ a změřeny pomocí gama spektrometru.

Výsledky

Pro kontrolu kvality byly připraveny dva typy eluátu ²²³Ra v rozdílných podmínkách. První z nich byl získán za standardních podmínek elucí 0,7M HNO₃ v 80% methanolu. U druhého byly standardní podmínky modifikovány přídavkem fyziologického roztoku NaCl, který simuluje přítomnost radionuklidových nečistot.

Radionuklidová čistota jednotlivých frakcí ²²³Ra získaného z ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra generátoru byla nejdříve kontrolována pomocí alfa a gama spektrometrie. Výsledky pro eluáty získané v 0,7M HNO₃ v 80% methanolu jsou uvedeny v Grafu 1. Z něj je patrné, že mateřské nuklidy ²²⁷Ac a ²²⁷Th zůstávají na koloně a v eluátu je přítomen pouze radionuklid ²²³Ra a jeho dceřiný nuklid ²¹¹Pb. V Grafu 2 jsou uvedeny výsledky pro eluáty získané v prostředí 0,7M HNO₃ v 80% methanolu s přídavkem NaCl. Zde je vidět, že ²²⁷Ac zůstává na koloně a do roztoku se vedle ²²³Ra a ²¹¹Pb nepatrně uvolňuje i ²²⁷Th.

Celková radionuklidová čistota připraveného ²²³Ra byla stanovena na 100 % při použití 0,7M HNO₃ v 80% MeOH. Při modifikaci prostředí bylo detekováno ²²⁷Th a ²²³Ra. Radionuklidová čistota ²²³Ra byla stanovena na 96,59 %. Přítomnost ²¹¹Pb v eluátech nebyla do výpočtu čistoty eluátu ²²³Ra zahrnuta, jelikož se jedná o dceřiný nuklid ²²³Ra. Přehled nejdůležitějších dat je uveden v Tab. 1.

Papírovou chromatografií směsi ²²⁷Ac, ²²⁷Th, ²²³R a ²¹¹Pb a následným měřením alfa a gama spekter bylo zjištěno, že ²²⁷Th zůstává na startu, ²²⁷Ac má retenční faktor přibližně 0,2, ²¹¹Pb přibližně 0,7 a ²²³Ra 0,9.

Alfa spektrometrie byla provedena těsně po ukončení chromatografie (Obr. 3) a hodinu po prvním měření (Obr. 4). Gama spektra byla měřena po ukončení měření alfa spekter několikrát v průběhu jedné hodiny. Změna celkové radioaktivity je zobrazena v Grafu 3. Ze získaných dat je patrné, že v čase dochází k poklesu radioaktivity ²¹¹Pb a k nárůstu radioaktivity ²²³Ra. Radioaktivita ²²⁷Th se v čase nemění.

Diskuze

Při eluci ²²³Ra 0,7M HNO₃ v 80% methanolu bylo v jednotlivých frakcích detekováno pouze ²²³Ra. Při změně podmínek (0,7M HNO₃ v 80% methanolu a NaCl) došlo k narušení rovnováhy sorpce radionuklidů na iontoměniči a v najímaných frakcích byl detekován i mateřský nuklid ²²⁷Th. Přesto však aktivita nečistot ani v jednom případě nepřesáhla 3,5 %. Pro eluci roztoku ²²³Ra je tedy vhodnější využít směsi 0,7M HNO₃ v 80% methanolu.

Separace ²²⁷Ac, ²²⁷Th, ²²³Ra a ²¹¹Pb pomocí TODGA hydrofobizovaného chromatografického papíru korelovala s alfa a gama spektrometrií. Tuto metodu tedy lze využít ke stanovení radionuklidové čistoty.

Závěr

Směs ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra byla úspěšně rozdělena pomocí papírové chromatografie na jednotlivé frakce. Proces separace je založen na extrakční chromatografii, kde stacionární fáze je modifikována N,N,N´,N´-tetraoktyldigylokolamidem a při vyvíjení v roztoku silné kyseliny tak dochází k vzájemné separaci ²²⁷Ac, ²²⁷Th a ²²³Ra, jejichž retenční parametry mohou být standardizovány. Čistota eluátu byla ověřena alfa a gama spektrometrií. Za optimálních elučních podmínek bylo detekováno ²²³Ra a jeho dceřiné nuklidy (²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Pb). Při změně podmínek pak bylo detekováno i ²²⁷Th. Přesto je však radionuklidová čistota ²²³Ra v obou případech vyšší než 96 %. Zvolené analytické metody vzájemně potvrdily stanovené výsledky. Lze tedy konstatovat, že papírová chromatografie je vhodnou alternativní metodou pro separaci a analýzu složení směsi ²²⁷Ac/²²⁷Th/²²³Ra a po následné validaci je použitelná pro kontrolu radionuklidové čistoty preparátů ²²³Ra ale i dalších preparátů a to i bez použití gama spektrometru přímo na pracovištích nukleární medicíny.

Poděkování:

Tato práce byla částečně podpořena grantem Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy č. LK21310, grantem Technologické agentury České republiky č. TA03010027 a grantem Českého vysokého učení technického v Praze č. SGS14/084/OHK4/1D/14.

jan.kozempel@fjfi.cvut.cz