Mikroprostředí spinocelulárního karcinomu hlavy a krku jako analogie hojící se rány

Súhrn

V průběhu hojení dochází k četným interakcím mezi fibroblasty, keratinocyty a buňkami imunitního systému. Uvolňování cytokinů podporuje tvorbu granulační tkáně, která vyplňuje poraněné místo. V případě narušení regulace tohoto komplexního děje dojde ke vzniku chronické rány. Tento problém často vídáme např. u diabetiků. Granulační tkáň je velmi podobná stromatu solidních nádorů. Tato práce se věnuje paralelám mezi hojící se ránou a nádorem. Klade si za cíl přehledně popsat regulaci obou procesů. Nové poznatky v této oblasti by mohly přispět k objevení nových terapeutických možností u chronických ran i solidních nádorů.

Klíčová slova:

dlaždicobuněčný karcinom – hojení – nádory hlavy a krku – nádorové mikroprostředí

Úvod

Hojení je proces, při kterém dochází k náhradě poškozené tkáně. Může probíhat dvěma způsoby. U menších poranění, kdy je organizmus schopen poškozenou tkáň nahradit funkčně rovnocennou tkání (restitutio ad integrum), mluvíme o regeneraci. V případě větších poranění mluvíme o reparaci, kdy v místě poranění vzniká jizva (sanatio per cicatricem) [1]. V obou případech hojení začíná po hemokoagulaci zánětlivou fází, po které následuje fáze proliferační a poté finální remodelační. Při selhání regulačních mechanizmů může zánětlivá fáze hojení přejít do chronického stavu. V průběhu těchto dějů se produkuje velké množství růstových faktorů a dochází k nadměrnému množení buněk. Z toho důvodu je chronický zánět jedním z hlavních rizikových faktorů vzniku nádoru [2]. Na hlavě a krku je infekční a zánětlivý původ nádoru potvrzen už u několika anatomických lokalit. V orofaryngu jsou to nádory způsobené papilomaviry, u karcinomu nosohltanu je původcem infekce virus Epsteina-Barrové. Ač konkrétní patologické dráhy mají jednotlivé viry odlišné, společným rysem je jisté oslabení imunity nemocných, které vede v propuknutí nádorové nemoci a posléze také znesnadňuje léčbu [3]. U HPV asociovaných nádorů je dokázaná přítomnost tzv. nádorově asociovaných makrofágů a lymfocytů, které vytvářejí nádoru imunoprivilegované prostředí, což představuje velkou terapeutickou výzvu pro klinické onkology [4].

Délka hojení závisí na věku a na celkovém zdravotním stavu pacienta, případně na přidružené infekci. Obzvláště po onkologických operacích na hlavě a krku jsou infekce a případné píštěle relativně časté, a tím způsobují opoždění následné adjuvantní léčby [5] a zhoršují prognózu pacienta. Pooperační (adjuvantní) radioterapie či chemoradioterapie má být podle platných aktuálních doporučení zahájena do 6 týdnů od chirurgického výkonu [6]. Velká část nemocných kvůli komplikovanému hojení a dalším faktorům zahajuje následnou onkologickou terapii později. Podle údajů z USA se jedná až o 55 % pacientů [7]. Z výše uvedených důvodů se neustále obnovují doporučení, jak pooperačním komplikacím předcházet. Nejvíce diskutovanými tématy jsou vhodná antibio­tická profylaxe a rekonstrukční postupy po rozsáhlých operačních výkonech [8]. Předpokladem úspěšné aplikace nových postupů v léčbě je porozumění základním patofyziologickým dějům, které hojení regulují. Pochopení těchto mechanizmů by mohlo vést ke zkvalitnění a zrychlení léčebných postupů a bylo by přínosem nejen pro pacienty po rozsáhlých operacích hlavy a krku, ale i pro léčbu ran v ostatních oblastech medicíny.

Hojení

Hojení představuje kaskádu po sobě jdoucích a navzájem se překrývajících dějů. Průběh hojení je ovlivněn produkcí velkého množství růstových faktorů na straně jedné a mezibuněčnými interakcemi na straně druhé. Výsledkem tohoto komplexního procesu je obnovení integrity porušené tkáně pomocí jizvy [9]. Na průběhu hojení se podílejí buněčné populace rezidentní v poškozené tkáni i buňky, které do místa poranění aktivně migrují. Buněčné populace spolu mohou interagovat přímými fyzickými kontakty. Pro vznik prostředí, které usnadňuje hojení, je zásadní produkce velkého množství cytokinů, chemokinů i růstových faktorů, které umožňují buňkám interagovat na krátké vzdálenosti, tedy parakrinně. V úvahu je ale třeba brát i faktory působící na úrovni celého organizmu (endokrinně), tedy zejména hormony typické pro stresovou fázi. Svou roli v zadržení těchto malých molekul v místě hojení pak sehrává i extracelulární matrix, která může jednotlivé molekuly vázat i uvolňovat, a vytvářet tak jakousi depotní zásobu.

Hojení začíná hemostázou a vytvořením fibrinové zátky. Pokračuje tzv. sterilním zánětem, v jehož průběhu je produkováno velké množství cytokinů a chemokinů, které vedou k diferenciaci fibroblastů v myofibroblasty [10]. Za diferenciaci fibroblastů směrem k myofibroblastům je odpovědná zejména lokální produkce transformujícího růstového faktoru beta (transforming growth factor beta – TGFb). V in vitro experimentech bylo dokázáno, že přechod fibroblastů na myofibroblasty mohou stimulovat i další proteiny např. galektin-1 [11]. Myofibroblasty způsobují kontrakci rány a produkují velké množství extracelulární matrix [12]. Byl prokázán významný vliv komponent extracelulární matrix (extracellular matrix – ECM) na hojení tkáňového poškození [13]. Nejhojnějším proteinem ECM je fibronektin. Podrobnějším výzkumem tohoto glykoproteinu se zjistilo, že plní nejen mechanickou funkci, ale je také „rezer­voárem“ růstových faktorů, které se na něj navazují. Tím přispívá k diferenciaci jak fibroblastů, tak keratinocytů a stává se vhodným cílem medikamentózní podpory hojení [14]. Své místo v ECM má i tenascin. Je asociován s efektivním hojením sliznic v orofaciální oblasti. Právě tenascin by mohl být jedním z faktorů, který přispívá k tomu, že sliznice se hojí bez vzniku jizvy [15]. Při porovnání sliznice hojící se rány dutiny ústní a sliznice fetů se zjistilo, že v obou případech je hojná přítomnost tenascinu [15]. Tenascin je nepostradatelný pro hojení v obecnějším smyslu. Jeho exprese je prokázaná i při hojení po rekonstrukcích zkřížených vazů [16] a transplantacích rohovky [17]. V ECM jsou dále hojně zastoupeny kolageny, elastin a z glykoproteinů vedle fibronektinu a tenascinu např. galektin-1 a galektin-3.

Po vytvoření dostatečného množství extracelulární matrix do ní vrůstají krevní cévy. Tento proces představuje kvalitativní změnu tkáně, kterou lze terminologicky vymezit pojmem granulační tkáň. Extracelulární matrix se transformuje, přičemž je do nově vznikající molekulární sítě hojně ukládán zejména kolagen-1 [18]. K reparaci poranění je potřeba migrace buněk, obzvláště keratinocytů, nacházejících se na okrajích rány. Aby se zvýšil migrační potenciál těchto buněk, musí u nich dojít k epitelo-mezsenchymovému přechodu (epithel-mesenchymal transition – EMT). Keratinocyty se postupně uvolňují ze spojení s bazální laminou rozrušováním hemidesmozomů, ruší se i vzájemné mezibuněčné spoje tvořené E-kadheriny [19]. Dochází k vzájemnému ovlivňování s myofibroblasty, které produkují fibroblastový růstový faktor, jenž podporuje i migraci keratinocytů [20]. Epitelo-mezenchymový přechod keratinocytů je reverzibilní děj a po uzavření defektu získávají buňky epiteloidní charakter a vytvářejí mezibuněčné spoje [21]. Po definitivním uzavření rány keratinocyty dochází k remodelaci extracelulární matrix. Kožní hojení, na rozdíl od hojení sliznice, je postnatálně vždy spojeno s tvorbou jizvy. Jedním z faktorů určujících vzhled jizvy je hladina proteinů z rodiny TGFb. Dalším je aktivita imunitního systému a role sterilního zánětu. V regulaci zánětu se uplatňují prozánětlivé cytokiny interleukin-6 a interleukin-8. Protichůdný účinek má interleukin-10, který je protizánětlivý. Blokáda interleukinu-10 na modelu fetálního hojení u myší vedla k tvorbě jizvy [22]. Interleukin-10 byl již aplikován na rány v klinické studii, a to u myší i u lidí. Potvrdil se velmi dobrý efekt na makroskopický vzhled rány spolu s menším zarudnutím [23]. Extrémním případem jizvení, který je pro pacienta velkou zdravotní i kosmetickou zátěží, jsou hypertrofické a keloidní jizvy. Hypertrofické jizvy a keloidy jsou dvě klinické jednotky, které se však v poslední době řadí do společné skupiny fibroproliferativních chorob. Rozdíly v normálním a patologickém jizvení jsou dány zejména přítomností chronického zánětu (narušení rovnováhy mezi pro- a protizánětlivými faktory), zvýšenou proliferací buněk a produkcí ECM a její následnou remodelací [13]. Hypertrofická jizva nepřesahuje okraj původní rány, ale je zvýšená nad okolní plochu. Tyto jizvy často způsobují kontraktury, zejména v ohybových místech. V průběhu času však může docházet k jejich spontánní regresi. Keloid je definován jako kožní fibroproliferativní nádor, který nikdy nemalignizuje. Na rozdíl od hypertrofické jizvy přesahuje hranice původního poranění či chirurgického řezu [24] a nikdy nedochází k jeho samovolné regresi [25]. V primární prevenci se doporučuje respektovat linie štěpitelnosti kůže, zamezit tahu v ráně, např. použitím tapingu či aplikací silikonového krytí [26]. V léčbě je zlatým standardem lokální aplikace kortikoidu triamcinolonu, a to opakovaně po 2–4 týdnech v dávce 10–20 mg. Dá se použít buď jako samostatná léčba, anebo v kombinaci s chirurgickým výkonem. Prostá excize vede k značné rekurenci vzhledem k tomu, že dochází k opětovnému poranění kůže a následnému problematickému hojení. V případě velmi závažných případů je možno použít i radioterapii případně lokální chemoterapii [27].

Hojení bez jizvy

U člověka je bezjizevnaté hojení spojeno pouze s prenatálním vývojem plodu. Klinická praxe však ukázala, že při operacích rozštěpů rtu a patra docházelo k výrazně rychlejšímu a téměř bezjizevnatému hojení, pokud byla operace provedena v prvních 10 dnech po narození. Z tohoto důvodu se cheiloplastiky při rozštěpu rtu indikují co nejdříve po narození [28]. V rámci studia rozdílů v hojení starších dětí a novorozenců byla zkoumána jak produkce a složení extracelulární matrix, tak studován fenotyp novorozeneckých a dětských fibroblastů a keratinocytů. Bylo zjištěno, že kultivované novorozenecké kožní keratinocyty obsahují populaci velice malých buněk (cca 4 μm), které nejsou navzájem v zápoji, více než 90 % těchto buněk exprimuje vimentin a mnohé i keratiny charakteristické pro velmi nízce diferencované keratinocyty. S rostoucím věkem dětských pacientů četnost těchto znaků ubývá [29]. V případě fibroblastů nebyly nalezeny významné rozdíly mezi buňkami různě starých dětí, a to jak na úrovni RNA, tak na úrovni proteinu. Fibroblasty starších dětí však produkovaly větší množství nefibrilární složky ECM, zejména fibronektinu a tenascinu než buňky novorozenecké [30]. V rámci in vitro pokusů však bylo dokázáno, že novorozenecké keratinocyty, které se významně podílejí na rychlém a bezjizevnatém hojení, potřebují k udržení svého nezralého fenotypu součinnost s novorozeneckými fibroblasty. Pokud jsou nahrazeny fibroblasty starších pacientů, novorozenecké keratinocyty svůj fenotyp rychle ztrácejí [31]. Lze tedy předpokládat, že výše uvedené skutečnosti společně s útlumem imunitní reakce u novorozenců by mohly být odpovědné za lepší kosmetický výsledek cheiloplastik, provedených krátce po narození, v porovnání s operacemi u starších dětí.

Podobnost nádorového mikroprostředí a hojící se rány

Již v roce 1986 byla postulována základní podobnost mezi tvorbou nádorového stromatu a hojením ranné plochy [32]. Harald Dvorak charakterizoval „nádory jako rány, které se nezhojí“ [32]. Od té doby je této problematice věnována velká pozornost [11, 33].

Při vývoji nádoru, stejně jako v průběhu hojení rány, dochází ke sledu dějů, které jsou obdobné. Jedná se o následující kroky: a) infiltrace leukocyty, b) nahromadění fibroblastů a jejich částečná přeměna na myofibroblasty, c) produkce extracelulární matrix a prorůstání kapilár do nově tvořené tkáně, d) sekrece proteáz fibroblasty a myofibroblasty, e) proliferace epitelových buněk a s tím související EMT. V případě ranné plochy jsou všechny tyto kroky časově omezené a vyústí ve zhojení rány a remodelaci jizvy, v případě nádoru se jedná o nikdy nekončící proces, který vede k tvorbě nádoru, jeho růstu a následné diseminaci (obr. 1) [34, 35]. V případě obou těchto procesů hraje zásadní roli vytvoření podpůrné tkáně – granulační v případě hojení a nádorového stromatu u tumoru. Nádorové mikroprostředí se skládá z buněčné části a ECM. Tvoří ho zaprvé buňky, které již v dané lokalitě jsou, zejména lokální fibroblasty či endotelové buňky. Fibroblasty se vlivem nádorových buněk aktivují, začnou vytvářet hladký svalový aktin (smooth muscle actin – SMA) a získávají sekreční fenotyp. Endotelové buňky jsou naopak spojeny s vaskularizací vytvářené tkáně. Angiogeneze je podporována růstovými faktory VEGF (vascular endotelial growth factor) a bFGF (basic fibroblast growth factor). Oba stimulují endoteliální buňky k produkci proteolytických enzymů, které odbourávají ECM, což umožňuje jejich migraci, proliferaci a následně i novotvorbu cév [36]. V nádorovém stromatu však proces degradace ECM umožňuje nejen angiogenezi, ale také rozsev tumoru.

Za druhé jsou to buňky migrující ze vzdálených lokalit, mezi které počítáme buňky imunitního systému a cirkulující mezenchymové kmenové buňky. Populace imunitních buněk je heterogenní, obsahuje různé typy lymfocytů, ale i makrofágy, neutrofily a myeloidní supresorové buňky [37].

Takto vzniklé mikroprostředí aktivně komunikuje a spolupracuje s nádorovými buňkami na dalším rozvoji nádoru. Je schopné udržovat nízký diferenciační stav nádorových buněk a chránit je před účinky protinádorové terapie [38]. Nejvýraznější buněčnou populací nádorového stromatu jsou aktivované fibroblasty, které nazýváme nádorově asociované fibroblasty (cancer associated fibroblasts – CAFs). Jejich původ se odvozuje jak od lokálních fibroblastů, tak od migrujících mezenchymálních buněk. CAFs produkují velké množství růstových faktorů, cytokinů, chemokinů a imunomodulačních látek. Mezi nejdůležitější patří zejména IL-6, IL-8, CXCL1, TNFa, TGFb. Právě na pou- žití monoklonálních protilátek proti jednotlivým proteinům je založena bio­logická léčba. Podrobný přehled látek užívaných pro bio­logickou léčbu jsme zpracovali v článku „Nádorové mikroprostředí“ [39]. Klinická praxe však ukazuje, že blokace jednoho proteinu či receptoru není dostatečná, ale je potřeba více cílových molekul. Další významnou skupinou látek, které hrají významnou roli jak v hojení, tak nádorovém bujení, jsou galektiny (Gal). Galektiny, z rodiny endogenních lektinů, mají velmi široký bio­logický dopad; mezi nejvýznamnější patří Gal-1, Gal-3 a Gal-7 [40]. Gal-1 je spojován se všemi fázemi růstu a metastazace nádoru a hraje významnou roli jak v nádorových buňkách, tak i v buňkách mikroprostředí. Jeho funkce je velmi široká, podílí se na úniku nádoru z působení imunitního systému a podporuje růst, vaskularizaci a metastazování nádoru. Naproti tomu v průběhu hojení Gal-1 zrychluje kontrakci ranné plochy a pomáhá udržovat kmenový charakter migrujících keratinocytů v průběhu epitelizace. Podobné účinky má v případě nádoru i hojení Gal-3, který urychluje reepitelizaci rány [41].

Galektiny se vyskytují jak intracelulárně, tak i v mezibuněčném prostoru jako součást ECM. Vedle proteinů/glykoproteinů obsahuje ECM i glykosaminoglykany a proteoglykany. Glykosaminoglykany zajišťují hydrataci a také slouží k ukotvení růstových faktorů. Důležitým zástupcem je kyselina hyaluronová, která je produkována a akumulována v nádorovém stromatu. Vyskytuje se ve dvou různých formách – jako nízkomolekulární (low-molecular weight – LMW) a vysokomolekulární (high-molecular weight – HMW). I když se jedná o jednu látku, obě formy působí různě na vývoj nádoru. LMW zvyšuje proliferační a migrační kapacitu nádoru, zatímco vysokomolekulární forma omezuje růst nádoru, zánětlivou reakci i neoangiogenezi [42]. Kyselina hyaluronová podporuje proces hojení, a to jak fázi zánětlivou, tak i tvorbu granulační tkáně. Tím, že omezuje nadprodukci kolagenu v průběhu hojení, pozitivně ovlivňuje výsledný vzhled jizvy. Mezi významné proteiny obsažené ve stromatu patří zejména kolagen, fibronektin, tenascin, laminin. Zatím co většina výše jmenovaných proteinů se vyskytuje i ve zdravé tkáni, tenascin, jak již bylo uvedeno, se v tkáních dospělého člověka vyskytuje zřídka. Lze jej však nalézt v hojící se tkáni a za patologických stavů, jakými jsou chronický zánět či nádor [43]. Jeho exprese je aktivována pomocí osy Twist1–Prrx1, což je klíčový regulátor nádorově asociovaných fibroblastů, a tedy přímo CAFs indukují expresi tenascinu [44]. U nemalobuněčného karcinomu plic či kolorektálního karcinomu byl tenascin popsán jako negativní prognostický znak asociovaný se zvýšenou agresivitou nádorové nemoci [45]. Předpokládá se, že tenascin blokuje na fibronektinu vazebná místa pro proteoglykany, a tím inhibuje adhezi buněk. Výsledkem je zvýšení invazivity nádoru [46]. U karcinomů hlavy a krku tato asociace zatím potvrzena nebyla [47]. V neposlední řadě je nutno zmínit podobnost mezi hojením a nádorem a v regulaci apoptózy a senescence, tj. přechodu do stadia, kdy se buňka již nedělí, ale zároveň nepodléhá apoptóze. Nicméně, jedná se o tak rozsáhlá témata, že přesahují možnosti této práce a budou, doufejme, námětem pro další.

Závěr

I přes výše uvedené podobnosti jsou hojící se rána a nádor zcela opačné bio­logické jednotky a jejich léčba vyžaduje komplexní přístup, který změní celkové mikroprostředí v ráně i v tumoru. Právě v těchto postupech je ten zásadní rozdíl. U chronické rány je potřeba zajistit nejen dostatek kmenových buněk, ale i udržení jejich kmenovosti a s tím související dostatek růstových faktorů. Naproti tomu při léčbě nádoru je cílem zasáhnout a změnit jeho mikroprostředí (tvořené ECM a podpůrnými buňkami) tak, aby přestalo chránit a udržovat kmenovost nádorových buněk.

Lepší pochopení komunikace mezi nádorovými buňkami a stromatem karcinomu může přispět nejen k účinnější léčbě nádorů, ale zlepšit i proces hojení u rozsáhlých kožních ztrát a chronických ran. Laboratorní pokusy i klinické studie ukazují, že blokace jedné molekuly či jednoho receptoru v případě nádoru či přidání jediného růstového faktoru v případě hojící se rány není dostatečné. K dosažení větších úspěchů bude potřeba hledat komplexní přístupy, které by zasáhly různé signální molekuly v různých časových úsecích.

Prohlášení o střetu zájmů

Autorka práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku ne­byly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Grantová podpora

Projekt „Centrum nádorové ekologie – výzkum nádorového mikroprostředí v organizmu podporujícího růst a šíření nádoru“ (reg. č. CZ.02. 1.01/0.0/0.0/16_019/0000785) je podpořen z Operačního programu Výzkum, vývoj a vzdělávání.

ORCID autorů

V. Bandúrová ORCID 0000-0002-1754-7737,

K. Smetana jr. ORCID 0000-0002-7878-8403,

J. Plzák ORCID 0000-0003-3710-4455,

B. Dvořánková ORCID 0000-0002-3914-9668.

Přijato k recenzi: 12. 2. 2021

Přijato k tisku: 12. 4. 2021

MUDr. Veronika Bandúrová

Klinika otorinolaryngologie a chirurgie hlavy a krku

1. LF UK a FN v Motole

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

veronika.bandurova@fnmotol.cz