17. SYMPOZIUM ASISTOVANÉ REPRODUKCE

1. Výstupy z Národního registru asistované reprodukce ve struktuře European IVF monitoring programme

K. Řežábek, M. Mrázek, J. Štěpán

Rada Národního registru asistované reprodukce

Úvod: Jedním z cílů Národního registru asistované reprodukce (NRAR) je poskytnout údaje pro mezinárodní registry, především European IVF monitoring programme (EIM), který je ESHRE veden jako oficielní evropský registr asistované reprodukce. NRAR sbírá data tak, aby z nich bylo možné výstupy pro EIM připravit.

Materiál a metodika: Připravili jsme přesně specifikované analytické querry, které z přibližně 12 000 cyklů dosud zapsaných v NRAR získaly údaje podle definic EIM. Za spolupráce s Koordinačním střediskem zdravotnických informačních systémů (KSRZIS), které registr spravuje, byly následně souhrnné údaje za celou Českou republiku extrahovány.

Výsledky: Byly analyzovány cykly zahájené v 1. pololetí 2007. V této době bylo v ČR 25 center AR, z nich 23 dodávalo data do NRAR. Bylo provedeno 946 cyklů s oplozením IVF a 4 116 cyklů s oplozením ICSI. Bylo provedeno 1 436 kryoembryotransferů, 235 cyklů s přijetím darovaných embryí. Ve 144 cyklech byla provedena preimplantační genetická diagnostika. Celkově proběhlo za první pololetí 2007 v ČR 6 877 cyklů ART podle metodiky EIM, což je v přepočtu 1 453 cyklů na milion obyvatel za rok. Další detailní data pro EIM budou obsahem ústního sdělení.

Závěr: NRAR poskytne všechna data potřebná pro EIM, příprava výstupů je však náročná. Dodávání dat do NRAR v 1. roce ostrého provozu se jeví jako úspěšné.

2. Transvaginální endoskopie – přínos a praktický význam pro diagnostiku a racionální léčbu neplodnosti

T. Mardeši^®

Pronatal, Praha

Úvod: Cílem práce je demonstrovat význam, možnosti, rizika a přínos transvaginální endoskopie v diagnostickém algoritmu vyšetřování neplodnosti v porovnání s klasickou laparoskopií.

Materiál a metodika: Do souboru bylo zařazeno 94 neplodných párů, u nichž byla jako součást vyšetření neplodnosti před nejméně 12 měsíci provedena transvaginální endoskopie. Diagnostická hysteroskopie, transvaginální hydrolaparoskopie a případně salpingoskopie byly provedeny v ambulantním režimu v krátké anestezii s použitím instrumentaria pro transvaginální hydrolaparoskopii firmy Storz. Pokud zjištěný nález připouštěl spontánní koncepci, byla doporučena další 36měsíční snaha o spontánní koncepci při současném monitorování či indukci ovulace. Při trvání neplodnosti byly doporučeny 23 intrauterinní inseminace (IUI) po nízce dávkované stimulaci gonadotropiny a nedošlo-li k otěhotnění, byla doporučena další léčba v programu mimotělního oplodnění (IVF). Výsledky tohoto postupu byly hodnoceny ve vztahu k nálezu zjištěnému při transvaginální endoskopii.

Výsledky: Nezaznamenali jsme žádnou komplikaci (zejména perforaci střevní kličky) a všechny pacientky mohly být bez obtíží propuštěny 2 hod po provedeném vyšetření. Abnormální nález byl dokumentován u 56 pacientek (59,6 %), u 38 žen (40,4 %) nebyl zjištěn. Nejčastější abnormitou byla endometrióza u 36 žen (38,3 %) následovaná tubárním faktorem neplodnosti u 18 žen (19,1 %). Ve sledovaném souboru zůstává bezdětných 28 párů (29,8 %), otěhotnělo doposud 66 žen (70,2 %) – 24 žen s normálním nálezem (63,2 %), 22 žen s endometriózou (61,1 %) a všech 18 žen s tubárním faktorem neplodnosti.

Závěr: Transvaginální endoskopie je ambulantní, bezpečná a technicky dobře zvládnutelná metoda. Její jednoduchost a minimální zatížení pacienta ji předurčuje k časnému zařazení do vyšetřovacího algoritmu neplodnosti u žen bez zjevného patologického nálezu na vnitřních rodidlech a v malé pánvi. Hlavní předností je včasné stanovení optimálního terapeutického postupu.

3. Kam směřuje preimplantační genetická diagnostika a screening aneuploidií

K. Veselá, J. Veselý, P. Trávník, J. Rubeš

Repromeda, Brno

Genprogress, Brno

V posledních letech se v odborné literatuře objevily studie zpochybňující pozitivní efekt screeningu aneuploidií na zlepšení take–home baby rate (THBR) u žen s vyšším věkem a s předchozím opakovaným selháním implantace. Někteří autoři zpochybňují efekt PGS i u párů s opakovaným potrácením. Tito autoři vycházejí s vlastních zkušeností s metodou PGD a referují o vlastních, skutečně ne příliš povzbuzujících výsledcích.

Jiná pracoviště naopak uvádějí protichůdná sdělení a spojují s PGS vyšší live birth rate.

Bez ohledu na výsledky studií se k užití této techniky uchyluje stále více párů, a to zejména těch, které ve standardním IVF programu neuspěly nebo mají rizikové faktory, které je zařazují do skupiny párů s tzv. poor prognosis, aby se takto pokusily najít další možnosti, jak se vyhnout darování oocytů a/nebo spermií a docílit biologického rodičovství s vlastními gametami.

Jaké tedy mohou být příčiny nízké úspěšnosti PGD na některých pracovištích? Jak tyto informace eventuálně využít ke zlepšení výsledků? Jakou další cestou se má PGD a screening aneuploidií ubírat? Je v rámci Evropy zavedena dostatečná kontrola kvality center a laboratoří, která PGD provádějí?

Zdá se, že izolovaný sběr dat v rámci center Konsorcia není sám o sobě plně dostačující. Nabízí se integrace evropských center do prospektivní randomizované multicentrické studie, která by napomohla tyto otázky objasnit. Dalším milníkem je zavedení akreditace a externí kontroly kvality ve všech centrech, která PGD provádějí. V současnosti Konsorcium PGD ESHRE ustanovilo již několik komisí, např. komisi pro PGS (screening aenuploidií), komisi pro misdiagnózu PGD a komisi pro akreditaci PGD center.

4. Significance of LH in ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization.

R. Kurzawa, T. BÑczkowski, P. Ciepiela

Department of Reproductive Medicine and Gynecology, Pomeranian Medical University, Szczecin, Poland

Controlled ovarian hyperstimulation results in multiple follicular growth and retrieval of several oocytes. This is achieved by daily administration of gonadotrophins. During the stimulation, LH may reaches supra–physiological levels, therefore control of LH release is mandatory. This is achieved by administration of GnRH agonists or antagonists. Long luteal protocol depends on administration of GnRH analog from the luteal phase of the cycle to be followed by daily administration of gonadotrophins after the pituitary suppression has been reached. The GnRH antagonists in turn, are given during the stimulation with gonadotrophins, when estradiol reaches levels possibly triggering LH surge.

Both protocols, along with the type of used gonadotrphins, change significantly the profile of LH release during the stimulation. It is not only that the surge of LH is blocked, but the release of LH may be too strong to maintain proper follicular development. FSH and LH regulate several intrafollicular processes, therefore the adequate proportion between FSH and LH is crucial for the success of stimulation.

FSH recruits and stimulates follicular growth at the initial, early to mid follicular phase of the stimulation. LH regulates synthesis of androstendion (a substrate for aromatisation into estradiol) from cholesterol, what is achieved by interaction with LH receptors on theca cells. LH also decides upon atresia of small follicles, promoting further development of larger follicles (> 14 mm), by mechanisms which have not been well learnt yet. However, LH role seems to be particularly important in the second, mid to late follicular phase of the stimulation when its receptors appear also on granulosa cells of the follicle, and the follicles reach at least 10 mm in diameter.

At that stage, supplementation of FSH with LH results in acceleration in follicular growth, shortens ovarian stimulation, yields high proportion of mature oocytes as well as reduces the risk of ovarian hypaerstimulation syndrome. Interestingly, it also diminishes the probability of premature luteinization, influencing receptivity of endometrium and improving pregnancy rates.

The precise way of LH action on cellular lever has not been established in humans so far. Murine experiments indicate, that LH improves cooperation between granulosa cells and oocytes in cumulus–oocyte complexes of the follicles. The cooperation is possible thanks to gap junctions between follicular cells and oocytes and their protrusions, linking physically the cells through zona pellucid (transzonal projections). LH may stimulate release of several growth factors of EGF and TGF family.

LH should be supplemented in all patients at the end of gonadotrphin stimulation. However, the adequate serum LH levels and the proportion between follicular FSH and LH levels are particularly important in patients with hypothalamic hypogonadism, decreased ovarian reserve, in poor responders as well as in patients in more advanced reproductive age. It is assumed that the therapeutic LH window ranges from 0,50,7 to 3 IU/L.

5. Vyšetření spermií – dnešní možnosti

P. Trávník, K. Veselá, J. Veselý, L. Hromadová, G. Tauwinklová, E. Oráčová

Repromeda, Brno

Klasický spermiogram byl koncipován v době, kdy jediným jeho reálným přínosem bylo rozhodnutí o případném použití spermií dárce. Dnes nám pomáhá rozhodnout o použití metod asistované reprodukce, o volbě mezi klasickou fertilizací in vitro a intracytoplazmatickou injekcí spermie, pomáhá při rozhodování o použití preimplantační genetické diagnostiky. Byla získána řada nových poznatků, které umožňují vysvětlit selhání fertilizace, ale i neadekvátní vývoj embryí v preimplantačním a postimplantačním období vývoje.

Práce obsahuje analýzu 3 600 spermiogramů s průměrnou koncentrací spermií 31,6 milionů na ml a průměrnou pohyblivostí 45 % provedených v sanatoriu Repromeda. Byly zhodnoceny jejich parametry a srovnány s úspěšností různých metod asistované reprodukce v daných případech.

Výsledky ukázaly, že účinnost metod asistované reprodukce u těžších případů oligoastenoteratospermie lze zvýšit použitím preimplantační genetické diagnostiky.

6. Viacnásobná gravidita po kryoembryotransfere

J. Vojtaššák¹, J. Malová¹, V. Geislerová¹, T. Braxatorisová¹, V. Repiská¹, M. Korbeľ², I. Lehocký³, E. Véghová⁴, Ľ. Danihel 5, Z. Nižňanská2

¹Ústav lekárskej biológie a genetiky LF UK, Bratislava, Slovensko

²I. gynekologicko–pôrodnícka klinika LF UK a FNsP, Bratislava, Slovensko

³Kriminalistický a expertízny ústav PZ, Bratislava, Slovensko

⁴Centrum lekárskej genetiky FNsP, Bratislava, Slovensko

⁵Ústav patologickej anatómie LFUK, Bratislava, Slovensko

Úvod: U 30ročnej pacientky liečenej pre sterilitu bol urobený kryoembryotransfer 2 embryí. Ultrazvukovým vyšetrením boli zistené 4 gestačné vaky bez detegovateľných embryonálnych štruktúr. Bola suponovaná molárna gravidita (mola hydatidosa completa). Následne bola gravidita ukončená a získaný materiál morfologicky a geneticky analyzovaný.

Materiál a metodika: Morfologická a histologická analýza zachytených gestačných vakov (GV), založenie tkanivových kultúr (priama, krátkodobá, dlhodobá). Pre chromozómovú analýzu boli kultivované tkanivá všetkých gestačných vakov (MEM + 10 % BFS), chromozómy farbené konvenčne a G–pásikovaním (Seabright 1972). Analýza DNA zo všetkých gestačných vakov použitím kitu AmpF/STR IdentifierTMPCR Amplification kit, produkty amplifikácie analyzované na ABI PrismTM3130 Genetic analyzer a vyhodnotené pomocou softvéra GeneMapperTM ID Software verzia 3,2.

Výsledky: V zachytenom materiály bolo identifikovaných 8 gestačných vakov o priemere 516 mm. Histologicky išlo o súčasti plodového vajca, klky ako pri fyziologickej gravidite. Karyotyp 46,XY u všetkých GV. DNA analýza zistila identické polymorfizmy u všetkých zachytených GV.

Záver: Po kryoembryotransfere 2 embryí jedno zaniká a druhé sa opakovane patologicky delí a dáva vznik 8 gestačným vakom.

7. Homocystein, cystein a glutathion ve folikulární tekutině a krvi při ovariální stimulaci FSH

I. Crha¹, J. Kubešová², J. Tallová², P. Ventruba¹, J. Žáková¹, J. Jarkovský³, M. Huser¹

¹Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno

²Biochemický ústav LF MU, Brno

³Institut biostatistiky a analýz MU, Brno

Úvod: Homocystein (Hcy) je neesenciální aminokyselina obsahující thiolovou funkční skupinu. Tato látka vzniká v organizmu při metabolizmu methioninu a může být přeměněna v transsulfurační cestě na cystein (Cys), glutathion (GSH), taurin a anorganický sulfát. Zvýšené hladiny Hcy jsou rizikovým faktorem vzniku různých patologií včetně poruch reprodukce. Publikované klinické práce uvádějí významnou souvislost mezi metabolizmem Hcy a steroidních hormonů, zvláště pak estrogenů. Cílem této studie bylo 1. stanovit koncentraci Hcy, Cys a GSH ve folikulární tekutině, 2. sledovat jejich změny v krvi při ovariální stimulací, 3. posoudit korelaci mezi koncentrací v krvi a folikulární tekutině a 4. analyzovat vztah mezi Hcy, počtem získaných oocytů a dosaženým těhotenstvím.

Materiál a metodika: Byly získány a vyšetřeny vzorky krve (při zahájení stimulace a ovariální punkci) a folikulární tekutiny od 14 žen (31,4 + 2,8 let) léčených metodou IVF/ICSI. Vyšetření homocysteinu, cysteinu a glutathionu bylo provedeno metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie s fluorescenční detekcí. Metodika vyšetření homocysteinu ve folikulární tekutině je prioritou Biochemického ústavu LF MU. Ovariální stimulace, monitorování a další výkony asistované reprodukce byly provedeny podle standardů pracoviště. Pro srovnáni hodnot v krvi před a po stimulaci byl použit Wilcoxonův párový test, pro srovnání mezi skupinami pacientů pak Mannův–Whitneyův test pro korelace mezi proměnnými neparametrická Spearmanova korelace.

Výsledky: Při stimulaci recFSH (2300 + 600 IU) a dosažené hladině 17–beta estradiolu 15,7 + 11,3 nmol/l se v plazmě signifikantně snížila koncentrace Hcy z 11,2 + 2,9 umol/l na 9,2 + 2,7 umol/l (p = 0,001), koncentrace Cys poklesla z 244,1 + 29,5 umol/l na 211,1 + 31,3 umol/l (p = 0,001). Hladina GSH (umol/l) se nesignifikantně zvýšila z 10,9 + 3,7 na 16,4 + 14,3. Ve folikulární tekutině byla koncentrace Hcy 7,8 + 3,9 umol/l a Cys 155,2 + 47,4 umol/l, byla prokázána korelace s koncentrací těchto látek v krvi při zahájení stimulace i ovariální punkci. Signifikantní rozdíly koncentrace Hcy, Cys a GSH ve folikulární tekutině se získanými oocyty (11,9 + 6,6) a bez oocytů prokázány nebyly. Nebyla prokázána ani souvislost mezi koncentrací Hcy, Cys, GSH a počtem získaných embryí (7,3 + 3,5) nebo dosaženým těhotenstvím (42,8 %).

Závěr: Studie prokázala signifikantní pokles hladin Hcy a Cys v krvi při ovariální stimulaci za vzestupu hladin 17–beta estradiolu. Hodnoty Hcy a Cys ve folikulární tekutině korelovaly s koncentrací v séru. Souvislost mezi počtem získaných oocytů, embryí, dosažením těhotenství a hladinou Hcy, Cys a GSH nebyla prokázána.

Podpořeno Grantem IGA FN Brno 10/05.

8. Důsledky rostoucího průměrného věku žen léčených pro neplodnost

A. Sobek jr, B. Hladíková, J. Vodička, P. Holub, E. Tkadlec, A. Sobek

FERTIMED centrum pro léčbu neplodnosti, Olomouc

Katedra biologie UP, Olomouc

Úvod: Průměrný věk žen při prvním porodu stoupá. Na jednu stranu jde o jev společensky pozitivní, ženy si pořizují dítě až v době, kdy jsou hmotně více zajištěny. Na druhou stranu lze však očekávat i negativní dopady. Jak se odklad mateřství projeví ve skupině žen léčených pro neplodnost?

Materiál a metodika: V prospektivní studii jsme od roku 1995 shromažïovali údaje o všech ženách podstupujících léčbu neplodnosti metodou mimotělního oplodnění (IVF). Shromažïovali jsme anamnestická data, údaje o vyšetřeních předcházejících IVF i data o samotném IVF. Data byla zpracována a statisticky vyhodnocena.

Výsledky: V období 1995–2006 byla z celkového počtu 4 689 žen léčených metodou IVF v našem centru kompletní data shromážděna u 4 066 pacientek. Průměrný věk pacientek vzrostl v uvedeném období o 3,3 roků (28,7 versus 32; p > 0,0001).

U pacientek ve věku nad 25 let jsme prokázali pokles bazálních hladin FSH, pokles průměrného zisku oocytů, zvýšení množství FSH potřebného ke stimulaci, vzrůst počtu jednotek FSH, nutných pro zisk jednoho oocytu a dále pokles průměrných hladin E2 v den 2. V rozmezí 2437 let je pokles reakce ovarií lineární, nad 37 let je již pokles parabolický. U pacientek mladších 23 let je reakce ovarií také nižší. Nejvyšší míry odezvy ovarií na léčbu je dosahováno ve věku 2425 let.

Závěr: Vzrůstající průměrný věk žen léčených pro neplodnost metodou IVF přináší pokles reaktivity ovarií při stimulaci. Vzrůstá procento žen hodnocených jako low–responders a také procento žen se zcela afunkčními ovarii. Doporučení gynekologů by mělo znít: Biologicky nejvhodnější doba pro otěhotnění je 25 let.

9. Korekcia multinukleácií v priebehu 2. embryonálného delenia neupravuje aneuploidný stav 4bunkového ľudského embrya

D. Hlinka, V. Weber, M. Kosarová, K. Širučková, V. Sobotka, T. Mardeši®

Pronatal, Praha

Úvod: Zvýšený výskyt aneuploidií v multinukleárnych bunkách včasných embryí sme potvrdili v našej predošlej práci. Aj v skupine mononukleárnych 4bunkových (bb) embryí je však viac ako polovica embryí mozaická resp. aneuploidná. Jeden z mechanizmov vzniku tohto javu sme poprvý krát zaznamenali u 4bb D2 (dvojdňových) embryí, ktoré sa do mononukleárneho stavu vyvinuli z 2bb multinukleárnych štádií.

Materiál a metodika: Len 2bb embryá s jasne definovaným nukleárnym stavom sme použili pre následnú anylýzu. Deliace vretienko sme vizualizovali polarizovaným svetlom pomocou Oosightr mikroskopického a softwarového systému. Dynamiku správania sa chromatínu v priebehu 2. mitotického delenia sme intravitálne zisťovali po jeho ofarbení fluorescenčným farbivom Hoechst 33342. Sekvenčná mikrofotografia spojených obrazov slúžila k individuálnej analýze priebehu 2. embryonálneho delenia. Ploidiu všetkých 4 buniek embrya sme následne stanovili štandardnou FISH metódou u tých embryí, ktoré sa vyvinuli do 4bb mononukleárneho stavu a dali ju do vzťahu k nukleárnemu stavu pôvodných 2bb embryí.

Výsledky: Ku korekcii multinukleácii došlo v 37 % prípadoch (54 zo 148 embryí). Signifikantne menej (17 vs. 77 %) plne euploidných embryí sme zistili v skupine embryí s korekciou multinukleácií (9 z 54) v porovnaní s tými, ktoré sa vyvinuli z mononukleárnych 2bb štádií (37 z 48).

Záver: 1. mitotické delenie je prvým možným zdrojom embryonálnych chromozomálnych aneploidií. Nestabilita interchromozomálnych spojení (ICS) po maternálnej a paternálnej syngamii je jednou z možných príčin malsegregácií (hlavne anfázového zaostávania) a straty chromozómov (monozómie sú najčastejším nálezom pri PGS). Výsledkom nestability ICS je formovanie viacerých jadier v 2bb štádiu, kedy separované chromozómy reagujú na interfázny stav cytoplazmy dekondenzáciou a formovaním jadrovej membrány okolo izolovaných zhlukov chromatínu. V následnom cykle síce môže dôjsť ku korekcii tohto stavu a sformovanie 1 jadra, ale straty chromozómov sú väčšinou nevzvratné. Vzhľadom na zistené skutočnosti sme zaradili sledovanie nuklearity u 2 bb embryí (D1 – včasne a D2 neskoro sa deliace) do našeho systému selekcie embryí.

10. Línia 1. embryonálneho delenia je predurčená pozíciou PN v dobe tesne pred nástupom 1. mitózy

D. Hlinka, V. Weber, M. Kosarova, K. Širučková, V. Sobotka, T. Mardeši®

Pronatal, Praha

Úvod: 1. mitotické delenie syngamia je prvým možným zdrojom embryonálnych aneuploidií. Predpokladá sa, že normálne formovanie a funkcia deliaceho vretienka (DV) má zásadný vplyv na rovnomerné rozdelenie chromozómov medzi dcérske bunky. Z toho dôvodu sme sekvenčnou mikrofotografiou poprvý krát zmapovali priebeh a chronológiu procesu migrácie prvojadier (PN°s) a syngamie ľudských embryí.

Materiál a metodika: Migráciu PN°s sme zaznamenávali v 13minutových intervaloch. Vytváranie a zmeny morfológie DV sme intravitálne sledovali polarizovaným svetlom Oosightr systému a korešpondujúce chromozómy sme vizualizovali v epifluorescencii po expozícii embryí v Hoechst 33342 farbive. Sekvenčná mikrofotografia spojených obrazov slúžila k individuálnej analýze priebehu 1. embryonálneho delenia.

Výsledky: 1. PN°s neustále migrujú v cytoplazme až do doby ich rozpadu, 2. začiatok syngamie je variabilný: 2030 hod po oplodnení, 3. trvanie 1. mitózy je taktiež veľmi variabilné: 1,45–3,5 hod, 4. po rozpade PN°s sa metafázne chromozómy usporiadajú presne v línii spájajúcej predchádzajúcu pozíciu PN°s a DV sa vytvára v tangenciálnej rovine medzi miznúcimi PN°s, 5. pre polymerizáciu tubilínu je nevyhnutný rozpad oboch PN°s (1PN zygóty sú v skutočnosti asynchróniou v rozpade PN°s – DV sa ale v týchto zygótach nikdy nenachádza), 6. u viac ako 95 % sledovaných embryí (poč. 384) sme detekovali bipolárne DV, 7. v prípade absencie bipolárnej štruktúry DV sa chromózomy nachádzali chaoticky roztrúsené v jeho okolí, 8. migrácia a rotácia DV počas 1. mitózy je už minimálna a 9. k deleniu embrya dochádza v línii danej spojnicou predchádzajúcej pozície PN°s.

Záver: Viac ako 95 % embryí vykazuje prítomnosť bipolárneho DV počas 1. mitózy. Na druhej strane ale viac ako 50 % včasných embryí vykazuje prítomnosť aspoň 1 multinukleárnej bunky. Z toho možno predpokladaľ, že multinukleácie väčšinou vznikajú iným mechanizmom a nie ako dôsledok abnormít DV. Nestabilita interchromozomálnych spojení (ICS) po maternálnej a paternálnej syngamii je jednou z možných príčin malsegregácií počas 1. mitózy, s čím môže súvisieľ aj vysoká variabilita v trvaní 1. metafázy. Periférna lokalizácia PN°s následné acentrálne formovanie DV má za následok nepravidelné delenie a tým aj nerovnomernú distribúciu bunkových organel a metabolitov medzi dcérske bunky. Otázkou zostáva rola polarity oocytu pri tomto procese. Z praktického hľadiska poznatky o migrácii PN°s poukazujú na opatrnosť pri selekcii zygót na základe lokalizácie PN°s. Vývoj a teda aj migrácia PN°s u jednotlivých zygót je proces asynchrónny, a preto hodnotenie v 1 časovom úseku nemôže byť úplne objektívne.

11. Benefit IMSI ve srovnání s konvenční ICSI

R. Hüttelová, P. Uher, V. Petříková, H. Zech

IVF Institut, Plzeň

Úvod: Funkce spermií souvisí nejen s jejich obecně hodnocenými parametry (množství, pohyb, celková morfologie), ale rovněž závisí na jejich skutečné zralosti a na morfologických detailech. Defekty cytoplazmy spermie mohou způsobit zpoždění embryonálního dělení či fragmentaci embryí. Defekty jádra spermie mohou díky DNA fragmentaci, zachováním histonů nebo např. retencí cytoplazmy způsobit takové poškození embrya, že nedochází k jeho implantaci, případně je důvodem spontánního abortu atd. Retrospektivní studie ukázaly vliv morfologie injikovaných spermií na úspěšnost fertilizace, kvalitu embryí a na dosažení těhotenství. V případě konvenční ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) je selekce spermie prováděna při zvětšení 200x, event. 400. Při tomto rozlišení je možné hodnotit pouze základní morfologická kritéria (tvar hlavičky, bičíku, cytoplazmatické kapky). Je však nemožné detegovat další abnormality, jako jsou např. vakuoly, které jsou znakem špatné kondenzace chromatinu a značí poškození jaderné DNA. Tyto detaily jsou zobrazitelné při technice IMSI (Intracytoplasmic Morphological Selected Sperm Injection), kdy je běžně používané zvětšení 6000

Materiál a metodika: Cílem studie bylo potvrdit benefit IMSI v porovnání s konvenční ICSI. Pro provedení IMSI byla v první řadě použita spermie normálního tvaru bez nebo s maximálně 1–2 drobnými vakuolami. Nebylo-li možné nalézt odpovídající spermii, byla použita spermie s 1 velkou vakuolou a normální morfologií. Třetí volbou pak byla spermie s velkou vakuolou a abnormálního tvaru i velikosti hlavičky. Jako kontrolní skupina byly použity oocyty injikované při konvenční ICSI.

Výsledky: Z celkového počtu 118 oocytů bylo 61 injikováno při ICSI a 58 při IMSI. Mezi oběma skupinami nebyl nalezen rozdíl ve fertilizaci (75 % ICSI, 76 % IMSI) ani v počtu embryí vyvíjejících se normálně do D3 (83 % ICSI, 78 % IMSI). Avšak signifikantně vyšší počet embryí dosáhl stadia blastocysty ve skupině IMSI (12 % ICSI, 38 % IMSI).

Závěr: Ačkoliv předpokládáme, že při konvenční ICSI jsme schopni rozlišit spermii s abnormálním tvarem a velikostí hlavičky, IMSI dávají větší možnost vybrat normální spermii s ohledem na specifické jaderné defekty, jako jsou vakuoly. Velikost a počet vakuol snižuje počet embryí vyvíjejících se až do stadia blastocysty, ale nemají vliv na počet embryí D3 kultivace. Vliv těchto defektů na časný vývoj embrya se řadí mezi tzv. pozdní paternální efekt.

12. Děti narozené po intracytoplazmatické injekci spermie (ICSI): faktory neplodnosti, průběh těhotenství a porodu, perinatální období

M. Šnajderová^1,2, T. Mardeši^®2,3, D. Zemková¹, A. Šípek^4,5, V. Gregor^2,6, D. Krejčířová^2,7,

D. Sobotková⁴, J. Kraus⁸, V. Lánská⁹

¹Pediatrická klinika 2. LF UK a FN Motol, Praha

²Institut postgraduálního vzdělávání ve zdravotnictví, Praha

³Sanatorium Pronatal, Praha

⁴Ústav pro péči o matku a dítě, Praha

⁵3. LF UK, Praha

⁶Oddělení klinické genetiky FTN, Praha

⁷Oddělení klinické psychologie FTN, Praha

⁸Dětská neurologická klinika 2. LF UK a FN Motol, Praha

⁹Oddělení statistiky IKEM, Praha

Úvod: Cílem sdělení je analýza faktorů neplodnosti, průběhu těhotenství, perinatálního období, porodu a údajů o novorozencích počatých po ICSI a jejich porovnání s běžnou populací. Dětí narozených po ICSI v naší populaci významně přibývá, uvedená problematika má proto nepochybně stoupající význam. Nově založený Národní registr údajů o asistované reprodukci (AR) je zatím neúplný a neumožňuje porovnat naše výsledky s konvenční IVF.

Materiál a metodika: V prospektivní otevřené průřezové klinické studii byly sledovány faktory neplodnosti, průběh těhotenství, perinatální období a údaje o novorozenci u 135 českých dětí z 1– a 2četných těhotenství počatých po ICSI v 1 centru asistované reprodukce a narozených ze 114 gravidit 110 rodičovským párům. Výsledky byly porovnány s populační normou (s národními registry ÚZIS).

Výsledky: Podíl dětí z vícečetných těhotenství po ICSI je proti spontánně počatým vyšší (31 % proti 1,7 %; p < 0,001), stejně jako celkový podíl porodů císařským řezem (31 % versus 17,8 %; p  0,001). V perinatálním období se vyskytl problém u 21,5 % novorozenců (18 z 42 dvojčat, 12 z 93 u 1četných gravidit; p 0,001). Komplikace provázely 50,9 % těhotenství.

Závěr: Při vzájemném srovnání 1– a 2četných těhotenství v populaci a u dětí počatých po ICSI se gestační věk, porodní hmotnost a porodní délka neliší. Komplikace v těhotenství a v perinatálním období jsou však u dětí počatých po ICSI častější.

Podpořeno projektem IGA MZ ČR NR 8118/4 NR.

13. Lykopen v terapii oxidačního stresu u mužské neplodnosti

I. Oborná¹, M. Svobodová¹, H. Fingerová¹, J. Březinová¹, J. Novotný², M. Hajduch³

¹Gynekologicko–porodnická klinika LF UP a FN Olomouc

²Ústav biologie LF UP Olomouc

³Laboratoř experimentální medicíny, Dětská klinika LF UP a FN Olomouc

Úvod: Lykopen je karotenoid, který se svůj antioxidační efekt doporučuje k léčbě prostatických onemocnění. Ve své studii jsme ověřovali působení lykopenu u mužů s vysokou produkcí ROS.

Materiál a metodika: Do studie bylo zařazeno 12 mužů z neplodných párů s negativním urologickým vyšetřením i kultivací ejakulátu a produkcí ROS nad 10 000 RLU/min. Vzorky ejakulátu byly vyšetřeny podle WHO před a po ukončení léčby. Současně byla měřena celková produkce ROS, peroxynitritu a H2O2 v ejakulátu a celková antioxidační kapacita (TAC) v krevním séru. Po léčbě lykopenem (20 mg denně po 3 měsíce) byl plánován cyklus IVF/ET a vyhodnocení jeho úspěšnosti.

Výsledky: Po léčbě lykopenem nebyly zjištěny významné rozdíly v počtu, motilitě a morfologii spermií ani v hladinách TAC v krevním séru. Byl zjištěn pokles průměrné produkce ROS (p = 0,02) a peroxynitritu (p = 0,01), určitý trend k poklesu byl potvrzen u H2O2 (p = 0,07). Pokles podílu leukocytů a spermií na produkci obou radikálů byl obdobný, u leukocytů signifikantní (p = 0,01). U 2 párů došlo ke spontánnímu otěhotnění ještě před zahájením IVF. U zbývajících 10 párů byl IVF cyklus ukončen ET 9krát a 6krát byla potvrzena klinická gravidita.

Závěr: Léčba lykopenem vedla k signifikantnímu poklesu produkce ROS v ejakulátu. I když jde zatím o malou skupinu neplodných párů, počet dosažených těhotenství po IVF/ET a zvláště spontánní koncepce po léčbě lykopenem vedou k přesvědčení, že lykopen významně snižuje úroveň OS v ejakulátu. Lykopen v dávce 20 mg denně je vhodným antioxidantem pro muže z neplodných párů s excesivní produkcí ROS.

Podpořeno grantem IGA 1A8621–5.

14. Stav zárodečného epitelu mužů s azoospermií

M. Sedláčková¹, J. Žáková², E. Lousová², P. Ventruba², M. Huser²

¹Ústav histologie a embryologie LF MU, Brno

²Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno

Úvod: Metody asistované reprodukce dovolují léčit kromě ženské neplodnosti i některé formy neplodnosti mužské, jako je např. astenospermie, oligospermie či dokonce azoospermie. V některých případech azoospermie může být získán malý počet spermií biopticky z nadvarlete nebo varlete a provedeno oplození pomocí intracytoplazmatické injekce spermie do oocytu (ICSI). U testikulárních biopsií se obvykle provádí rutinní histologické vyšetření na úrovni světelné mikroskopie. Podrobnější informace o průběhu spermatogeneze může poskytnout elektronově mikroskopické vyšetření ultrastruktury zárodečného epitelu, na základě kterého je možno usuzovat na pravděpodobnost získání spermií vhodných k ICSI, nebo naopak tuto možnost zcela vyloučit.

Materiál a metodika: Vyšetřili jsme testikulární biopsie 3 pacientů zařazených do programu fertilizace in vitro (IVF), u kterých byla diagnostikována azoospermie. Vzorky byly zpracovány standardně pro elektronovou mikroskopii. Na základě vyšetření ultrastruktury byl hodnocen průběh spermatogeneze v semenotvorných kanálcích i stav Leydigových buněk v intersticiu.

Výsledky: Příčiny azoospermie u vyšetřených mužů byly různé a podle toho se také lišil stav zárodečného epitelu. V semenotvorném epitelu pacienta A (retrográdní ejakulace, práce s ropou) byla nalezena všechna vývojová stadia spermatogeneze s vysokým podílem morfologicky defektních časných i pozdních spermatid. Semenotvorný epitel pacienta B (genetický defekt) byl tvořen téměř výhradně Sertoliho buňkami, pouze výjimečně byly nalezeny spermatogonie, avšak žádná další vývojová stadia. V intersticiu byly zbytky degenerovaných semenotvorných kanálků. Semenotvorný epitel pacienta C (stav po vazektomii) obsahoval sice všechna vývojová stadia včetně téměř zralých spermií, avšak většina z nich vykazovala morfologické anomálie. K nejzávažnějším patřil výskyt 2– i 3jaderných nejen spermatid či spermatocytů, ale i spermatogonií, což je zcela neobvyklé. V okolí semenotvorných kanálků byl pozorován zvýšený výskyt žírných buněk.

Morfologie Leydigových buněk ve všech vzorcích odpovídala obrazu aktivních buněk.

Závěr: Po zhodnocení ultrastruktury zárodečného epitelu v korelaci s anamnestickými údaji a doplňkovým vyšetřením jsme u pacienta A potvrdili možnost získání vhodných spermií pro ICSI, naproti tomu u pacienta B je tato možnost zcela vyloučena. U pacienta C je sice vysoká pravděpodobnost získání spermií, avšak výsledek IVF, případně transferu embryí je velmi pochybný. Klinické výsledky potvrdily naše předpoklady.

15. Trendy kvalitativních ukazatelů ejakulátů mužů v posledních 36 letech

Z. Věžník, D. Švecová, A. Zajícová, M. Kunetková, P. Přinosilová, R. Rybář, J. Rubeš

Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno

V průběhu 36 let (1970–2006) bylo vyšetřeno 5 095 ejakulátů od mužů zařazených do sledování příčin problémové fertilizace párů. Spermatoanalytická vyšetření doložila v průměrech jednotlivých kritérií hodnoty, které – kromě kritéria motility spermií – převážně odpovídaly konvenčním normálům. Při komparaci s normativními ukazateli WHO nedosáhlo potřebného objemu 22,0 % ejakulátů, potřebné koncentrace spermií 21,2 % a motility spermií 46,6 % ejakulátů. Průměrný podíl morfologicky nezměněných spermií byl v posledních 3 letech pouhých 21,4 %. Dříve klasický požadavek 60 % morfologicky intaktních spermií nesplnilo 68,9 % ejakulátů. Požadovaných 25 % normálně utvářených spermií splnilo 86,3 %. Po vyhodnocení testu přežitelnosti ejakulátů odpovídalo pouze 54,9 % požadované funkční rezistenci spermií. Z výsledků je zřejmá kvalitativní degradace ejakulátů mužů, doložená především snižujícím se podílem morfologicky nezměněných spermií a klesající koncentrací spermií. Významný doklad negativních vlivů kouření na funkci germinativního epitelu je snížení koncentrace spermií v ejakulátech kouřících probandů, a to o 53,7 % ve srovnání s nekuřáky.

V časovém období 20032006 byly výsledky sledovaného souboru porovnávány se skupinou 113 brněnských vysokoškoláků. Skupina brněnských vysokoškoláků měla statisticky lepší výsledky než srovnávaná část sledovaného souboru. Tento rozdíl byl zřejmý i z hlediska analýzy integrity chromatinu ve spermiích stanovené metodou SCSA srovnávaných skupin v odpovídajícím časovém úseku.

Průkaz kontaminace ejakulátů chlamydiemi, mykoplazmaty a ureaplazmaty v celkové frekvenci u 49 % případů zdůrazňuje významnost těchto šetření.

16. Využití techniky nukleární konverze v preimplantační genetické diagnostice strukturních abnormalit

P. Baborová^1,2, P. Uher^1,2, M. Chmura³

¹Institut reprodukční medicíny a endokrinologie, Plzeň

²Gynekologicko–porodnická klinika LF UK a FN Plzeň

³Reproductive Genetics Institute, Chicago, Ilinois USA

Úvod: Prezentace chce představit přínos techniky nukleární konverze především pro pacienty, u nichž není PGD (preimplantation genetic diagnosis) pomocí klasické FISH analýzy možná, nebo pro pacienty, jež mají fenotypické a genotypické projevy balancované translokace a chtějí se tak vyhnout narození dítěte s balancovanou translokací.

Materiál a metodika: Preimplantační genetická diagnostika chromozomálních abnormalit se dnes provádí převážně pomocí cytogenetického testování interfázního jádra 1 nebo 2 buněk embrya metodou fluorescenční in–situ hybridizace (FISH). Další metodou je komparativní genomová hybridizace (CGH) nebo použití polymerázové řetězové reakce (PCR), jež využívá polymorfních markerů.

Hlavní limitace PGD diagnostiky translokací pomocí klasické interfázní FISH spočívá v možnosti použít pouze komerčně dostupné DNA sondy na specifický chromozom zahrnutý v translokaci. U jistých druhů translokací proto není PGD pomocí klasické interfázní FISH možná, jelikož neexistuje komerčně vyráběná sonda na translokované chromozomy nebo konkrétně postihující jejich translokované úseky.

FISH ani CGH navíc nedokážou rozlišit mezi embryem nesoucím balancovanou formu translokace a normálním embryem. To vedlo k vyvinutí nové techniky nazývané jaderný transfer nebo také nukleární konverze. Podstatou této techniky je přeměna (transfer) interfázního jádra do jádra metafánzího, a tudíž dosažení vizualizace celých chromozomů. To nám následně umožňuje použít celomalovací chromozomové DNA sondy, jež jsou komerčně vyráběny na každý chromozom, a zároveň dovoluje rozlišit embryo s balancovanou formou translokace od normálního embrya (bez translokace).

Závěr: Prezentace dokazuje, že použití této techniky je v praxi možné a proveditelné.

17. Riziko OHSS a význam znalosti hladin estradiolu v průběhu ovariální stimulace– randomizované srovnání dlouhého protokolu GnRH agonista versus GnRH antagonista

R. Středa, J. Štěpán

Centrum asistované reprodukce SANUS, Pardubice

Úvod: Hladina estradiolu (E2) je vedle počtu foliklů další z dynamických markerů rizika vzniku OHSS (ovariální hyperstimulační syndrom). Cílem práce je zjištění hladin E2 v den 5 a v den aplikace hCG u obou protokolů.

Materiál a metodika: Randomizovaná studie, probíhající od 1. 7. 2006 dosud, schválená etickou komisí. U 100 pacientek byla provedena randomizace generovaná počítačem: dlouhý protokol GnRH agonista v luteinní fázi triptorelin 0,1 mg denně versus fixní protokol GnRH antagonista ganirelix 0,25 mg, oba protokoly s aplikací rFSH folitropin beta. Vstupní kritéria: BMI do 30, FSH i LH do 10 IU/l, věk do 38 let. V každé skupině bylo randomizováno 50 pacientek, průměrný věk 30 let v obou skupinách, charakteristiky skupin bez statisticky významných odlišností. Úvodní dávka 150 až 200 IU FSH byla zvolena podle bazálních hladin FSH, ultrazvukového obrazu ovarií i podle znalosti odpovědi na aplikaci rFSH v programu intrauterinních inseminací. Kromě ultrazvukové kontroly byl 5. den stimulace a v den aplikace hCG sledován E2, LH. Dávka rFSH byla snížena při rychlém vzestupu hladiny E2 v den 5 a na této upravené dávce byla již léčba dokončena.

Výsledky: K datu konference léčbu zahájilo 45 vs. 42 pacientek, aspirace oocytů byla realizována u všech pacientek. Embryotransfer nebyl proveden u skupiny GnRH agonista vs. GnRH antagonista u 1 pacientky (nonfertilizace po IVF) vs. 5 pacientek (3 případy empty follicle syndrom, 2 případy nonfertilizace po IVF). Průměrné hladiny E2 (pg/ml) byly v den 5 361 + 44 vs. 429 + 41 a v den aplikace hCG 1 868 + 161 vs. 1 294 + 110. Byl zaznamenán 1 případ OHSS I. stupně u pacientky léčené protokolem GnRH antagonista. U této pacientky byly hladiny E2 626 pg/ml v den 5 a 2 602 pg/ml v den aplikace hCG. Klinický stav umožňoval embryotransfer, eSET (elective single embryo transfer), proto bylo dosaženo gravidity. Průměrný počet transferovaných embryí 1,85 vs. 1,86. Ve sledovaném souboru bylo dosaženo souhrnného těhotenského indexu (cumulative pregnancy rate) 34 % vs. 39 %. Mimoděložní těhotenství nebylo zaznamenáno. Pacientka s projevy OHSS I. stupně byla sledována ambulantně.

Závěr: Znalost hladiny estradiolu v den 5 a v den aplikace hCG umožňuje u rizikových pacientů pro vznik OHSS racionálně využít metodiku step down protokolu. Ve sledovaném souboru bylo riziko OHSS 2 %. Práce je součástí doktorského studia LFUK v Hradci Králové s názvem Minimalizace rizika OHSS v asistované reprodukci.

18. Monozygotní vícečetná těhotenství v asistované reprodukci

J. Vodička, A. Sobek, A. Sobek jr, B. Hladíková

Fertimed, Olomouc

Populační riziko vzniku monozygotního vícečetného těhotenství představuje 0,4 %. V souvislosti s rozvojem metod a technik asistované reprodukce se výskyt několikanásobně zvyšuje.

Kromě genetických faktorů je popisován vliv mikromanipulačních technik, zvažuje se možná příčinná souvislost kultivačních médií a prodloužené kultivace s vyšším výskytem monozygotních vícečetných těhotenství.

V našem souboru vyhodnocujeme 18 klientek léčených v letech 2000–2007 metodou IVF/ICSI, u kterých jsme zaznamenali vícečetná monozygotní těhotenství.

V našem souboru jsme neprokázali vliv mikromanipulačních metod, nenašli jsme souvislost mezi délkou kultivace, použitým kultivačním médiem a výskytem monozygotní vícečetné gravidity.

19. Naše zkušenosti s preimplantační genetickou diagnostikou

P. Uher¹, P. Baborová¹, H. Višňová¹, P. Lošan², P. Martínek²

¹Institut reprodukční medicíny a endokrinologie, Plzeň

²Genetika Plzeň s.r.o., Plzeň

Úvod: Práce shrnuje výsledky PGD/PGS cyklů pacientů se zvýšeným maternálním věkem, opakovaným selháním IVF, s monogenetickým onemocněním, X–vázanými chorobami a chromozomálními přestavbami od července 2004 do července 2007. V práci je rovněž zmíněn přínos použití rehybridizace na neinformativní výsledky z předchozích kol hybridizace.

Materiál a metodika: Všechna analyzovaná embrya byla získána od pacientů podstupujících IVF léčení v Institutu reprodukční medicíny a endokrinologie Plzeň v období od července 2004 do července 2007 po podepsání informovaného souhlasu; genetická analýza byla provedena ve spolupráci s RGI Chicago, USA a Genetikou Plzeň.

Protokol fixace, zpracování a analýzy pro FISH a pro PCR [1].

Závěr: S celkovou hodnotou pregnancy rate (PR) 33 % na cyklus a 45 % na ET bylo prokázáno, že PGD/PGS je efektivní alternativa prenatální diagnostiky, zejména pro pacienty s opakovaným selháním implantace a s opakovanými aborty v anamnéze a pro pacientky se zvýšeným maternálním věkem. Efektivní je také pro neplodné pacienty nebo pro pacienty nesoucí genetickou vadu či strukturní abnormalitu, kde přínos PGD spočívá ve vyšších hodnotách PR. Vysoké procento cyklů bez transferu je u pacientek nad 40 let věku. S tím souvisí vysoká hodnota patologických embryí, stejně tak jako nízká ovariální odezva na hormonální stimulaci a nízký počet průměrně získaných oocytů, což vede k úvaze, zda je PGS pro tyto pacientky opravdu přínosem a zda by pacientky s výrazně zvýšeným maternálním věkem neměly být vyloučeny z PGS [2].

Výsledky studie významnosti rehybridizace rovněž jasně demonstrují svoji užitečnost. Analýza PGS je díky minimalizaci neinformativních výsledků pro specifický chromozom přesnější a úplnější.

1. Verlinski Y, Kuliev A. Atlas of preimplantation genetic diagnosis. 2. ed. New York: Taylor and Francis 2005.
2. Mastenbroek S et al. In Vitro Fertilization with Preimplantation Genetic Screening. N Engl J Med 2007; 357(1): 9–17.

20. Imunoanalýza biomarkerů oxidačního stresu

H. Fingerová1, J. Novotný2, J. Březinová1, M. Svobodová1, K. Machovská1, J. Vysloužilová1, I. Oborná1

Porodnicko–gynekologická klinika LF UP a FN Olomouc

Ústav biologie LF UP, Olomouc

Úvod: Oxidační stres (OS) nadprodukce volných radikálů, vysoce reaktivních forem kyslíku a dusíku (ROS/RONS), kterou již nedokáže antioxidační systém organizmu kontrolovat, je spojován s celou řadou patologických procesů včetně neplodnosti, zhoubného bujení nebo stárnutí. Buněčné membrány spermií jsou vůči OS velmi citlivé, fyziologické množství volných radikálů je však pro jejich funkci nezbytné.

K nadměrné produkci volných radikálů dochází např. při zánětlivých reakcích, ale i vlivem negativních vnějších faktorů. Objektivní hodnocení OS v ejakulátu by mohlo významně zlepšit diagnostiku a terapii mužského faktoru neplodnosti.

Materiál a metodika: Přímé měření ROS/RONS je vzhledem k jejich krátké životnosti velmi obtížné. Proto jsou hledány biomarkery, které by mohly určit zdroj a rozsah oxidačního poškození, případně monitorovat účinnost následné terapie. Obecně lze jako biomarker OS využít vznik molekul modifikovaných působením volných radikálů nebo změny v hladinách enzymatických a neenzymatických antioxidantů. Sdělení přináší přehled hlavních biomarkerů OS v moči, pro které byly v posledních několika letech popsány a v klinické praxi validovány jednoduché a rychlé ELISA metody.

Výsledky: Žádný ze studovaných biomarkerů však dosud nebyl všeobecně akceptován jako nejvhodnější. Zatím se doporučuje použití panelu markerů, ve kterém by měl být zastoupen alespoň 1 marker peroxidace lipidů (např. akrolein–lyzin, izoprostany), 1 marker oxidace proteinů (např. oxidační metabolity bilirubinu), dále marker poškození DNA (např. 8–OH–2°deoxyguanozin) a tzv. celková antioxidační kapacita.

Závěr: Optimální panel biomarkerů OS vyšetřovaných pomocí komerčních ELISA metod by mohl po prověření v klinické praxi nahradit dosavadní finančně i časově náročné biochemické metody a stát se významným pomocníkem ve výzkumu, diagnostice a léčbě patologických stavů souvisejících s oxidačním stresem.

Podpořeno grantem IGA 1A8621–5.

21. Intaktní kornuální 9týdenní gravidita po IVF–ET u 37leté pacientky po oboustranné salpingektomii pro extrauterinní graviditu – kazuistika

V. Šilhan, J. Štěpán

První privátní chirurgické centrum SANUS, Hradec Králové

Úvod: Výskyt extrauterinní gravidity po IVF–ET je problematika živá a aktuální. V příslušné literatuře se udává její incidence po IVF–ET od 2 do 6 %.

Materiál a metodika: Popisujeme případ intaktní 9týdenní kornuální gravidity po IVF–ET u 37leté pacientky po oboustranné salpingektomii pro extrauterinní graviditu.

Výsledky: Pacientka byla po stanovení diagnózy operována na našem pracovišti. Během výkonu byl snesen roh děložní i s kornuální intaktní graviditou. Kazuistika je dokumentována obrazovým materiálem, ultrazvukovými nálezy před operací a po operaci a obrazovou dokumentací získanou během operačního výkonu.

Závěr: Zatímco výskyt tubární extrauterinní gravidity po IVF–ET je pro gynekologa denní chleba, nález intaktní 9týdenní kornuální gravidity po IVF–ET u pacientky po oboustranné salpingektomii překvapí a stojí za publikování: Pacientka pokračuje v léčbě sterility na našem pracovišti.

22. Význam kombinované hormonální kontracepce ve stimulačním protokolu IVF

M. Huser, I. Crha, J. Žáková, P. Ventruba, R. Hudeček, S. Mitášová

Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno

Úvod: Cílem práce je analýza cyklů in vitro fertilizace (IVF) s přípravou kombinovanou orální kontracepcí (COC) a zhodnocení jejího vlivu na úspěšnost a efektivitu léčby neplodnosti. Jedná se o retrospektivní srovnání IVF cyklů programovaných COC a cyklů bez COC provedených v Centru asistované reprodukce (CAR) Gynekologicko–porodnické kliniky LF MU a FN Brno v letech 20052006.

Materiál a metodika: Z registru asistované reprodukce (AR) byly vybrány všechny IVF cykly provedené v letech 20052006 se stimulací rekombinantními gonadotropiny v kombinaci s agonisty gonadoliberinu v dlouhém protokolu, u nichž nebyl diagnostikován ovariální faktor neplodnosti (bazální FSH 2–8 IU, FSH/LH poměr pod 1,5). Všechny cykly probíhaly za standardizovaných podmínek při prodloužené kultivaci embryí v délce 35 dní a transferu 23 embryí. Cykly byly rozděleny na 2 skupiny: sledovaný soubor cyklů programovaných COC (A, n = 68) a kontrolní soubor bez COC (B, n = 152). V obou skupinách byly porovnány ukazatele úspěšnosti ovariální stimulace, fertilizace a implantace embryí. Ke statistickému zpracování byl použit párový Studentův t–test a srovnávací analýza (ANOVA) s užitím software Statistica.

Výsledky: Obě skupiny byly statistickým srovnáním (ANOVA) shledány jako porovnatelné z hlediska věku (33,1 + 3,4 vs. 32,3 + 3,4), ovariální rezervy (bazální FSH 3,7 + 2,4 vs. 4,4 + 2,5), počtu transferovaných embryí (2,4 + 0,2 vs. 2,6 + 0,2) a délky jejich kultivace (4,1 + 0,9 vs. 4,0 + 0,8). Ovariální stimulace žen s COC byla úspěšnější v počtu získaných oocytů (19,5 + 5,2 vs. 14,1 + 7,0, p < 0,01) při srovnatelné spotřebě FSH (1 860 + 225 vs. 1 930 + 250) a bez zvýšeného rizika vzniku ovariálního hyperstimulačního syndromu (OHS). Nebyl shledán významný rozdíl ve fertilization rate (71,1 % vs. 73,6 %). Ve skupině žen s COC bylo diagnostikováno více biochemických (36,4 vs. 3,8) i klinických těhotenství (30,1 vs. 28,7), rozdíl nebyl statisticky významný.

Závěr: Mechanizmus pozitivního vlivu COC na výsledky ovariální stimulace není zcela objasněn, předpokládá se lepší synchronizace stadia vývoje primordiálních folikulů. Použití COC v ovariální stimulaci v indikovaných případech zvyšuje úspěšnost léčby a umožňuje velmi přesně načasovat začátek ovariální stimulace, čímž se může výrazně zefektivnit provoz pracoviště. Programování cyklu pomocí COC prodlužuje dobu léčby o 34 týdny a mírně zvyšuje náklady na léčbu pro pacienta. Programování ovariální stimulace COC v rámci cyklu IVF zvyšuje průměrný počet získaných oocytů při nezměněné spotřebě gonadotropinů a bez zvýšeného rizika OHS. Průběh fertilizace oocytů nebyl podáváním COC ovlivněn. Ve skupině žen užívajících COC před ovariální stimulací byla pozorována mírně vyšší úspěšnost při dosažení gravidity.

23. The role of natural killer (NK) cells in prognosis of IVF/ET

T. Baczkowski, P. Ciepiela, R. Kurzawa

Department of Reproductive Medicine and Gynecology, Pomeranian Medical University, Szczecin–Police, Poland

Introduction: NK cells are phenotypically CD3–/CD56+/CD16+, CD3–/CD56+/CD16– or CD3–/CD56–/CD16+ large granular cells (LGC). In peripheral blood NK cells make up about 410 %, according to other authors 612 % of the total lymphocyte population. About 90 % of these cells in blood are CD56+/CD16+. The number of NK cells in endometrium varies throughout menstrual cycle and the age of women. Before menarche and by postmenopausal women there are almost no NK cells, while at the time of implantation NK cells make up even 70 % of leucocytes in the uterine mucosa. Furthermore, high expression of CD56 bright antigens is observed in endometrial NK cells while low expression of CD56dim antigens in the blood NK cells. It is postulated that the NK cells play an important role in implantation and control of trophoblast invasion and prevent local infections. The proper balance between NK cells (phenotypically CD56bright to CD56dim) prevent the miscarriages and promote further development of the pregnancy.

Materials and methods: We studied, between November 2006 and May 2007, different subpopulations of blood lymphocytes in 58 women with a good IVF outcome prognosis qualified to ICSI/ET. Patients were divided into following groups: A women that achieved a pregnancy after ICSI/ET (n = 32) and B women that did not achieve pregnancy after ICSI/ET (n = 26). In both groups two high–quality (class A) embryos at the 3rd day of culture were transferred. These embryos were evaluated at the zygote stage according to L. Scott criteria 18h after ICSI as a optimal Z1 or Z2. Different subpopulations of lymphocytes and NK cells were evaluated using three–colour flow cytometry and the results were presented as a percentage and total count. To statistical analysis the U–Mann–Whitney test was used.

Results: We found that the level of NK cells (total CD56+/CD16+, CD56+/CD16– and CD56–/CD16+) did not differ between patients that achieved and did not achieve pregnancy after ICSI/ET. But if we analyze the different phenotypic subpopulations of NK cells we certified that the CD56/CD16+ were significantly higher in pregnant than non–pregnant women (1,86 % vs. 1,08 %, respectively). Total counts of analyzed subpopulations of lymphocytes only in CD56–/CD16+ subpopulation differ significantly between pregnant and non pregnant group (46 cells/ěL vs. 23 cells/ěL, respectively). Other subpopulations did not differ significantly between both studied groups.

Discussion: Some authors consider 12 % as a cut off level for NK cells [1,2]. In current study the level of NK was increased 17,62 % in pregnant and 12,71 % in non pregnant women. It was postulated that increased level of NK cells in the blood is responsible for repeated IVF failure, some cases of idiopathic infertility and recurrent spontaneous miscarriages. The overall outcomes were comparable to the results of the other authors that compared evaluated groups with recurrent spontaneous abortions and repeated IVF failure [2,3]. Recent studies assess the lymphocytes early activation marker. It is reported that elevated proportions of CD56+/CD69+ are connected with infertility and recurrent abortions [4,5]. Other studies suggested significantly lower level of CD56+/69+ in peripheral blood in fertile patients comparing to groups with recurrent spontaneous abortions and with infertility [3,6]. In our study the fraction of CD56+/CD69+ to total CD56+ was high and it was comparable to the level of CD56+/69+ reported for infertile patients and patients with recurrent abortions. Assessment of NK cells in the blood has been disputed recently and according to latest opinions this examination should not be offered to infertile patients [7,8] what corresponds to our results. In current study the level of NK was not statistically significant higher in women that achieved pregnancy comparing to non pregnant women.

Conclusion: Testing of peripheral blood lymphocytes and different types of NK cells has limited significance as a prognostic factor in ICSI/ET.

Literatura

1.Beer AE, Kwak JY, Ruiz JE. Immunophenotypic profiles of peripheral blood lymphocytes in women with recurrent pregnancy losses and in infertile women with multiple failed in vitro fertilization cycles. Am J Reprod Immunol 1996; 35: 376–382.

2.Kwak JYH, Beaman KD, Gilman–Sachs A et al. Up–regulated expression of CD56+, CD56+/CD16+ and CD19+ cells in peripheral blood lymphocytes in pregnant women with recurrent spontaneous abortions. Am J Reprod Immunol 1996; 34: 93–99.

3.Thum MY, Bhasharan S, Abdalla HI et al. An increase in the absolute count of CD56dimCD16+CD69+ NK cells in the peripheral blood is associated with a poorer IVF treatment and pregnancy outcome Hum. Reprod 2004; 19: 2395–2400.

4.Thum MY, Bhasharan S, Bansal AS et al. Simple enumerations of peripheral blood natural killer (CD56+NJ) cells, B cells and T cells have no predictive value in IVF treatment outcome. Hum Reprod 2005; 20: 1272–1276.

5.Ntrivalas EI, Kwak–Kim JY, Gilman–Sachs A et al. Status of peripheral blood natural killer cells in women with recurent spontaneus abortions and infertility of unknown etiology. Hum Reprod 2001; 16: 855–861.

6.Lukassen HG, Joosteen I, van Cranenbrock B et al. Hormonal stimulation for IVF treatment positively affects the CD56bright/CD56dim NK cell ratio of the endometrium during the window of implantation. Mol Hum Reprod 2004; 10: 513–520.

7.Furuya K, Murakami M, Makimura N et al. Immunological and endocrinological studies on lymphocyte subpopulation and medical treatment for infertility in patients with endometriosis. Mol Cell Endocrinol 2003; 202: 195–199.

8.Rai R, Sacks G, Trew G. New debate: natural killer cells and reproductive failure – theory, practice and prejudice. Hum Reprod 2005; 20: 1123–1126.

24. Koncentrace PAPP–A ve folikulární tekutině pacientek s PCO v IVF programu

J. Pavelková¹, J. Moos², V. Filová², M. Moosová¹, D. Koryntová¹, K. Řežábek¹

¹CAR, Gynekologicko–porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha

²Immunotech, a.s, Praha

Úvod: PAPP–A (Pregnancy–Associated Plasma Protein–A), IGFBP4 (Insulin–like Growth Factor Binding Protein–4) a IGF představují důležité signalizační molekuly, které se podílejí na regulaci růstu a dozrávání folikulů v ovariu po stimulaci gonadotropiny. PAPP–A je extracelulární metaloproteáza a jediná známá proteáza IGFBP4. Je produkována granulózními buňkami po ovariální stimulaci FSH. Cílem práce je zjistit koncentraci PAPP–A ve folikulární tekutině u žen v závislosti na diagnóze neplodnosti, především porovnat ženy zcela zdravé (andrologický faktor sterility) a ženy s anovulací spojenou se syndromem polycystických ovarií (PCO).

Materiál a metodika: V období od 24. 1. 2006 do 2. 2. 2007 jsme shromáždili vzorky folikulární tekutiny od 101 pacientek. Stanovovali jsme koncentraci PAPP–A ve folikulární tekutině u 101 pacientek, které podstoupily léčbu neplodnosti v rámci programu IVF. Nebyla použita výběrová kritéria, šlo o 101 po sobě jdoucích pacientek, které se zařazením do studie souhlasily. Po předchozí kontrolované ovariální hyperstimulaci a odběru folikulární tekutiny s oocyty byla, po vyhledání a vyjmutí oocytů, provedena centrifugace folikulární tekutiny a supernatant byl ve sterilních zkumavkách uchováván při teplotě 70 ÇC. Koncentrace PAPP–A ve folikulární tekutině byla stanovena pomocí soupravy PAPP–A IRMA (Immunotech, Praha).

Výsledky: Koncentrace PAPP–A ve folikulární tekutině celého souboru 101 pacientek byla 0,81+/– 0,32 IU/ml, v rozmezí 0,101,76 IU/ml. Dále byly analyzovány 2 skupiny pacientek, a to skupina 15 žen s polycystickými ovarii (PCO) a kontrolní skupina 33 žen, u kterých byla diagnostikována andrologická příčina sterility. Koncentrace PAPP–A ve skupině 15 pacientek s PCO byla 0,74+/–0,22 IU/ml. V kontrolní skupině zdravých žen byla koncentrace PAPP–A 0,83+/–0,33 IU/ml. Rozdíl nebyl statisticky významný (T–test: P > 0,1).

Závěr: Mezi koncentracemi PAPP–A ve folikulární tekutině pacientek s PCO a kontrolní skupinou zdravých žen nebyl nalezen signifikantní rozdíl.

Podpořeno grantem IGA MZd CZ NR 8932–3.

25. Koncentrace interleukinů v krvi a ve folikulární tekutině u žen zařazených do programu asistované reprodukce

J. Řezáčová¹, J. Madar¹, L. Cuchalová², A. Fišerová²

¹ÚPMD, Praha

²MBÚ, Praha

Úvod: Užitím technik asistované reprodukce (AR) se dosahuje těhotenství při embryotransferu (ET) přibližně ve 40 %. Za nejčastější příčinu neúspěchu je považována porucha implantace embrya. Nezastupitelnou roli v průběhu implantace hraje mateřská imunita. V této studii jsme ověřovali, zda koncentrace interleukinu (IL) 6, 10, 12 a tumor–nekrotizujícího faktoru alfa (TNFá) v mateřské krvi a folikulární tekutině ovlivňuje úspěšnost ET.

Materiál a metodika: Do souboru bylo zařazeno 38 žen léčených metodami AR. Všem ženám byla navozena kontrolovaná ovariální hyperstimulace (COH) užitím standardních stimulačních protokolů s rFSH a agonisty či antagonisty GnRH. Vzorky krve a folikulární tekutina se odebíraly zároveň při aspiraci folikulů. Koncentrace IL 6, 10, 12 a TNFá byla měřena diagnostickou soupravou Imunotech. Výsledky byly statisticky hodnoceny pomocí t–testu.

Výsledky: Pacientky byly rozděleny do 2 podskupin podle výsledku ET. U 9 pacientek s úspěšným embryotransferem byla koncentrace IL 6 a 10 v krvi statisticky významně vyšší než u 29 pacientek, které neotěhotněly. TNFá byl rovněž vyšší, ale ne signifikantně. Výsledky vyšetření folikulární tekutiny v obou podskupinách nebyly statisticky významné, ale IL 12 a TNFá byly vyšší ve skupině s úspěšným ET.

Závěr: Naše výsledky prokazují, že koncentrace interleukinů hraje významnou roli v úspěšnosti embryotransferu a že vyšetřování cytokinů může přinést důležité informace ve výzkumu imunitních mechanizmů.

26. Souvisí koncentrace sérových proteinů s rizikem rozvoje OHSS u pacientek v IVF programu?

M. Moosová¹, J. Moos², V. Filová², J. Pavelková¹, D. Koryntová¹, K. Řežábek¹

¹CAR, Gynekologicko–porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha

²Immunotech a.s., Praha

Úvod:Pacientky IVF programu, u kterých po stimulaci roste 15 a více folikulů, považujeme na základě svých zkušeností za skupinu se zvýšeným rizikem rozvoje OHSS (Ovarian Hyperstimulation Syndrome). U většiny těchto pacientek k rozvoji závažného OHSS nicméně nedojde. Ve snaze nalézt další ukazatele rozvoje OHSS jsme u IVF pacientek měřili koncentrace následujících sérových markerů: AAG, AAT, ALB, AMG, APA, IGA, IGG, IGM, HPT, TRF. Měření byla prováděna ve folikulární tekutině (FF) a v séru. Srovnali jsme výsledky mezi skupinou pacientek, u kterých k rozvoji OHSS došlo, a skupinou pacientek, u kterých k rozvoji OHSS nedošlo, ačkoliv obě skupiny měly stejné riziko vyjádřené počtem ovariálních folikulů po hyperstimulaci.

Materiál a metodika: Soubor tvořilo 34 pacientek do 35 let věku, u kterých bylo odebráno více než 15 oocytů. Folikulární tekutina a vzorky séra, obojí získané v den odběru oocytů, byly po centrifugaci zamraženy. Koncentrace proteinů byla analyzována na systému Immage (Beckman Coulter Inc).

Výsledky: Koncentrace proteinů v séru odpovídaly referenčním rozmezím udávaným v literatuře a nevykazovaly významné rozdíly mezi oběma skupinami. Koncentrace proteinů ve FF byly u jednotlivých pacientek většinou nižší než sérové. Anomálně se u některých pacientek jevily koncentrace AAT (Alfa–1 Antitrypsin). Ve skupině bez rozvoje OHSS (31 pacientek) byl průměrný poměr koncentrací folikulárního ku sérovému AAT 0,97. U 4 pacientek bez rozvoje OHSS byl poměr folikulárního ku sérovému AAT vyšší než 1,3 a pacientka s vysokým rizikem OHSS ve 2 po sobě jdoucích cyklech (ale bez rozvoje OHSS) měla dokonce poměr folikulárního ku sérovému AAT 4,47. Ve skupině s rozvojem OHSS (3 pacientky) dosahoval hodnoty pouze 0,89.

Závěr: U pacientek IVF programu se zvýšeným rizikem OHSS může vyšší poměr koncentrace AAT ve folikulární tekutině ku koncentraci AAT v séru indikovat nižší riziko vzniku OHSS. K potvrzení této hypotézy je třeba analyzovat více vzorků.

Podpořeno grantem IGA MZd CZ NR 8932–3.

27. Výchozí kvalita spermií jako indikátor úspěšnosti intrauterinní inseminace při léčbě neplodnosti

R. Hampl, R. Středa, C. Provazník, J. Štěpán

Centrum asistované reprodukce SANUS, Hradec Králové

Úvod: Podnětem k výzkumu je absence jasných parametrů spermiogramu v odborné literatuře, které by indikovaly hranici kvality spermií vhodnou k léčbě neplodnosti za pomocí IUI při zachování určité hladiny úspěšnosti. Cílem studie je porovnat výchozí kvalitu spermií použitých k IUI s výslednou pregnancy rate u 74 stimulovaných cyklů a definovat základní hodnoty spermiogramu, které hrají určující roli při tomto druhu léčby.

Materiál a metodika: Data pocházejí od 74 stimulovaných cyklů (denní dávka 50, 75 popř. 100 IU rFSH od 3. dne menstruačního cyklu dle očekávané ovariální odpovědi) z období let 20052006. Indikace pro léčbu byla anovulace, mírný andrologický faktor nebo idiopatická neplodnost. Na základě hodnot spermiogramu byly pro analýzu dat vytvořeny podskupiny pacientů podle jeho základních charakteristik morfologie, pohyblivosti a koncentrace. Rovněž byly srovnány skupiny pacientů rozdělené podle celkového zhodnocení spermiogramu odpovídajícímu hodnotám WHO. Rozdíly mezi jednotlivými podskupinami byly analyzovány kontingenční tabulkou za pomocí 2 testu.

Výsledky: Průměrný věk pacientek byl 29,8 let. Těhotenský index byl 15 %. Při porovnání podskupin pacientů s různými hodnotami spermiogramu byla nalezena signifikantní závislost mezi počtem progresivně pohyblivých spermií ve výchozím ejakulátu a výslednou pregnancy rate (2 = 12,0, df = 5, p = 0,03). U ostatních sledovaných hodnot ani u skupin rozdělených podle celkového zhodnocení spermiogramů závislost prokázána nebyla.

Závěr: Bylo prokázáno, že celkový počet progresivně pohyblivých spermií ve výchozím ejakulátu má vypovídací hodnotu, pokud se jedná o možnou úspěšnost léčby. Pokud celkový počet progresivně pohyblivých spermií ve výchozím ejakulátu klesne pod 40 % z celkového počtu spermií, IUI se stává málo efektivní metodou při léčbě neplodnosti a lze přímo doporučit některou z metod IVF. Nebylo prokázáno, že by hodnoty koncentrace spermií, jejich morfologie a celkové zhodnocení spermiogramu měly vypovídací hodnotu jako indikátor úspěšnosti léčby metodou IUI.

28. Produkce reaktivních kyslíkových molekul v ejakulátu mužů z neplodných párů s normospermií dle WHO

M. Svobodová¹, I. Oborná¹, J. Novotný², J. Březinová¹, H. Fingerová¹, K. Lapínová¹, J. Vysloužilová¹

¹Gynekologicko–porodnická klinika LF UP a FN Olomouc

²Ústav biologie LF UP, Olomouc

Úvod: Pro správnou funkci spermií v procesu oplodnění jsou reaktivní kyslíkové molekuly (ROS) ve fyziologickém množství nezbytné. Nadměrná produkce ROS spermiemi nebo aktivovanými leukocyty, kterou již nestačí kompenzovat antioxidační obranný systém, však vyvolá oxidační stres (OS). Ten je dnes pokládán za významnou příčinu mužské neplodnosti. Proto jsme na našem pracovišti začali vyšetřovat produkci ROS v ejakulátu.

Materiál a metodika: Do studie bylo zařazeno 60 mužů z neplodných párů, kteří splňovali definici normospermie podle WHO. Pro porovnání byly použity výsledky měření ROS u 14 mužů s prověřenou fertilitou. Ejakuláty byly po zkapalnění centrifugovány a resuspendovány ve fosfátovém pufru. Hladiny ROS byly stanoveny chemiluminiscenční metodou s použitím luminolu v DMSO. Produkce ROS v suspenzi spermií o hustotě 20 mil/ml byla měřena integrálně 15 min a vyjádřena v RLU (Relative Light Unit)/min. Rozdíl v produkci ROS byl hodnocen neparametrickými metodami.

Výsledky: Hladiny ROS u mužů z neplodných párů se pohybovaly od 0 do 150 000 RLU/min, u mužů s prověřenou plodností od 0 do 17 000 RLU/min (medián 800 vs. 1 000 RLU/min). Jako hranici zvýšené produkce ROS jsme zvolili hodnotu 90% percentilu u 14 plodných mužů tj. 7 000 RLU/min. U zkoumané skupiny 60 mužů tato hladina koresponduje právě se 75% percentilem. 3 z 5 normospermiků s nejvyšší produkcí ROS měli v ejakulátu 0,8 x 106 leukocytů, což je sice fyziologická hodnota v Endtzově testu, ale může již pravděpodobně být zdrojem ROS.

Závěr: Dosud jsme jako nadměrnou produkci ROS měřenou v ejakulátu chemiluminiscenční metodou brali 10 000 RLU/min. Naše studie naznačuje, že by se tato hranice mohla pohybovat mezi 7 až 10 000 RLU/min. Detekce nadměrné produkce ROS může být vhodným nezávislým markerem v diagnostice mužského faktoru neplodnosti, především v případech idiopatické infertility.

Podpořeno grantem IGA 1A8621–5.

29. Význam imunologického faktoru v léčbě neplodnosti

J. Březinová¹, M. Svobodová¹, K. Machovská¹, H. Fingerová¹, I. Oborná¹, K. Adamová², Z. Ulčová–Gallová³

¹Gynekologicko–porodnická klinika LF UP a FN Olomouc

² Ústav lékařské genetiky a fetální medicíny LF UP a FN Olomouc

³Gynekologicko–porodnická klinika LF UK a FN Plzeň

Úvod: Opakované selhání léčby metodou mimotělního oplození může být způsobeno i imunologickým faktorem. K odbornému imunologickému vyšetření by měly být páry odesílány poté, co selhalo oplození, po zastavení vývoje získaných embryí nebo po neúspěšné implantaci kvalitních embryí.

Materiál a metodika: Do hodnoceného souboru bylo zařazeno 22 párů s opakovaně neúspěšnou léčbou IVF a ET (až 8 neúspěšných přenosů). U partnerů zařazených do grantové studie jsme mimo jiné vyšetřili i produkci ROS v ejakulátu a vyloučili negativní vliv oxidačního stresu. Všechny páry byly vyšetřeny v Poradně pro imunologii reprodukce v Plzni. U žen byly vyšetřovány protilátky proti spermiím, zona pellucida (ZP) a 8 fosfolipidům v séru a byl proveden Kremerův a i–MAR test v ovulačním nebo anovulačním hlenu. U mužů byly vyšetřeny v séru protilátky proti spermiím a v ejakulátu byly hodnoceny MAR test a intraakrozomální proteiny (Hs8, Hs14, Hs36). Podle nálezů byla zajištěna léčba doporučená imunologem, a to před následujícím cyklem IVF/ET resp. KET nebo v jeho průběhu. Úspěšnost těchto 22 léčených cyklů byla vyhodnocena.

Výsledky: Nejčastěji byly u žen zjištěny protilátky proti ZP (73 %), u mužů pak patologické nálezy intraakrozomálních proteinů (50 %). Doporučená léčba spočívala v individuálním podávání kortikoidů, Zn, Se, vitamínu E a vazodilatancia. Již v období přípravy na IVF po proběhlé cílené a krátkodobé imunoterapii spontánně otěhotněly 2 pacientky. Zbývající páry podstoupily 19 cyklů IVF a 3 přenosy rozmražených embryí. Bylo dosaženo 15 klinických těhotenství, tj. PR/cyklus 68 % resp. PR/ET 79 %. Z těchto těhotenství bylo již 6 ukončeno porodem zdravých dětí, jedno spontánním potratem v 7. týdnu a jedno heterotopickým těhotenstvím. Zbývajících 7 těhotenství zatím probíhá fyziologicky.

Závěr: Naše dosavadní povzbudivé výsledky upozorňují na význam a přínos imunologického vyšetření u opakovaně neúspěšné léčby metodami asistované reprodukce.

Podpořeno grantem IGA 1A8621–5 a NR–8917–3.

30. Pseudomyxoma peritonei v souvislosti s primární sterilitou

J. Hulvert¹, V. Hejda², L. Vykysalá¹

¹Gennet, Praha

²ÚPMD, Praha

Úvod: Pseudomyxoma peritonei je vzácné onemocnění, které je obvykle spojeno s rupturou mucinózního cystadenomu či cystadenokarcinomu apendixu nebo ovaria. Nádorové buňky jsou poté diseminovány po břišní dutině, implantují na jejích orgánech a hojně produkují vazký hlen tvořící tzv. mucinozní ascites. Klinicky se onemocnění projevuje širokým spektrem gastrointestinálních obtíží a sterilitou. Příčinou sterility jsou zřejmě diseminovaná ložiska gelatinózních hmot v malé pánvi působící lokální zánět a mechanický blok spontánní fertilizace.

Kazuistika: 38letá pacientka s 16 let trvající primární idiopatickou sterilitou po 3 neúspěšných IVF cyklech, s ultrazvukovou diagnostikou většího množství volné tekutiny s hypoechogenními ložisky v Douglasově prostoru. Při indikované laparoskopii byla zjištěna pseudomyxoma peritonei a mukokéla apendixu. Byla provedena apendektomie, levostranná salpingektomie a z břišní dutiny byla odstraněna četná mucinozní ložiska. Histologicky byl potvrzen mucinozní cystadenom apendixu a jeho perforace. Po 4 měsících byla provedena second look laparoskopie, nalezeno pouze jediné ložisko v oblasti pravých adnex, které bylo exstirpováno, pravá tuba ponechána. Pacientka v následujícím menstruačním cyklu spontánně otěhotněla. Gravidita proběhla fyziologicky, porodila zdravý plod v termínu per sectionem caesaream (SC) z indikace cervikokorporální dystokie. Při S.C. v břišní dutině fyziologický nález.

Závěr: Pseudomyxoma peritonei ve fertilním věku bývá obvykle příčinou sterility.

Po odstranění primárního nádoru, v našem případě mucinózního cystadenomu apendixu a mucinózních ložisek v břišní dutině, dochází ke spontánní koncepci.

Naše zkušenost je v souladu s obdobnými případy uváděnými v odborné literatuře.

31. Luteální podpora v programu IVF–ET

L. Michnová, J. Dostál, M. Svobodová, J. Březinová, J. Grohmanová, M. Lošáková

Porodnicko–gynekologická klinika LF UP a FN Olomouc

Úvod: Normální luteální funkce je předpokladem implantace embrya a udržení těhotenství. Ve stimulovaných cyklech typických pro ART je luteální fáze odlišná od luteální fáze v přirozeném cyklu. Na základě dosavadních zkušeností je podpora luteální funkce nezbytná v období mezi poklesem účinku exogenně podaného hCG k indukci dozrání oocytů a v období od poklesu hladin progesteronu produkovaného mnohočetnými corpora lutea do vzestupu endogenního hCG produkovaného trofoblastem po implantaci.

Materiál a metodika: Ve své práci jsme se na základě studia odborné literatury rozhodli podat přehled možných způsobů provedení luteální podpory v programu IVF–ET, diskutovat jejich výhody a nevýhody, stanovit nejčastěji užívaný typ luteální podpory a navrhnout na současné úrovni poznání její optimální způsob.

Výsledky: Luteální podporu lze provádět aplikací: 1. hCG, 2. progesteronu a 3. kombinací estrogenů a progesteronu. Nejčastěji užívaným typem je v současné době podávání progesteronu. Z pohledu medicíny založené na důkazech se v současné době shromažïují data, která by mohla svědčit pro optimální způsob luteální podpory prováděné kombinací estrogenů a progesteronu.

Závěr: Luteální podpora zůstává nedílnou součástí IVF–ET. V současné době je nejčastěji užívaným způsobem jejího provedení aplikace mikronizovaného progesteronu. Nelze vyloučit, že po získání dostatečného množství důkazů se stane nejvhodnější formou luteální podpory aplikace progesteronu se suplementací estrogenů.

32. Pacientské organizace v reprodukční medicíně v českém, slovenském, evropském i světovém kontextu, jejich status a úloha

H. Konečná

ZSF JU, České Budějovice

Nadace Mateřská naděje, Praha

Medicína přelomu 20. a 21. století je charakterizována zájmem o poznatky humanitních věd. Přístup k pacientovi se změnil z čistě biomedicínského na biopsychosociální, vztah lékaře a pacienta z paternalistického na partnerský. V centru zájmu je jednotlivec (tzv. patient–centered healthcare). Vznikají pacientské organizace, jejichž cílem je budovat zmíněnou patient–centered healthcare, posílit vliv pacientů při vytváření zdravotní politiky, usnadnit jim přístup k potřebné léčbě a informacím a v neposlední řadě bránit jejich práva. Tyto organizace vznikají jak na národních, tak na regionálních a světových úrovních a jsou zaměřeny jak na konkrétní skupinu nemocných (např. podle diagnózy), tak na pacienty jako takové.

Příspěvek bude informovat o českých a slovenských pacientských organizacích (Nadace Mateřská naděje, Kocian, Koalice pro zdraví), o světové organizaci International Consumer Support for Infertility (iCSi) a její evropské sekci European Infertility Alliance, o připravované chartě práv infertilních pacientů Global principles for assisted conception and infertility: A patinets°rights charter, o světové konferenci iCSi v Lyonu 2007, připravované konferenci iCSi 2008 i o IAPO Global Patients Congress připravovaném na únor 2008 (IAPO – International Aliance of Patients' Organizations).

33. Úspěšnost otěhotnění při opakovaných cyklech asistované reprodukce

K. Čadová, P. Ventruba, J. Lokajová, I. Prokopová (Brno)

Úvod: Nejednotné názory a výsledky studií hodnotící pravděpodobnost úspěšnosti asistované reprodukce v prvním a opakovaných IVF cyklech nás vedly k rozboru našeho materiálu.

Cíl: Porovnání úspěšnosti asistované reprodukce z pohledu dosaženého těhotenství v závislosti na pořadí léčebného cyklu. Retrospektivní studie zahrnuje pacientky, které v období 1/2005–9/2007 podstoupily léčbu v Centru asistované reprodukce GPK MU Brno.

Materiál a metodika: Do souboru bylo zařazeno 1 028 cyklů s embryotransferem (ET) po IVF nebo ICSI u žen ve věku 21–48 let (průměr 31,9 roků). Ve studii nebyly hodnoceny kryoembryotransfery a cykly s dárcovskými oocyty a embryi. Při stimulaci byly použity rFSH i uFSH v krátkých i dlouhých protokolech s agonisty i antagonisty GnRH. Stimulace byla řízena individuálně, folikulární zrání bylo indukováno aplikací 5–10 000 IU hCG. Za 36 hod. byl proveden odběr oocytů a jejich oplození (IVF, ICSI). Následovala prodloužená kultivace embryí, popř. asistovaný hatching před embryotransferem (ET) 1 až 3 embryí. Ve všech cyklech byla prováděna luteální suplementace progesteronem. HCG v séru pacientek bylo vyšetřováno 12. den po ET, klinicky probíhající gravidita byla ověřena ultrazvukem.

Souhrnná tabulka porovnává úspěšnost IVF a ICSI v závislosti na pořadí léčebného cyklu. Nejvyšší šance na otěhotnění je v 1. léčebném cyklu (Pregnancy Rate – PR 31,3 %), kdy je nejnižší průměrný věk žen a nejnižší průměrný počet transferovaných embryí. Významným a známým negativním faktorem je narůstající věk ženy. Do 35 let věku ženy lze předpokládat vyrovnanou úspěšnost (PR 32,1, resp. 32,7 %), která po 36. roce výrazně klesá (PR 25, 0 v 1. cyklu, resp. 19,4 % ve 2. cyklu). Byl potvrzen známý fakt, že narůstající počet léčebných cyklů souvisí s vzestupem průměrného věku klientek.

Proti literárním údajům byl v našem souboru významně nižší BMI (22,0 proti 26,1, resp. 25,8). Průměrný počet získaných a oplozených ovocytů, stejně jako transferovaných embryí se v závislosti na počtu cyklů AR nelišil.

Závěr: Úspěšnost asistované reprodukce s narůstajícím počtem prováděných léčebných cyklů klesá. Pokles pravděpodobnosti otěhotnění po IVF a ICSI je výraznější v prvních 4 cyklech. Nebyl zaznamenán významný rozdíl v BMI, počtu získaných a oplozených oocytů.

Výsledky

34. Výsledky intrauterinní inseminace při léčbě poruch plodnosti

S. Mitášová, E. Lousová, I. Crha, J. Žáková, I. Prokopová

Gynekologicko–porodnická klinika, MU a FN Brno

Úvod: Nitroděložní inseminace patří k historicky nejstarším technikám asistované reprodukce. K přednostem patří jednoduchost a malá invazivita postupu, nižší náklady, bývá přijatelná i pro dvojice, které odmítají výkony in vitro fertilizace. Cílem studie je analýza výsledků homologní (AIH) a heterologní intrauterinní inseminace (IUI – AID) při léčbě poruch plodnosti na našem pracovišti.

Materiál a metody: Do studie byly zahrnuty homologní a heterologní inseminace provedené v Centru asistované reprodukce Gynekologicko–porodnické kliniky LF MU a FN Brno v období leden 2002 až prosinec 2006. Pro ovariální stimulaci byl použit klomifen citrát (CC) nebo přípravky folikulostimulačního hormonu (FSH). Protokoly stimulace a monitorování odpovídaly standardům pracoviště. Preparace spermatu byla provedena metodou swim–up. Data hodnocena základní popisnou statistikou, vztahy mezi parametry spermiogramu a diagnózou testovány Kruskal–Wallis ANOVA, pro srovnání mezi skupinami pacientů pak proveden Mannův–Whitneyův test.

Výsledky: V souboru 894 párů bylo provedeno 2 217 IUI a dosaženo 349 těhotenství (15,7 %). Stimulace gonadotropiny (urinární nebo rekombinantní FSH) byla použita v 931 cyklech a bylo dosaženo 196 těhotenství (21 % na cyklus). Klomifen citrát byl použit v 830 cyklech, dosaženo bylo 123 těhotenství (14,8 % na cyklus). V nestimulovaných cyklech bylo provedeno celkem 457 IUI a bylo dosaženo 32 těhotenství (7 %). Při homologní inseminaci provedeno 1 775 IUI u 719 párů bylo dosaženo 260 těhotenství (36% párů). Heterologních inseminací (AID) bylo provedeno celkem 397 u 160 manželských párů, bylo dosaženo 76 těhotenství (42 % dvojic). Při hodnotách spermiogramu 5–10 mil/ml, pohyb nad 30 %, po zpracování byla úspěšnost nejvyšší (15 %).

Závěr: Homologní i heterologní intrauterinní inseminace stále zůstává v indikovaných případech racionální metodou léčby neplodnosti.

Klíčová slova: nitroděložní inseminace, neplodnost, heterologní inseminace

Podpořeno Grantem IGA FN Brno 10/05

35. HCG protokol pro stimulaci OHSS rizikových pacientek

P. Otevřel, Z. Malý

Klinika pro léčbu neplodnosti Unica, Brno

Úvod: Využití LH aktivity hCG ke stimulaci růstu foliklů v pozdní folikulární fázi se ukázala jako vhodná varianta léčby u pacientek s vysokou reaktivitou ovarií. Optimistické výsledky z 1. roku sledování nás přiměly k pokračování. Cílem bylo zhodnotit, zda modifikace protokolu zabrání při stimulaci dalšímu zvyšování počtu foliklů, zda ovlivní výskyt OHSS a pregnancy rate.

Materiál a metodika: V období leden 2006 až září 2007 bylo z 1 157 cyklů v průběhu stimulace selektováno 72 pacientek s nálezem 25 a více foliklů. U nich následovala hCG modifikace protokolu. Jako kontrolní jsme použili soubor 92 pacientek z let 2004–2005 s nálezem stejného počtu foliklů, stimulované však tehdy pouze standardním protokolem. Ke statistickému zhodnocení byl použit Studentův T test pro hetero– a homoskedastické rozložení.

Výsledky: Rozdíl ve výskytu OHSS II. a III. stupně nebyl statisticky významný. Při hCG protokolu nedošlo v průběhu stimulace k dalšímu zvyšování počtu foliklů. Počet klinických těhotenství byl ve srovnávaných skupinách statisticky významně vyšší u pacientek stimulovaných podle modifikovaného hCG protokolu.

Závěr: Vzhledem k počtu těhotenství a spotřebě FSH se hCG protokol stává zajímavou alternativou léčby sterility.

36. CAG repeats lenghth in androgen receptor in Czech fertile males and females

P. Norambuena¹, J. Gromoll², M. Müllerová¹, Š. Štambergová¹, Š. Vilímová¹, M. Macek Sr.¹

¹Institute of Biology and Medical Genetics, 2nd School of Medicine, Charles University and University Hospital Motol, Prague, Czech Republic

²Institute of Reproductive Medicine, University of Muenster, Muenster, Germany

Testosterone action is mediated by the Androgen Receptor (AR). AR gene has been mapped to Xq11–12 chromosome and contains 8 exons which encodes a protein of 110–114kDa approximately. Exon 1 has 2 polymorphic repeats, CAG and GGN, which encodes a polyglutamine and polyglycine tract in the N–terminal transactivation domain, respectively. The length of CAG repeats has been correlated inversely with the transactivation function of AR in vitro. The aim of this report is to ascertain CAG repeats length in Czech control male and female population, in order to evaluate exactly disorders associated to the decrease or increase of CAG repeats and to cover not only the problems of abnormal sex differentiation, but also severe disorders of CNS and disposition to hormone dependent tumors in males and females. CAG repeats length was determinated by fragment analysis in ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). The median CAG repeats in 118 control fertile males and 57 fertile females is 22 CAG repeats in the range of 1433 and 1531 repeats respectively. A normal gaussian distribution was found. These results correspond to so far published European studies where the median length of CAG repeats is 22.

Supported by VZ FNM 000064230.