AFM (Atomic Force Microscopy) zobrazení spermií poškozených oxidačním stresem

Determination of oxidative stress-related surface damage to human sperm by atomic force microscopy.

Aim of the study:
Oxidative stress is considered to be one of the important etiological factors of male fertility disorders. Excessive production of oxygen radicals results in damage to the sperm cell membrane and its DNA. The aim of the study was to apply atomic force microscopy (AFM) to depict surface damage to sperm exposed to experimental oxidative stress.

Material and methods:
Fresh samples of semen from sperm donors were obtained and processed. The AFM system Ntegra Vita (NT-MDT, Moscow, Russia) was used to characterize spermatozoa morphology within a nanometer scale. Surface topography and spatial distribution of electrical potential gradient on the sample surface were measured and recorded simultaneously, providing more complex understanding of the surface morphology. After the initial scanning and imaging of the normal spermatozoa, the slides were exposed to hydrogen peroxide solution (50 mmol/l) for 10 minutes, properly rinsed with distilled water, air dried and re-scanned. The defects were detected and recorded.

Results:
The obtained images clearly show both normal sperm head and defects of the surface of spermatozoa exposed to hydrogen peroxide. It was possible to even clearly distinguish the ultrastructure of the top of the flagella and the acrosome surface. Moreover, elements of internal structure can be observed whenever plasmatic membrane is missing. The best images of both normal and damaged spermatozoa were selected for presentation.

Conclusion:
Collected AFM images clearly highlighted many details of normal spermatozoa and spermatozoa damaged by hydrogen peroxide. This technique could represent an important tool when researching oxidative stress and explaining its effect on male infertility.

Key words:
spermatozoon – oxidative stress – AFM – infertility

Autori: I. Crha ; J. Přibyl; P. Skládal; J. Žáková; P. Ventruba; E. Lousová; M. Pohanka
Pôsobisko autorov: Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno ¹; Národní centrum pro výzkum biomolekul, Přírodovědecká fakulta MU Brno ²
Vyšlo v časopise: Prakt Gyn 2010; 14(3): 120-122
Kategória: Původní práce

Súhrn

Cíl práce:
Oxidační stres je jedním z významných faktorů poškozujících spermie. Nadměrná produkce kyslíkových radikálů vede k poškození buněčné membrány a DNA. Cílem studie bylo využití AFM (Atomic Force Microscopy, mikroskopie atomárních sil) pro zobrazení povrchového poškození spermií vystavených experimentálnímu oxidačnímu stresu.

Materiál a metodika:
Byly získány a standardně zpracovány vzorky spermatu dárců. Pro vyšetření byl použit AFM systém Ntegra Vita (NT-MDT, Moskva, Rusko) s rozlišením v nanometrech. Po zobrazení spermií byly spermie exponovány v roztoku peroxidu vodíku (50 mmol/l) po 30 minut, po tuto dobu byly kontinuálně zobrazovány a ukládány scany zaznamenávající průběh děje v reálném čase. Následně byly vyhodnoceny a zaznamenány defekty povrchu.

Výsledky:
Po optimalizaci experimentálních podmínek byly zobrazeny morfologicky normální spermie a nalezeny defekty vyvolané peroxidem vodíku. Byla patrná ultrastruktura povrchu hlavičky v oblasti akrozomu.

Závěr:
Defekty spermie vyvolané experimentálním oxidačním stresem byly detailně zobrazeny. Studie potvrdila schopnost AFM techniky zobrazit morfologii spermií až s nanometrickým rozlišením. Tato metoda může být důležitým nástrojem pro výzkum oxidačního stresu a poznání jeho vlivu na snížení plodnosti. Příprava vzorku a nastavení přístroje vyžaduje optimalizaci několika parametrů.

Klíčová slova:
spermie – oxidační stres – AFM – neplodnost

Úvod

Oxidační stres je považován za významný faktor poškození zárodečných buněk. Nadměrná produkce kyslíkových radikálů vede k poškození povrchových membrán buněk a defektům DNA. Standardní vyšetření morfologie barveného nátěru spermií optickým mikroskopem s imerzí má své fyzikální limity a nepřináší dostatečně přesné informace (WHO manuál). Nové možnosti přináší metoda AFM (Atomic Force Microscopy). Princip metody je zcela odlišný od klasických mikroskopických metod včetně elektronové mikroskopie, umožňuje především detailní pohled na povrch buňky. Bývá nazýván „oko nanotechnologií“. Mikroskop atomárních sil AFM je velmi citlivé zobrazovací zařízení pracující typicky s rozlišením pod 1 nm. Principem zobrazování je kontakt velmi ostrého hrotu s povrchem vzorku, na němž je vhodně zachycen vizualizovaný objekt. Nad tímto povrchem je hrot posouván, jeho výchylka je přenášena laserovým paprskem na segmentovanou fotodiodu a pomocí počítače převáděna do podoby trojrozměrného obrazu. K hlavním výhodám patří vysoké rozlišení v nanometrech, minimální požadavky na druh a přípravu vzorku, zobrazení vzorku a jeho mechanických vlastností, možnost měření za atmosferického tlaku, teploty, případně v libovolné kapalině. Cílem studie bylo využití AFM pro zobrazení povrchového poškození spermií vystavených experimentálnímu oxidačnímu stresu.

Materiál a metody

Byly použity vzorky spermatu dárců s normospermií vyšetřovaných v andro-logické laboratoři Centra asistované reprodukce FN Brno. Ejakulát byl získán masturbací do polypropy-lenových nádobek v odběrové místnosti centra po abstinenci 3–5 dnů. Analýza spermatu byla provedena podle manuálu WHO [1]. Pro stanovení počtu spermií byla použita Neubauerova komůrka. Centrifugací (2 790g po 10 minut) byla odstraněna seminální plazma. Peleta spermií byla převrstvena kultivačním médiem (Universal IVF Medium, Medi-Cult, Dánsko) a metodou „direct swim-up“ [1] získána suspenze spermií. Byla stanovena koncentrace a pohyb spermií. Byly připraveny nátěry spermií na podložní sklo a po zaschnutí transportovány do nanobiotechnologické laboratoře. Pro zobrazení spermií v nanometrickém měřítku byl použit AFM systém Ntegra Vita (NT-MDT, Moskva, Rusko, obr. 1). Pro všechna vyšetření byla použita měřicí hlava, typ SFC050LNTF (scanovací rozsah až 100 × 100 × 10 µm) s možností měření v kapalině (osazena skleněným hranolem pro uchycení měřicí sondy). Sklíčka s imobilizovanými spermiemi byla umístěna na dno Petriho misky a vnitřní objem byl naplněn sterilním izotonickým roztokem chloridu sodného. Pro vyšetření byly vybrány spermie bez výrazných morfologických změn. Vzorky vyšetřené v kontaktním modu při pokojové teplotě byly snímány pomocí silikon-nitridové sondy MLCT-O10 (Veeco Probes, www.veecoprobes.com, konstanta pružnosti 0,01 N/m, snímací rychlost 0,25 Hz). Obraz povrchu byl zaznamenáván s rozlišením 512 × 512 obrazových bodů.

**Obr. 1. Atomic Force Microscope Ntegra Vita (NT-MDT).**

Povrchová topografie a prostorová distribuce gradientu elektrických potenciálů na povrchu vzorku byla měřena a současně zaznamenávána, což umožnilo komplexní hodnocení povrchové morfologie. Po prvním scanování a zobrazení normálních spermií byla sklíčka vystavena po 30 minut peroxidu vodíku (50 mmol/l), kdy byl sledován proces poškození kontinuálně mikroskopem AFM. Defekty byly hodnoceny a zaznamenány.

Výsledky

Pro dosažení kvalitního obrazu bylo nutné vypracovat techniku přípravy nátěru s odstraněním složek, které nejsou optickým mikroskopem pozorovatelné – stopy seminální plazmy a krystaly solí po zaschnutí fyziologického roztoku na preparátu. Nastavení přístroje vyžadovalo optimalizaci několika parametrů. Byly získány obrazy spermií s vysokým rozlišením umožňujícím hodnocení detailní morfologie povrchu. Na hlavičce morfologicky normální spermie je možné rozpoznat ultrastrukturu povrchu v oblasti akrozomu a odstupu bičíku (obr. 2 a,b). Změny vyvolané působením peroxidu vodíku jsou zachyceny na obr. 3 a–c.

**Obr. 2. a,b. Zobrazení normální hlavičky spermie.**

**Obr. 3a. Zobrazení spermií před přidáním peroxidu vodíku.**

**Obr. 3b. Defekty hlaviček po přidání peroxidu vodíku.**

**Obr. 3. c. Detritus spermie za 10 minut po přidání peroxidu vodíku.**

Diskuze

Morfologie lidských spermií je obvykle vyšetřována na fixovaných a barvených nátěrech pomocí světelné mikroskopie, což umožňuje získat spolehlivou informaci o základním utváření spermie a případných patologiích. Tato metoda je spolehlivá, pokud jde o defekty v řádech mikrometrů [1]. Jestliže jsou však předpokládané patologie v řádu nanometrů, světelná mikroskopie selhává. Dosud nejčastěji používanou metodou vyšetření je elektronová mikroskopie – transmisní nebo scanovací. Zamboni použil tuto techniku v klasické studii patologie spermií a hodnotil její kvalitu [2]. Byly prokázány patologické změny hlavičky i bičíku. Tento postup však neumožňuje zachytit přesnou topografii, která je významná především v souvislosti s vyšetřením trojrozměrných struktur. AFM dokázala topograficky velmi přesně zachytit přítomnost tzv. „nano-grooves“ popsaných elektronovou mikroskopií v oblasti odstupu bičíku [3]. Další zde prokázanou výhodou AFM mikroskopie je schopnost zobrazovat vzorek s vysokým rozlišením i v kapalině, navíc v reálném čase, a zaznamenávat tak průběh sledovaného děje in-situ.

Oxidační stres – nerovnováha mezi nadprodukcí volných radikálů a účinností antioxidačních systémů spermatu je považována za jeden ze základních etiologických faktorů rychle narůstajících poruch plodnosti muže, velmi pravděpodobně poškozuje také oocyty [4–6]. Nadměrná produkce kyslíkových a dusíkových radikálů vede k poškození buněčné membrány spermie a poškození DNA. Důsledkem je ztráta schopnosti úspěšného oplodnění vajíčka nebo patologický vývoj embrya. V souvislosti se sníženou plodností muže byla prokázána zvýšená peroxidace lipidů a abnormální profily mastných kyselin v seminální i krevní plazmě [7,8].

Literárních údajů o vyšetření spermií metodou AFM je poměrně málo. K základním patří studie spermií králíka [9]. Joshi et al podrobně popsali patologie lidských spermií [10].

Závěr

Defekty spermie vyvolané experimentálním oxidačním stresem byly detailně zobrazeny. Studie potvrdila schopnost AFM mikroskopie zobrazit morfologii spermií až s nanometrickým rozlišením. Tato metoda může být důležitým nástrojem pro výzkum oxidačního stresu a poznání jeho vlivu na snížení plodnosti. Příprava vzorku a nastavení přístroje vyžaduje optimalizaci několika parametrů.

Studie byla podpořena grantem IGA MZ ČR NS/9661-4 a MŠMT ČR OPVK CZ.1.07/2.3.00/09.0167.

Doručeno do redakce: 2. 9. 2010

Přijato po recenzi: 7. 10. 2010

doc. MUDr. Igor Crha, CSc.1

Mgr. Jan Přibyl, Ph.D.2

doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.2

RNDr. Jana Žáková, Ph.D.1

prof. MUDr. Pavel Ventruba, DrSc.1

Ing. Eva Lousová1

doc. MUDr. Michael Pohanka, Ph.D.1

¹Gynekologicko–porodnická klinika LF MU a FN Brno

²Národní centrum pro výzkum biomolekul, Přírodovědecká fakulta MU Brno

icrha@seznam.cz

Zdroje

1. WHO laboratory manual for the Exa-mination and processing of human semen. 5. ed. World Health Organization 2010, Ženeva: 271.

2. Zamboni L. The ultrastructural pathology of the spermatozoon as a cause of infertility: the role of electron microscopy in the evaluation of semen quality. Fertil Steril 1987; 48(5): 711–734.

3. Joshi N, Medina H, Colasante C. Ultrastructural investigation of human spermatozoon by using atomic force microscope. Arch Androl 2000; 44(1): 51–57.

4. Agarwal A, Prabakaran SA, Said T. Prevention of oxidative stress injury to sperm. J Androl 2005; 26(6): 654–660.

5. Crha I, Hrubá D, Fiala J et al. The results of infertility treatment by in-vitro fertilisation in smoking and non-smoking women. Cent Europ J Prev Med 2001; 9(2): 64–68.

6. Crha I, Kubesova J, Kralikova M et al. Homocysteine, folate and vitamin B12 in seminal plasma. Hum Reprod 2007; 22 (Suppl 1): 218.

7. Oborná I, Fingerová F, Hajdúch M et al. Lykopen v terapii mužské plodosti. Čes Gynek 2007; 72(5): 326–329.

8. Oborna I, Wojewodka G, De Sanctis JB et al. Increased lipid peroxidation and abnormal fatty acid profiles in seminal and blood plasma of normozoospermic males from infertile couples. Hum Reprod 2010; 25(2): 308–316.

9. Ierardi V, Niccolini A, Alderighi M et al. AFM Characterization of Rabbit Spermatozoa. Microsc Res Tech 2008; 71(7): 529–535

10. Joshi N, Medina H, Crúz I et al. Determination of the ultrastructural pathology of human sperm by atomic force microscopy. Fertil Steril 2001; 75(5): 961–965.