Monozygotní dvojčata v asistované reprodukci

Súhrn

Úvod:
Monozygotní dvojčata (MZD) vznikají z jedné zygoty rozdělením embrya. U spontánních těhotenství se MZD vyskytují v 0,4 %. Incidence MZD po metodách asistované reprodukce se pohybuje od 0,2 % do 12,5 %. Příčina vzniku není doposud jasná. Mezi vnitřní faktory související s MZD je řazen vyšší věk, odlišná inaktivace X chromozomu a vrozené defekty proteinů zona pellucida (genetické faktory). Jako vnější faktory související s MZD jsou uváděny ovariální stimulace, mikromanipulační metody narušující zonu pellucidu, transfer blastocyst a kultivační podmínky.

Materiál a metody:
Retrospektivní studie monozygotních dvojčat zjištěných od ledna 2000 do srpna 2009 z cyklů v programu IVF s použitím metod ICSI, PGD i darování oocytů.

Výsledky:
Z 1 255 gravidit bylo zjištěno 25 (1,99 %) monozygotních dvojčat. Ve všech případech se jednalo o transfer embryí po pětidenní kultivaci. Mezi transferovanými embryi převažovaly expandované a hatchující blastocysty. Oproti celému souboru pacientek byl v této skupině zjištěn nižší věk pacientek (29,5 vs 32,4) a vyšší počet získaných oocytů (16,9 vs 14,9). Během posledních tří let byla zaznamenána vzrůstající tendence v počtu zjištěných MZD na graviditu, a to 2,8 % (rok 2007), 3,33 % (rok 2008) a 3,39 % (část roku 2009).

Závěr:
Incidence MZD v asistované reprodukci je několikrát vyšší než po spontánní koncepci. Skutečná incidence MZD je pravděpodobně vyšší než zjištěná v důsledku neúplného záchytu. Našli jsme souvislost výskytu monozygotních dvojčat s nižším maternálním věkem, vyšším počtem oocytů, ovariální stimulací a transferem kvalitních blastocyst.

Klíčová slova:
monozygotní – dvojčata – monochoriální – asistovaná reprodukce

Úvod

Techniky asistované reprodukce (AR) jsou široce používány po celém světě a jsou velmi úspěšné při léčbě neplodnosti. I přes velkou úspěšnost a široké použití AR přetrvávají obavy týkající se bezpečnosti, hlavně pokud jde o zvýšení podílu mnohočetných gravidit. Většina vícečetných těhotenství po AR jsou dizygotní, spojená s přenosem více embryí. Dvojčata jsou klasifikována jako dizygotní (DZD) pokud vznikají ze dvou individuálních embryí (různý genotyp). Mnoho publikací naznačuje zvýšení monozygotních dvojčat (MZD) v souvislosti s technikami AR. MZD vznikají oddělením buněk jednoho embrya (stejný genotyp), které zformují dvě nebo několik skupin. MZD se dále klasifikují podle chorionicity a amnionicity, které jsou dány stadiem vývoje, ve kterém dojde k rozdělení embrya. Pokud se embryo rozdělí do 4. dne po oplození, vznikají bichoriální biamniální (BCBA) dvojčata neodlišitelná sonograficky od DZD. Pokud dojde k rozdělení mezi 4. a 8. dnem, vznikají dvojčata monochoriální biamniální (MCBA) a při rozdělení po 8. dni vznikají monocho­riální monoamniální (MCMA) dvojčata. Rozdělení po 12. dni způsobí vznik spojených (siamských) dvojčat. BCBA tvoří asi 25–30% a MCBA asi 70–75% z MZD těhotenství a MCMA tvoří jen asi 1–2% z živě narozených plodů [1]. Ve srovnání s jednočetnou graviditou mají všechna dvojčetná těhotenství větší riziko nepříznivého ukončení, zejména porodu nezralého plodu.

U spontánních početí bez stimulace se MZD vyskytují vzácně v 0,4–0,45% [2,3]. Případ MZD po in vitro fertilizaci (IVF) byl poprvé publikován v roce 1984 [4]. Uváděná incidence MZD po metodách asistované reprodukce se dnes pohybuje od 0,2–12,5%. Po samotné ovariální stimulaci se udává zvýšená incidence MZD na 1,2–2% [3,5–7]; při kultivaci do blastocysty až na 13% [8–12].

Příčina vzniku MZD není doposud jasná. Mezi faktory související s MZD bývá řazen vyšší věk, odlišná inaktivace X chromozomu a vrozené defekty proteinů zona pellucida (genetické faktory), ovariální stimulace, mikromanipulační metody narušující zonu pellucidu, transfer blastocyst a kultivační podmínky [13].

V této práci jsme se pokusili najít spojitost různých technik používaných v AR s výskytem MZD zpětným zhodnocením všech dostupných dat IVF cyklů prováděných v našem centru v letech 2000–2009.

Materiál a metodika

Předložená práce je retrospektivní studií výskytu monozygotních dvojčat zjištěných od ledna 2000 do srpna 2009 po metodách AR. Stimulace ovarií gonadotropiny probíhala buď v dlouhém protokolu za použití GnRH agonistů, nebo v krátkém protokolu s použitím GnRH antagonistů. Získané oocyty byly oplozovány klasickou inseminací, nebo metodou injekce spermie do vajíčka (ICSI). Kultivace embryí probíhala v sekvenčních médiích Quinn‘s Advantage Medium (SAGE) nebo Sydney IVF Medium (COOK) do dne 5 při 37 °C a v 6% CO₂. V případě preimplantační genetické diagnostiky (PGD) byla 3. dne provedena biopsie blastomer embryí v biopsačním médiu (MediCult). Klinická gravidita byla definována jako přítomnost srdeční aktivity vaginální ultrazvukovou sondou v 6.–7. týdnu těhotenství, kdy byl také hodnocen počet gestačních váčků a plodů. Kritériem pro klasifikaci dvojčat jako monozygotních bylo ultrasonografické zjištění společného choria nebo přítomnost většího počtu implantovaných embryí, než bylo transferováno.

Výsledky

Z 1 255 gravidit bylo zjištěno 25 (1,99%) monozygotních dvojčat. Ve všech případech se jednalo o transfer embryí po pětidenní kultivaci bez kryokonzervace. Mezi transferovanými embryi převažovaly ve skupině monozygotních dvojčat expandované a hatchující blastocysty (tab. 1). Oproti celému souboru pacientek byl v této skupině zjištěn nižší věk pacientek (29,5 vs 32,4) a vyšší počet získaných oocytů (16,9 vs 14,9). Během posledních tří let byla zaznamenána mírně vzrůstající tendence v počtu zjištěných MZD na graviditu, a to 2,8% (rok 2007), 3,33% (rok 2008) a 3,39% (leden až srpen 2009). Monochoriální dvojčata byla zjištěna po oplození bez mikromanipulace (5×), po PGD (3×) i u darování oocytů (4×). Po kryoembryotransferu a po transferu embryí 3. den jsme nezaznamenali žádné MZD. Všechna zjištěná MZD byla kultivována v médiích SAGE, více jich bylo zaznamenáno po stimulaci v dlouhém protokolu a po transferu blastocyst. Nezjistili jsme zvýšený výskyt MZD při použití mikromanipulačních technik ICSI a PGD (tab. 2). Ve čtyřech případech se jednalo o dvojčetné těhotenství, ve dvaceti případech o trojčetné a v jednom o čtyřčetné těhotenství. U pěti pacientek (devět plodů) došlo ke spontánní redukci monozygotních těhotenství na jednočetná. U jedenácti pacientek byla provedena fetoredukce buď obou monozygotních zárodků, nebo třetího samostatného zárodku. Zredukováno bylo 20 plodů. Celkem v šesti případech došlo k samovolnému potratu všech plodů (11 zárodků), z toho dvakrát po provedené fetoredukci. Z porozených plodů bylo 20 ženského a 11 mužského pohlaví (6× ženská MZD, 2× mužská MZD). Porod u vícečetných těhotenství proběhl dříve než porod jednoho plodu, dřívějšímu termínu porodu také odpovídala nižší porodní hmotnost dětí z vícečetných těhotenství (tab. 3). Jeden plod zemřel po porodu a jeden plod byl porozen mrtvý. U tohoto plodu byl zjištěn aberantní karyotyp [14]. 

Diskuze

Během daného období jsme zjistili 1,99% monochoriálních dvojčat v našem souboru, což odpovídá obecně uváděné zvýšené incidenci po metodách AR oproti spontánním těhotenstvím. Ve všech případech MZD byla transferována embrya 5. dne bez předchozí kryokonzervace, převažovala stadia expandované a hatchující blastocysty. Všechna embrya, ze kterých vznikla MZD, byla kultivována v sekvenčních médiích SAGE. Překvapivě málo se ví o mechanizmech vzniku nebo o rizikových faktorech působících v časném embryonálním vývoji, které dávají vznik MZD.

Transfer blastocyst obecně zlepšuje pregnancy rate (PR) ve srovnání s transferem buněčných embryí [15,16], nicméně mnoho prací předpokládá, že transfer blastocyst pravděpodobně zvyšuje incidenci MZD [10–12,17–21]. Steinman předpokládá, že delší expozice blastocyst nižším koncentracím kalcia v kultivačním prostředí predisponuje embryoblast k rozdělení destabilizací mezibuněčných vazeb [22]. Menezo a Sakkas zase předpokládají vliv větší koncentrace glukózy v sekvenčních médiích, která vede ke vzniku většího množství volných radikálů indukujících selektivní apoptózu vedoucí k oddělení embryoblastu a vzniku MZD [23]. Prodloužená kultivace v suboptimálních podmínkách může způsobit metabolický stres zeslabující buněčné adheze a přerušující komunikaci mezi blastomerami. To vede k formování dvou oddělených embryoblastů a zvýšení incidence MZD [12]. Chida již v roce 1990 publikoval přítomnost dvou oddělených embryoblastů ještě před hatchingem v 0,6 a 3,1% pro in vivo a in vitro oplozovaná myší embrya [24]. Meintjes et al publikovali trojčetné těhotenství po transferu dvou blastocyst, z toho jedna měla dva oddělené embryo­blasty [25]. Dále Payne et al publikovali u dvou embryí z 26 dvě oddělené oblasti embryoblastu [26]. Většina autorů předpokládá vznik druhé oblasti embryoblastu ektopickou adhezí a následnou proliferací buněk embryo­blastu na opačnou stranu trofektodermové stěny, následující blastocélový kolaps s následnou reexpanzí blastocysty [27–29]. Dále se také uvažuje potenciální vliv zony pellucidy (ZP) při hatchingu (mechanické rozdělení, přerušení embryoblastu) na výskyt MZD. Některými autory bylo pozorováno spontánní rozdělení na dvě kompletní embrya během hatchingu in vitro [28,29]. Nedá se předpokládat, že jde o exkluzivní mechanizmus vzniku MZD, jelikož i po transferu blastocyst bez ZP byl zjištěn výskyt MZD [30,31].

Pokud jde o věk matky, dřívější práce uváděly vyšší riziko MZD u žen s věkem nad 35 let [22,32]. My jsme naopak zjistili vyšší incidenci u mladších žen, což je ve shodě s prací Knopman et al, kde byla zjištěna vyšší incidence MZD u žen pod 35 let (3,1%) v programu darování oocytů (3,3%) a při prodloužené kultivaci (2,6%) [33]. V této práci také ve shodě s našimi výsledky nebyla nalezena vyšší incidence MZD při použití mikromanipulačních technik. Existují publikace udávající vyšší riziko MZD po užití mikromanipulačních technik [18,32,34–36], ale i práce, které nenalezly asociaci mezi vyšším výskytem MZD a mikromanipulačními technikami [7,11,12,37,38]. Nezaznamenali jsme zvýšený výskyt MZD ani po PGD. Stejně tak Verpoest et al uvádí incidenci MZD po PGD 1,5% a bez PGD 2,1% [13]. Naopak Haimov-Kochman et al zjistili vyšší výskyt MZD na těhotenství po PGD 7,7% oproti cyklům bez PGD 0,48% MZD [39].

Vícečetná těhotenství jsou charakteristická zvýšeným výskytem jak fetálních, tak maternálních komplikací. Fetální komplikace zahrnují opožděný vývoj, zvýšený výskyt fetálních ztrát, vyšší výskyt vrozených vývojových vad, předčasný porod (nezralost plodů a z ní vyplývající morbidita plodů) i perinatální ztráty. Matky s vícečetným těhotenstvím trpí častěji těhotenskou nevolností a zvracením, hypertenzí a preeklampsií [40]. Placentální uspořádání je důležitý faktor ovlivňující jak výsledek MZD těhotenství, tak výskyt komplikací závisejících převážně na stupni placentálního sdílení. MZD mohou mít od kompletně odděleného amnia a choria po jedno amnion i chorion sdílené oběma plody. Výskyt fetálních komplikací je podobný u DZD a bichoriálních MZD, avšak těhotenství s monochoriálními dvojčaty jsou náchylná k dalším komplikacím. Většina monochoriálních dvojčat má cévní anastomózy a sdílení krevního zásobování může způsobit twin to twin transfusion syndrom. Výskyt syndromu je uváděn v 10–20% monochoriálních těhotenství [41]. Podmínky charakterizované nerovnoměrným sdílením maternálního krevního zásobení končí nerovnoměrným fetálním růstem a fetální mortalitou v 80 i více% neléčených případů [42]. MCMA těhotenství přinášejí také vyšší riziko pupečníkových uzlů [43]. Rizika spojená s monochoriálními dvojčaty ve vícečetném těhotenství jsou tak vysoká, že jsme v případě nálezu tří a více plodů u našich pacientů vždy doporučovali provedení fetoredukce [44].

Závěr

Dokumentovaná incidence MZD v asis­tované reprodukci je čtyřikrát vyšší než po spontánní koncepci. Skutečná incidence MZD je pravděpodobně ještě vyšší, jelikož sonograficky nejsou zjištěna BCBA MZD, která tvoří čtvrtinu i více případů spontánních MZD. Vznik MZD bude pravděpodobně spojen s více faktory, jako jsou embryonální vývoj nebo implantace, mechanické rozdělení časného embrya i změny v kultivačních podmínkách. Ve skutečnosti je zřejmě zapojena kombinace faktorů, některé faktory jsou pravděpodobně důležitější. Nelze vyloučit genetické faktory spojené s rodinným výskytem a predispozicí k MZD [45]. V našem souboru jsme našli souvislost výskytu monozygotních dvojčat s nižším mater­nálním věkem, vyšším počtem získaných oocytů, typem ovariální stimulace a transferem blastocyst ve srovnání s transferem méně pokročilých stadií.

Doručeno do redakce: 16. 9. 2010

Přijato po recenzi: 30. 9. 2010 

RNDr. Eva Oráčová, Ph.D.1,2

prof. MUDr. Pavel Trávník, DrSc.1

Mgr. Gabriela Tauwinklová1

MUDr. Kateřina Veselá, Ph.D.1

MUDr. Lenka Hromadová1

MUDr. Jan Veselý, CSc.1

¹Sanatorium REPROMEDA s.r.o., Brno

²Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v.v.i., Brno

eoracova@repromeda.cz