Současný význam biologických a nebiologických eliminačních metod v léčbě akutního selhání jater

Súhrn

Úvod:
V posledních dvou desetiletí lze pozorovat velké úsilí ve vývoji eliminačních metod použitelných v léčbě akutního selhání jater (ASJ), které by umožnily zlepšit přežití pacienta pod dobu regenerace jaterního parenchymu nebo do doby nálezu vhodného dárce jater k transplantaci. Existuje celá řada eliminačních metod, jejichž využití je v různých stadiích experimentálního či klinického testování.

Metodika:
K literární rešerši bylo použito vyhledávače PubMed. Vyhledávané termíny byly omezeny na biologické a nebiologické eliminační metody. Z vlastních experimentálních zkušeností autorů byly použity závěry publikací.

Výsledky a diskuse:
Biologické eliminační metody, založené na využití hepatocytů, mohou teoreticky zajistit jak detoxikaci, tak i syntetické funkce jater. Experimentální studie na zvířatech prokázaly snížení některých markerů ASJ. Provedená randomizovaná studie však neprokázala prodloužení života nemocných. Nedořešeným problémem u bioelimiace je zdroj funkčních hepatocytů a dostatečná kapacita bioreaktoru. Nebiologické metody, jako je výměna plazmy, hemodialýza, hemofiltrace, albuminová dialýza nebo systémy založené na adsorpci, odstraní sice některé toxiny, avšak ostatní specifické jaterní funkce suplementovat nedokáží. Systémy MARS^® a Prometheus^® byly s úspěchem použity v léčbě ASJ u člověka. Randomizovaná studie zatím provedena nebyla. Nebiologické metody mnohdy neselektivně odstraňují některé toxiny či cytokiny a jsou limitovány kapacitou adsorbérů. Východiskem mohou být systémy založené na selektivní plazmatické filtraci či hybridní systémy, které spojují funkce obou metod.

Autoři v experimentu na praseti prokázali signifikantní snížení hladiny bilirubinu u obou metod, signifikantní snížení intrakraniálního tlaku pouze u metody nebiologické s použitím přístroje Prometheus^®.

Závěr:
Efektivní eliminační metodu zlepšující přežití pacientů s ASJ se doposud nepodařilo vyvinout. Při srovnání současných možností podpory funkcí selhávajících jater lze konstatovat, že očekávané výsledky biologické eliminační metody do klinické praxe zatím nepřinesly. Užití nebiologických metod se v současné době jeví jako perspektivní a jejich přínos se prokazuje na prospektivních studiích. K jejich zhodnocení je však třeba provést randomizované studie. Vlastní experimentální zkušenosti autorů tento trend potvrzují.

Klíčová slova:
akutní selhání jater – bioartificial liver – nebiologické eliminace – Prometheus^®

_ÚVOD

Akutní selhání jater (ASJ) představuje velmi závažné onemocnění s vysokou mortalitou. Je ve většině případů charakterizováno rychlým výpadkem jaterních funkcí s rozvojem koagulopatie a encefalopatie s hrozícím ireverzibilním poškozením mozku [1]. Onemocnění může progredovat do multiorgánového selhání nebo nezvládnutelné infekce. Při konzervativní terapii dosahuje přežití vzhledem k výskytu fatálních infekčních komplikací pouhých 10–40 % [2]. Jedinou současnou metodou, která zlepšuje přežití, je ortotopická transplantace jater (TJ). Akutní provedení TJ však naráží na nedostatek kadaverózních jaterních štěpů. V době, po kterou pacient čeká na vhodného dárce jaterního štěpu či po kterou může dojít ke spontánní regeneraci jaterního parenchymu, je pacient akutně ohrožen na životě. Současné možnosti, jak pacienta přes toto období převést (tzv. „bridging“), jsou limitovány. V posledních letech proto dochází k rozvoji biologických i nebiologických eliminačních metod, které by umožňovaly efektivnější bridging, a tím zlepšily šanci nemocného s ASJ přežít.

I. BIOLOGICKÉ ELIMINAČNÍ METODY

Myšlenka „umělých jater“ (BAL – bioartifitial liver) vznikla zhruba před 50 lety, kdy Sorrentino prokázal, že čerstvá jaterní tkáň syntetizuje ureu z chloridu amonného a metabolizuje ketony [3]. Trvalo ovšem dalších 20 let, než dostala bioartificiální játra podobu zařízení s extrakorporálním oběhem, do kterého byla zapojena kapsle s živými izolovanými nádorovými buňkami hepatomu. V následujících 30 letech se zabývala touto problematikou celá řada center a byly vyvinuty různé způsoby bioeliminace od prosté extrakorporální perfuze jater [4] přes transplantaci jaterních buněk [5] až k propracovaným BAL.

Transplantace hepatocytů

Metoda transplantace hepatocytů se začala experimentálně používat v polovině sedmdesátých let a byla vyzkoušena i v klinickém experimentu. Existuje celá řada způsobů, jak hepatocyty do organismu vpravit. Provádí se tzv. hepatizace sleziny, buňky je možné aplikovat do poškozených jater nebo je zabalené v polymeru vložit přímo do peritoneální dutiny [6, 7]. Mohou být použity buňky čerstvé, po rozmražení či enkapsulované. Výsledky těchto postupů však nejsou příliš přesvědčivé a přínosné byly jen u některých vrozených metabolických poruch [5].

BAL

Principem je mimotělní krevní oběh, ze kterého je separována plazma a ta je perfundována přes jaterními buňkami osazená dutá vlákna uložená v bioreaktoru. V soustavě je zapojen většinou oxygenátor, případně aktivní uhlí či pryskyřice, která pomáhá v procesu detoxifikace. Samotné jaterní buňky kromě detoxikace (nahrazují selhávající cytochrom P450) plní ještě funkci syntetickou (proteosyntéza, glukoneogeneze, ureogeneze) (Obr. 1).

V dnešní době jsou nejpoužívanější systémy ELAD (Extracorporeal liver assist device), HepatAssist^® a MELS (medular extracorporeal liver system) [8, 9, 10]. Tyto systémy se osvědčily jak v experimentu na zvířatech, tak i ojediněle v experimentu klinickém (Obr. 2, 3).

Experimentálně byl prokázán jejich vliv na snížení intrakraniálního tlaku (ICP), sérových hladin bilirubinu, amoniaku a transamináz. Největší klinická multicentrická studie byla provedena systémem HepatAssist^® na skupině 171 pacienta s ASJ (85 léčených a 86 v kontrolní skupině bez léčby) při použití porcinních hepatocytů. Výsledek však nesplnil očekávání: snížení mortality před TJ u pacientů s otravou hepatotoxickým jedem a u pacientů s fulminantním průběhem ASJ nebylo signifikantní. Nebylo prokázáno ani signifikantní zlepšení 30denního přežití u těchto nemocných [11].

Navíc se ukázaly problémy s klinickým využitím BAL. I když nebylo prokázáno nebezpečí přenosu prasečích retrovirů (PERV – porcine endogenous retrovirus), obavy spojené s použitím porcinních hepatocytů mnohdy přetrvávají [12]. Obtížně řešitelná je také dostupnost požadovaného množství hepatocytů. Kryoprezervace hepatocytů, která by umožnila jejich rychlé použití, vede k výraznému snížení viability a tím i účinnosti bioeliminace. Na straně druhé jsou některé problémy s BAL v budoucnosti patrně řešitelné. Slibným zdrojem buněk by mohly být pluripotentní zárodečné buňky. Pro možnou diferenciaci v hepatocyty je možné použít několik buněčných populací. Jde o hematopoetické, mezenchymální zárodečné buňky a dále o tzv. oválné buňky (HLSC – human liver-derived stem cells) získané přímo z jaterního parenchymu. Jejich přítomností je někdy vysvětlována obrovská regenerační schopnost jater [13].

Z výše uvedeného plyne, že klinické použití bioeliminačních metod nelze v krátké době očekávat. Podmínkou je vyřešení zásadních problémů spojených se získáváním dostatečného množství zdravých a funkčních hepatocytů, se zkrácením a zjednodušením jejich přípravy, prodloužením doby jejich použitelnosti a se zvýšením kapacity bioreaktorů.

II. NEBIOLOGICKÉ ELIMINAČNÍ METODY

Principem nebiologických eliminačních metod je odstranění toxinů způsobujících ireverzibilní poškození mozku pacienta. Tato myšlenka vznikla na počátku padesátých let minulého století a vycházela z předpokladu, že jde o malé molekuly, které je možné odstranit hemodialýzou (HD), hemofiltrací či různými absorbéry [14, 15, 16]. Dnes však víme, že škála látek ovlivňujících průběh ASJ, je daleko širší. Vedle nízkomolekulárních látek, jako jsou amoniak, fenoly a volné žlučové kyseliny, to jsou i prozánětlivé mediátory (cytokiny, anafylatoxiny), vazoaktivní látky a inhibitory buněčného růstu (transforming growth factor 1 – TGF1). Rozptyl molekulární hmotnosti těchto látek je obrovský, od 500 Da až do 100 kDa. Řada z nich je navíc vázána na plazmatické bílkoviny [17]. Z tohoto pohledu není překvapením, že původně využívané metody neovlivnily přežití pacientů a byly záhy vystřídány terapeutickou náhradou plazmy či celé krve [18]. Tyto postupy sice zaručují snížení hladiny uvedených látek v oběhu, avšak nesou s sebou celou řadu nevýhod v podobě posttransfuzní reakce: vznik hypokalcemie, hypotermie, metabolické acidózy a plicního edému. Dále vedou k úbytku koagulačních faktorů a ke snížení exprese růstového faktoru hepatocytů (hepatocyte gowth factor – HGF), jehož nedostatek přispívá k progresi ASJ. Další nevýhodou jsou i vysoké náklady. Všechna tato negativa zapříčinila odklon od těchto metod směrem k léčbě založené na principu adsorpce.

MARS^®

Prvním dokonalejším adsorbčním zařízením je systém MARS^® (Molecular Adsorbent Recycling System), který byl poprvé experimentálně použit počátkem devadesátých let minulého století [19]. Principem tohoto zařízení je okruh s cirkulujícím roztokem albuminu, který přes semipermeabilní, pro albumin nepropustnou, membránu difuzí přejímá z krve pacienta toxiny vázané na albumin [20]. Vzhledem k tomu, že 60–80 % bilirubinu je vázáno právě na albumin, snižuje MARS^®u nemocných s ASJ signifikantně hladinu bilirubinu [21]. Tato metoda byla použita k léčbě ASJ u tisíců pacientů, avšak randomizovaná studie prokazující efektivitu této léčby doposud chybí. Hlavním důvodem jsou obtíže s přípravou designu průkazné klinické studie. Bez ohledu na tuto skutečnost se MARS^® osvědčil při léčbě hepatorenálního syndromu, cholestatického postižení jater a některých otrav hepatotoxickými látkami. Jeho nevýhodou jsou poměrně vysoké náklady při opakování léčby.

Prometheus^®

Na podobném principu je sestrojen i eliminační systém Prometheus^® (FPSA – Fractionated plasma separation and adsorbtion), který kombinuje albuminovou dialýzu s hemodialýzou. Nevyžaduje nákladné doplňování albuminového okruhu. Z krve očištěné high-flux hemodialýzou je separována plazma, která prochází dvěma adsorbéry (Prometh 01, Prometh 02). Prometh 01 propouští molekuly do velikosti 250 kD. Tím dochází k adsorpci žlučových kyselin, aromatických aminokyselin, fenolických substancí a toxinů. Prometh 02 – se styren-divinylbenzen kopolymerem s prostorovou sítí 100 μm, vychytává negativně nabité ligandy (nekonjugovaný bilirubin). Nosičem toxinů je zde albumin pacienta a tudíž ho není nutné do systému dodávat.

Ze srovnání obou nebiologických systémů vychází lépe Prometheus^®, a to v resorpci látek jak rozpustných ve vodě, tak i vázaných na albumin [22] (Obr. 4).

Jednou z původně vyzdvihovaných výhod systému Prometheus^® byla i možnost jeho užití jako prosté hemodialýzy. Pracoviště, které si tento přístroj zakoupilo, mělo tedy vlastně 2 systémy v jednom. Užití Promethea jen pro hemodialýzu je však nejenom nákladnější, ale může pacienty ohrozit indukovanou koagulopatií. Během testování in vitro byl totiž zjištěn signifikantní úbytek proteinu C na výstupu z adsorberu Prometh 02 až o 52 %. Klinicky se takto navozená koagulopatie manifestovala nejčastěji jako trombóza arterio-venózního shuntu [23].

U přístroje Prometheus^® je nejdůležitější, že určil trend nebiologické eliminace směrem k výraznému zjednodušení.

SEPET

Nejnovějšími nebiologickými eliminačními metodami jsou systémy SPAD (Single-pass albumin dialysis) a SEPET^® (Selective plasma filtration therapy), jejichž základem jsou dutá vlákna tvořená z high-flux membrány, která je částečně propustná pro albumin [24]. Systém SEPET^® vychází z nových poznatků o významu některých již zmiňovaných látek (HGF, TGF1, Il-6 a jiných prozánětlivých interleukinů) v patofyziologii ASJ [25]. Většina těchto látek má molekulovou hmotnost menší než 100 kDa. Membrána tohoto selektivního filtru je tudíž koncipována tak, aby byla volně propustná pro tyto nízkomolekulární látky, stejně tak jako pro další endotoxiny (lipid A) a anafylatoxiny (C3a). Naopak membrána je nepropustná pro některé imunoglobuliny (IgG, IgM), v limitovaném množství propouští albumin a koagulační faktory [17]

Výsledkem experimentální studie s použitím této eliminační metody prováděné na prasečím chirurgickém devaskularizačním modelu ASJ je signifikantní snížení amoniaku, aromatických aminokyselin, prozánětlivých cytokinů (IL-6, IL-18, IL1, TNF) a TGF1. Naopak propustnost pro albumin a většinu koagulačních faktorů a HGF je menší než 30 %.

Během šestihodinové léčby pomocí SEPET se vyprodukuje přibližně 2 500 ml ultrafiltrátu, což odpovídá 1,6–2 litrům plazmy, kterou je možné při klinickém použití snadno substituovat [17]. Membrána je nepropustná pro imunoglobuliny, což ovlivňuje pozitivně průběh ASJ. Tento systém, na rozdíl od přístroje MARS^®, nepočítá s filtrací bilirubinu, jehož cytotoxický efekt je nyní považován za sporný. Dokonce existují data hovořící o jeho antiapoptotické aktivitě [26].

Systém SEPET^® tak představuje jednoduchou, ne příliš nákladnou a efektivní podpůrnou metodu v léčbě ASJ. V současné době probíhá randomizovaná studie, která by měla prokázat účinnost tohoto systému.

_{VLASTNÍ ZKUŠENOSTI}

Problematikou zhodnocení přínosu eliminačních metod v experimentu se kolektiv autorů zabývá již 6 let. Prvním úkolem bylo zavedení modelu ASJ na zvířeti. Podmínky jsme si stanovili dvě: zvolené laboratorní zvíře by se mělo svou anatomií co nejvíce blížit člověku a ASJ by mělo svým rozvojem odpovídat nejpravděpodobnějšímu průběhu selhání jater v humánní medicíně. Z těchto důvodů jsme zvolili chirurgický devaskularizační model ASJ s provedením portokavální anastomózy u prasete, který se nám podařilo standardizovat, jak co do provedení [27, 28], tak i do monitorace [29, 30]. Za nejdůležitější marker ASJ jsme považovali hodnotu intrakraniálního tlaku (ICP), dále hladinu bilirubinu, amoniaku a koagulačních faktorů. Hodnotu hladin transamináz jsme v souladu s literaturou nepovažovali za rozhodující [31].

Nejprve jsme se rozhodli zhodnotit biologickou eliminační léčbu. Zvolili jsme přístroj O. liver Performer fy Rand (Itálie) s bioreaktorem izolovaných hepatocytů.

Po nácviku izolace hepatocytů jsme provedli bioeliminaci na sestavě 10 prasat s ASJ průměrné váhy 30 kg. Prokázali jsme signifikantní snížení hladiny bilirubinu v experimentální skupině, nicméně signifikantní snížení ICP ve srovnání s kontrolní skupinou nikoliv (32). Pro nebiologickou eliminační léčbu ASJ jsme použili systém frakcionované plazmatické separace a adsorpce (FPSA), přístroj Prometheus^® firmy Fresenius (Německo) (Obr. 5) u skupiny 14 prasat průměrné váhy 37 kg. Prokázali jsme signifikantní snížení jak hladiny bilirubinu, tak i hodnot ICP, které nedosahovaly úrovně, u které by došlo k ireverzibilnímu poškození mozku v experimentální skupině zvířat [33, 34].

_ZÁVĚR

Efektivní eliminační metodu zlepšující přežití pacientů s ASJ se doposud nepodařilo vyvinout. Při srovnání současných možností podpory funkcí selhávajících jater lze konstatovat, že očekávané výsledky biologické eliminační metody do klinické praxe zatím nepřinesly. Užití nebiologických metod se v současné době jeví jako perspektivní a jejich přínos je prokázán na prospektivních studiích. K jejich zhodnocení je však třeba provést studie randomizované. Vlastní experimentální zkušenosti autorů tento trend potvrzují. Prokázali u ASJ v experimentu s nebiologickým podpůrným systémem Prometheus^® signifikantní snížení jak hladiny bilirubinu, tak i hodnot intrakraniálního tlaku. Přínos eliminační léčby ASJ či jaterní dysfunkce po velkých jaterních resekcích doposud prokázán nebyl.

Každý z přístupů, biologický či nebiologický, k eliminaci při ASJ přináší svá pro i proti. Nabízí se tedy myšlenky tyto systémy spojit. Vznikají tak tzv. hybridní systémy, jejichž někteří zástupci (MELS, HepatAssist-2) jsou již v experimentálním testování. Otázkou je, zda obrovská složitost takového systému nebude limitovat jeho klinické využití.

MUDr. O. Ryska

Biskupcova 89

130 00 Praha 3

e-mail: ondrejryska@centrum.cz