Příprava experimentálního modelu defektní anastomózy tlustého střeva prasete − souhrnné sdělení

Súhrn

Anastomotický leak je v kolorektální chirurgii závažnou komplikací. Problematikou poruch hojení střevní anastomózy se zabývá řada experimentálních prací zejména ve smyslu aplikovaného výzkumu. Design zvířecích modelů je přitom různorodý a výsledky jednotlivých prací jsou těžko porovnatelné. Tato práce pojednává souhrnně o hlavních bodech problematiky plánování zvířecích modelů střevních anastomóz, které jsou jednotlivě rozebrány. Hlavní částí textu je popis modelu defektní střevní anastomózy prasete. Anastomóza je v modelu konstruována s lokalizovanou protruzí sliznice. Zvířata jsou pooperačně sledována 3 týdny, monitorovány jsou jak klinický stav, tak změny vitálních hodnot, laboratorních parametrů, je prováděno v definovaných bodech CT vyšetření. Na konci observačního období jsou odebrány vzorky, hodnocen makroskopický nález v dutině břišní, skórování adhezí, známky leaku či poruch pasáže. Histologicky jsou preparáty hodnoceny jak standardními metodami analyzujícími vaskularitu, zánětlivou infiltraci a podíl kolagenu, tak metodami vyvinutými de novo pro potřeby experimentu, jako je analýza integrity střevní stěny v místě slizniční protruze. Experimentálního modelu si ceníme pro možnost systematické a podrobné analýzy stavu zhojení anastomózy v kombinaci s podrobným observačním protokolem, jež vytvářejí klinicky relevantní výsledky.

Klíčová slova:

zvířecí modely – anastomotický leak – kolorektální chirurgie – experiment – střevní anastomóza

ÚVOD

Problematika poruch hojení a s nimi spojených pooperačních komplikací je stále aktuální otázkou chirurgie zažívacího traktu. Jedná se o širokou škálu chirurgických zákroků a jejich specifických komplikací [1]. Konstrukce anastomózy je jedním ze základních kamenů viscerální chirurgie a jako taková jistě nebude v blízké budoucnosti nahrazena alternativními metodami. Tento výkon bohužel provází v závislosti na řadě faktorů několik typů komplikací. Jedním z nejobávanějších je vznik anastomotického leaku, pro který je typický vznik v časném pooperačním období a který je často spojen s enormním dopadem na průběh stonání a často i výslednou pooperační kvalitu života [2]. V poněkud širším časovém horizontu jsou pacienti ohroženi vznikem anastomotických striktur, ale i ty vedou k dlouhodobým potížím, nutnosti dalších a dalších chirurgických či endoskopických zákroků spojených s dlouhodobou traumatizací pacienta s jistým snížením jeho kvality života [3].

Etiologie vzniku těchto komplikací je doposud probádána pouze povrchně. Pokud se jedná zejména o anastomotický leak, známá je pouze řada kontribuujících faktorů, jejichž souhra vyústí v manifestaci poruchy hojení [4]. Vzhledem k palčivé problematice kolorektálního leaku je v experimentálních podmínkách testována řada produktů a léčiv, případně procedur majících za cíl snížení její četnosti, až eliminaci jejího výskytu. Většina prací je vedena pouze způsobem aplikovaného výzkumu a základní otázky fyziologie a mechaniky procesu hojení trávicí trubice tak zůstávají nezodpovězeny. Design zvířecích modelů je různorodý, tvořený vždy na míru potřebám daného výzkumu, což je správně, nicméně výsledky jednotlivých prací nelze vždy díky rozdílné metodice snadno porovnávat mezi sebou. Jelikož je etiologie vzniku anastomotické dehiscence multifaktoriální, je třeba, aby se jednotlivé studie zabývaly buď specifickou léčbou ve výzkumu aplikovaném, či partikulárními patofyziologickými mechanismy jejího vzniku v případě výzkumu základního. Kvalitní střevní modely jsou tedy velice důležité a jejich design musí být pečlivě navržen na míru potřebám projektu.

Protože přirozený výskyt komplikací anastomóz na zažívacím traktu u zdravých experimentálních zvířat je velmi nízký, je třeba využít vhodný model anastomózy tak, aby výtěžnost výsledků a jejich klinická relevance byly co největší i při zachování nízkých počtů operovaných zvířat a dalších nepodkročitelných zásad 3R [5].

Záměrem následujícího textu je poskytnout přehled o možnostech a limitacích experimentálních modelů anastomóz zažívacího traktu, současně je prezentovat na konkrétním příkladu experimentálního modelu defektní anastomózy tračníku prasete, vytvořeného pro potřeby výzkumu naší laboratoře [6−8] a několika vybraných studiích ze světové literatury.

• Experimentální zvíře

Existuje řada zavedených experimentálních modelů anastomóz na různých etážích zažívacího traktu. Jako první je třeba při plánování projektu zvolit experimentální zvíře. S přihlédnutím k anatomii zažívacího traktu a jeho fyziologii jsou vhodná modelová zvířata, která se blíží nejvíce lidskému tělu. Použití primátů je v současné době z jasných etických důvodů prakticky nemožné. Nejčastějšími modelovými zvířaty jsou v současnosti prase, potkan, myš, v daleko menší míře potom ovce, pes [9]. Hlodavci umožňují snadnou manipulaci, relativně nižší náklady na operační i perioperační péči, zároveň i možnost provedení pokusu na větším počtu jedinců v krátkém čase. U větších zvířat je však výhoda rozměrové podobnosti s lidským traktem, která umožní vytvořit i mechanicky věrohodný model, a tedy klinicky relevantnější. Kromě mechanického faktoru může být limitací u malých modelů nemožnost nebo vysoká obtížnost provádění některých vyšetřovacích a laboratorních metod (pravidelné krevní odběry, endoskopie), nemožnost provedení staplerové anastomózy, pokud je to potřeba. Uvážíme-li vliv stravovacích návyků, mikrobiomu, mechaniky vyprazdňování atp., prase je velmi relevantním modelovým zvířetem pro ověřování hypotéz, jak bylo prokázáno v některých studiích [10,11].

• Úroveň anastomózy, její konfigurace, technika sutury

Konkrétní typ výkonu závisí přímo na zamýšlené studované problematice. Z toho pohledu je třeba věnovat pozornost udržení jednoduchosti experimentu. Náročné chirurgické výkony se složitou rekonstrukcí zažívacího traktu a složité experimentální podmínky neumožňují jednoduchou interpretaci výsledků, odhalení jasných spojitostí mezi příčinou a následkem a obecně mohou být příčinou nutnosti použití větších souborů zvířat pro dosažení dobře čitelných výsledků a statisticky signifikantních rozdílů mezi skupinami. Je také důležité v neposlední řadě brát v potaz anatomické rozdíly daného druhu a jeho limitace, např. několikakomorový žaludek u přežvýkavců, spirální tračník prasete atp., které neumožňují věrně provádět některé chirurgické výkony a mohou mít i vliv na mechaniku zátěže spojky.

Konfigurace anastomózy a technika sutury by měly respektovat studovanou problematiku. Tato otázka je jasná, pokud je technika konstrukce samotnou zkoumanou metodou. Pokud ne, mělo by být zvoleno řešení, které bude co možná v nejmenší míře interferovat s vyhodnocením výsledků.

• Modely komplikací a poruch hojení

Pro sledování efektu léčebných prostředků je vhodné provádět experiment na modelu poruchy hojení. Většina známých modelů počítá se simulací některého známého rizikového faktoru anastomotického leaku nebo s technickou konstrukční chybou (konstrukční chyba, riziková anastomóza, ischemie, ozáření, chemoterapie, imunosuprese, infekce) [12−14]. V mezích 3R je však obtížné vytvořit statisticky hodnotitelný a zároveň dostatečně robustní soubor zvířat s klinicky významným a relevantním anastomotickým leakem. Simulace vysoké míry rizika leaku v desítkách procent umožňuje sice vznik souborů s dostatečnými statistickými rozdíly výsledků, však samotný podklad vzniku leaku již přestává být v jednotlivých modelech odpovídající reálnému podkladu vzniku leaku v klinickém prostředí. Je-li vznik leaku hlavním hodnoceným parametrem, je pak výstup experimentu binární hodnotou (např. dvě zvířata měla leak a dvě neměla), což pro důvěryhodnost výzkumu vyžaduje jistě větší soubory zvířat. Naproti tomu hodnocení kvality a dynamiky hojení například histologickými metodami, biochemicky, imunohistochemicky, v kombinaci s dalšími technikami, jako jsou průběžná zobrazovací vyšetření, mechanické testy atp., nabízí jako výsledek místo binární odpovědi škály, které nejen umožní redukci velikosti souboru, ale přinášejí i velké množství dalších dat k posouzení [6−8,15,16].

• Hodnoticí parametry

Základní hodnoticí parametry jsou dány průběhem stonání experimentálních zvířat. Jednak jsou to změny klinického nálezu (aktivita, vitální hodnoty, hmotnost, teplota atp.), jednak nálezy paraklinických vyšetření (zobrazovací vyšetření, laboratorní vyšetření) [8,17,18]. Kromě klinických známek manifestace anastomotického leaku, které jsou do jisté míry nespecifické, je pak důležitý abdominální nález a lokální změny v oblasti anastomózy. V experimentálních modelech jsou standardně hodnoceny peritoneální změny včetně srůstů, přítomnost a charakter peritoneálního výpotku, změny průměru střevní trubice, dále nález v oblasti samotné anastomózy. Zde je třeba se makroskopicky vyjádřit k přítomnosti defektů, stenóz, adhezí, ev. abscesů a jiných patologických lokálních změn. V některých publikacích je dokonce lokální nález hodnocen v průběhu experimentu endoskopicky [17]. Mezi následující hodnocené parametry bývají nejčastěji voleny mechanické zkoušky (trhová zkouška, tlaková zkouška) [19−21] a histologická hodnocení. Pro některá komplexní histologická měření však může být předchozí aplikace mechanických zkoušek limitující, a je tedy otázkou, který ze zmíněných parametrů je pro danou studii cennější. Mezi základní histologická hodnocení bývají zahrnuta měření lokálních podílů kolagenu, úroveň zánětlivé infiltrace tkáně, vaskularizace, případně další parametry specifické pro danou studii.

• Vybrané modely z literatury

Následují příklady několika vybraných typů modelů popisující jejich základní aspekty, přednosti a možnosti aplikace.

• Model technicky insuficientní sutury anastomózy tračníku myši

Pommergaard a kol. [22] vybrali pro své studie (jako tým, který se dlouhodobě problematice věnuje) model využívající insuficientní suturu end-to-end anastomózy tračníku myši. Konstrukce spojky byla prováděna jednotlivými stehy a při snížení hustoty sutury na 4 jednotlivé stehy na spojku došlo v poměrně velké experimentální skupině k rozvoji klinicky manifestovaného leaku s fekální peritonitidou u 40 % zvířat [22]. Model najde dobré uplatnění při aplikacích fortifikujících materiálů, jako jsou tkáňová lepidla a patche, kde může věrně hodnotit mechanickou podporu materiálu a vliv jeho aplikace na rozvoj leaku. Nevýhodou zůstává nutné užití většího počtu zvířat, diametrálně odlišná mechanika od humánní anatomie a zároveň vysoká závažnost experimentu, vezmeme-li v potaz, že 40 % zvířat musí být časně pooperačně usmrceno pro závažnou komplikaci. Ve studii bylo operováno 110 zvířat [22].

• Model technicky insuficientní anastomózy prasete

Kolektiv českých autorů (Kalvach, et al.) připravil pro potřeby hodnocení efektu endoskopických intervencí pro insuficienci kolorektální anastomózy jednoduchý model na praseti. Ve studii o 42 zvířatech byla provedena staplerová anastomóza na tračníku s defektem vytvořeným znehodnocenou nábojnicí stapleru. U zvířat byl druhý pooperační den proveden transanální výkon ve smyslu sutury defektu různými technikami. Kontrolní skupina byla ponechána bez dalšího zákroku, zde se rozvinuly klinické známky anastomotické komplikace u 12 ze 14 zvířat. Model tedy vytvořil leak u většiny zvířat a hodnotíme jej jako vhodný pro posouzení možností nových transanálních technik léčby leaku [23]. Jedná se o insuficienci zdravé tkáně, která je čistě mechanická a perioperačně vytvořená. Tato je v klinickém prostředí preventována perioperační vzduchovou zkouškou. Endoskopické metody jsou tak v praxi aplikovány u dehiscence, která má podklad spíše již v poruše hojení, a tak výsledky a samotné provedení těchto zákroků mají jiná úskalí.

• Model insuficience anastomózy tračníku potkana indukovaný předoperační radioterapií

Turecká výzkumná skupina pod vedením Tasdovena [24] se ve své práci rozhodla využít jiný rizikový faktor dehiscence anastomózy, a totiž předoperační radioterapii. Vzhledem k malým rozměrům modelu (potkan) byla aplikována celotělová radioterapie v dávce 6 Gy. Následně byla konstruována anastomóza na tračníku bez technických chyb. V modelu nebyl cílem vznik manifestace anastomotického leaku, ale pečlivá histologická, biochemická a mechanická analýza hojení. Pro sledování dynamiky jednotlivých aspektů hojení spojky bylo využito několik časových intervalů přežití. V modelu se nevyskytovaly závažné komplikace nutící k předčasnému ukončení života zvířat [24]. Výhodou tohoto modelu je dle našeho názoru radioterapie jako klinicky relevantní podklad poruchy hojení. V malém modelu však nebylo možné simulovat podmínky lokálně ozářeného pacienta. Široká paleta hodnocení včetně dynamiky změn pak přináší vysokou výtěžnost experimentu a využitelnost při aplikaci nových technik sutury či podpůrných materiálů a hodnocení jejich vlivu na podporu hojení rizikové anastomózy. To vše je však za cenu vyšších počtů zvířat vzhledem k potřebě mnoha skupin s různým časem odběru vzorků a různým metodám zpracování (buď histologické, či mechanické testy). Ve studii bylo použito 48 zvířat [24].

• Model ischemizované anastomózy tračníku potkana

Limitovaná ischemie je další možností konstrukce rizikové anastomózy. Míra ischemizace je přitom kritická pro manifestaci leaku u dostatečného množství zvířat. V modelu Fontoura-Andrade [25] byl využit opět jako modelový organismus potkan, u něhož byla konstruována anastomóza na tračníku. Střevo bylo v rozsahu 2 cm orálně a aborálně od spojky zbaveno cévního zásobení. K rozvoji anastomotického leaku došlo i při takovémto postižení u 25 % zvířat. Hodnocení pak probíhala zvykle histologicky a mechanicky jako u výše zmíněných prací v různých časových bodech [25]. Jako výhodu opět hodnotíme klinicky relevantní podklad pro rozvoj leaku s dobře nastavenou mírou jeho výskytu, tím pádem možnost sledování ovlivnění hojení jak celkově podávanou, tak lokální léčbou.

• Model histologicky defektní anastomózy colon descendens prasete Lékařské fakulty v Plzni

Pro účely výzkumu na Lékařské fakultě v Plzni byl vyvinut model na praseti domácím. Vysoká schopnost zdravých zvířat zahojit nekomplikovaně operační rány včetně anastomózy na zažívacím traktu bez projevu komplikací vedla k tvorbě modelu zaměřeného na rozdíly v kvalitě hojení zejména histologickými metodami. Proto byl experiment navržen tak, aby jak konfigurace anastomózy, tak použité materiály a doba sledování co nejlépe vyhovovaly níže popisovaným měřením. Jako konkrétní druh bylo použito přeštické černostrakaté prase. Po konzultaci statistika vzhledem ke škálám předpokládaných výstupních výsledků byla zvolena v našich pracích využívajících tento model velikost jednotlivých skupin o 8 zvířatech [6−8].

V den chirurgické operace nebyla zvířata krmena, střevní příprava nebyla aplikována. V celkové anestezii bylo provedeno nejprve kontrastní CT vyšetření břicha, hrudníku. Kromě srovnání s pooperačními vyšetřeními CT umožňuje i vyřazení nemocných zvířat ještě před experimentem. Následně byl za antibiotické profylaxe (amoxicilin klavikulonát) implantován centrální žilní port katétr zavedený do jugulární žíly pro snadnou manipulaci se zvířetem během sledování, eliminaci stresu při pooperačních vyšetřeních. Následně byla zvířatům provedena incize v levém kaudálním kvadrantu břišní stěny, z níž byl dokončen přístup do dutiny břišní formou pararektálního řezu (Obr. 1, Obr. 2, Obr. 3). Incizí byl luxován sestupný tračník prasete, byla provedena jeho transsekce ve vzdálenosti 20 cm od anu [6−8].

Poté byla zkonstruována end-to-end anastomóza pomocí standardního seromuskulárního pokračujícího stehu s tvorbou technické chyby v antimezokolické lokalizaci. V rozsahu dvou stehů byla sutura provedena nikoliv seromuskulárně, ale transmurálně o délce kroku 0,5 cm. Tento krok měl za následek vznik sice stále těsnící spojky, ale vytvořil v daném místě výraznou prominenci sliznice u obou konců střevní trubice (Obr. 4), a tudíž prostor pro suboptimální hojení [6−8].

Zvířata byla následně sledována klinicky, laboratorně a pravidelnými CT kontrolami [6−8]. V provedených experimentech byla nulová pooperační letalita, morbidita byla omezena na nečetné komplikace stupňů II−III dle Clavien-Dindo klasifikace. Při odběru vzorků po 21 dnech byly v břišní dutině hodnoceny makroskopické známky anastomotického leaku. Současně byl zjištěn rozsah a umístění peritoneálních adhezí kvantitativně i kvalitativně, k čemuž byl navržen systém hodnocení Perianastomotic Adhesion Amount Score (PAAS) [6−8]. Střevní vzorky byly standardně histologicky zpracovány. Pro hodnocení integrity střevní stěny v místě anastomotického defektu byl navržen semikvantitativní skórovací systém (skóre integrity anastomózy, Intestinal Wall Integrity Score − IWIS) [7]. Další histologické parametry hojení byly hodnoceny stereologickými metodami [6−8].

Model poskytl u všech operovaných zvířat v místě defektu histologicky potvrzenou sníženou integritu střevní stěny oproti zbytku sutury, a je tak z našeho pohledu vhodný zejména pro aplikovaný výzkum lokální materiálové podpory hojení. Nedokonalá adaptace vrstev střevní stěny je tak reálným a zde zdokumentovaným podkladem poruchy hojení. Rozvoj samotného leaku však v modelu klinicky pozorován není, což může být považováno za jeho slabinu v závislosti na jeho využití.

ZÁVĚR

Zvířecí model je nutno připravit na míru zkoumané problematice a současným vysokým etickým nárokům pro práci se zvířaty. Zároveň je nutno dodržet vysokou úroveň experimentální práce s důrazem na čitelnost výsledků a jejich jednoznačnou interpretovatelnost s využitím jak metod speciálních, tak metod, které jsou pro danou problematiku v současné literatuře standardem. Všechny citované práce tyto požadavky splňují a jsou důkazem, že každá zkoumaná problematika potřebuje odlišný pohled a vlastní strategii pro design modelu.

V současné době jsou nutné zejména nové modely pro potřeby základního výzkumu patofyziologie hojení na zažívacím traktu, které by přinesly nové poznatky z této problematiky. Bez nich bude cílená prevence a léčba anastomotických komplikací vždy obtížná a nespolehlivá.

Poděkování

Projekt je podpořen grantem Agentury pro zdravotnický výzkum Ministerstva zdravotnictví České republiky č. NU20J-08-00009, Prevence střevního anastomotického leaku a pooperačních adhezí pomocí nanovlákenných biodegradabilních materiálů.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise, s výjimkou kongresových abstrakt a doporučených postupů.

MUDr. Jáchym Rosendorf, Ph.D.

Chirurgická klinika FN Plzeň Lochotín

Alej Svobody 80

304 60 Plzeň

e-mail: jachymrosendorf@gmail.com