3,5-Dimethoxyfenol – marker intoxikace tisem červeným

Souhrn

Při smrtelné intoxikaci tisem není pitevní nález charakteristický. Na intoxikaci může upozornit přítomnost rostlinných zbytků v trávicím traktu. Při požití odvaru z tisu však v trávicím traktu rostlinné zbytky nalezeny nejsou. V tomto případě může na intoxikaci tisem upozornit nález 3,5-dimethoxyfenolu v sekčním materiálu. Autoři tohoto článku popisují průkaz a stanovení 3,5-dimethoxyfenolu u dvou případů sebevražedné intoxikace tisem. U obou případů byla použita extrakce kapalina/kapalina a extrakce na pevné fázi. Byly analyzovány extrakty získané z kyselého a bazického prostředí. Extrakty z kyselého prostředí byly methylovány, z bazického prostředí acetylovány. Analýza byla provedena metodou GC/MS. V krvi dvou smrtelně intoxikovaných osob byla stanovena hladina 3,5-dimethoxyfenolu 82 ng/ml resp. 417 ng/ml. Přítomnost 3,5-dimethoxyfenolu byla dále prokázána v žaludečním obsahu a v moči.

Klíčová slova:
3,5-dimethoxyfenol – tis červený – intoxikace – GC/MS

Úvod

Tis červený (Taxus baccata), dříve hojný strom v přírodě, je dnes k vidění hlavně v parcích a zahradách. Strom opředený pověstmi a černou magií byl dříve užíván při přípravě čarodějných lektvarů. V Macbethovi potřebovala čarodějnice při přípravě lektvaru kromě jiných ingrediencí i „játra žida rouhače, kozí žluč a tisu prut, při měsíci uříznut“. Známé byly ale i léčebné vlastnosti tisu. Avicenna se ve své práci Medicamenta Cordialia zmiňuje o zklidňujícím působení tisu na srdce. Devět století poté popisuje Tekol efekty pseudoalkaloidu taxinu na srdeční sval a prokazuje, že taxin je blokátorem kalciového kanálu (8, 9). A právě taxinu obsaženému v tisu  je připisován hlavní toxický účinek této rostliny.

Při smrtelné intoxikaci tisem není pitevní nález charakteristický. Na intoxikaci může upozornit přítomnost rostlinných zbytků v trávicím traktu. Rostlinné zbytky jsou makroskopicky i mikroskopicky určeny a toxikologické vyšetření sekčního materiálu je již cíleno na průkaz látek, které se v tisu vyskytují. Pro tento typ analýzy bývá užívána tenkovrstevná chromatografie (TLC) (3, 7, 10) a dále zlatý standard pro průkaz této intoxikace – kapalinová chromatografie s hmotnostním detektorem (LC/MS) (1, 2). V případě použití TLC bývá porovnáván extrakt z jehličí tisu s extraktem ze sekčního materiálu a průkaz intoxikace je založen na nálezu látek shodné povahy v obou extraktech. Při použití metody LC/MS je průkaz intoxikace tisem založen na nálezu a případně kvantifikaci taxinu v sekčním materiálu.

Při požití odvaru z tisu však v trávicím traktu rostlinné zbytky nalezeny nejsou. V tomto případě může na intoxikaci tisem upozornit nález 3,5-dimethoxyfenolu (DMF). Tento fenol se v tisu vyskytuje jak ve volné formě, tak ve formě glykosidu taxicatinu, který je typickou součástí jehličí tisu. DMF lze v sekčním materiálu nalézt při hledání toxikologicky významné neznámé látky. V literatuře je popsán průkaz 3,5-dimethoxyfenolu v biologickém materiálu metodou extrakce kapalina/kapalina s následnou analýzou extraktu metodou plynové chromatografie s hmotnostním detektorem (GC/MS) (4) nebo kapalinové chromatografie s UV detektorem (HPLC/UV) (6).

Autoři tohoto článku popisují průkaz a stanovení DMF u dvou případů sebevražedné intoxikace tisem. U obou případů byla použita extrakce kapalina/kapalina (L/L) a extrakce na pevnou fázi (SPE). Extrakty byly analyzovány metodou GC/MS.

Materiál a metodika

Popis prvního případu smrtelné intoxikace tisem

Osmadvacetiletý muž byl nalezen mrtvý ve sklepě rodinného domku. Soudně lékařskou pitvou těla zemřelého bylo zjištěno: akutní katarální zánět jícnu s odlupováním epitelu (později bylo zjištěno, že zemřelý požil odvar tisu s příměsí louhu), akutní povrchový zánět žaludku, drť rostlinného materiálu v žaludku a dvanáctníku (v suchém stavu 3,6 g), krevní výronky v měkkých pokrývkách lebních, pod poplicnicí a přísrdečníkem, otok mozku, hemoragický otok plic místy s krvácením do alveolů, překrvení parenchymatózních orgánů, tekutý stav krve.

K toxikologickému rozboru byla dodána krev, moč, část tkáně mozkové a plicní, část jaterní a ledvinné tkáně a žaludeční obsah spolu s obsahem dvanáctníku. V krvi a moči byla prokázána přítomnost 3,5-dimethoxyfenolu a 11-nor-Δ⁹-tetrahydrokanabinol-karboxylové kyseliny. Přítomnost 3,5-dimethoxyfenolu byla dále prokázána v žaludečním a dvanáctníkovém obsahu. V žaludečním obsahu a v moči byla metodou TLC prokázána přítomnost látek shodné povahy s látkami obsaženými v tisu. Přítomnost další toxikologicky významné látky nebyla v dodaném sekčním materiálu prokázána (alkohol, toxické těkavé látky, OPL nebo léky).

Morfologickým a anatomickým hodnocením drtě rostlinného materiálu nalezené v žaludečním a dvanáctníkovém obsahu zemřelého bylo zjištěno, že jde o jehličí a drobné větévky dřeviny tisu červeného (hodnocení provedeno RNDr. Dagmar Novou).

Popis druhého případu smrtelné intoxikace tisem

Dvaadvacetiletý muž byl nalezen mrtvý v areálu psychiatrické léčebny.

Soudně lékařskou pitvou těla zemřelého bylo zjištěno: tělo bez zevních úrazových změn, tmavě červenofialové posmrtné skvrny, mydriáza, překrvení spojivek. Vnitřní prohlídkou byly zjištěny obecné známky dušení, dilatace pravé komory, přítomnost velkého množství zelených jehliček v žaludku, méně v tenkém střevě – makroskopicky podezření na rostlinu tis. Histologickým vyšetřením myokardu zjištěn edém intersticia a ojediněle zvýšená eosinofilie myocytů.

Metodou LC/MS byla v krvi a žaludečním obsahu prokázána přítomnost taxinu B, isotaxinu B a dalších obsahových látek tisu (analýza provedena RNDr. M. Staňkovou, Ph.D.). Metodou GC/MS byla v krvi a žaludečním obsahu prokázána přítomnost 3,5-dimethoxyfenolu. Přítomnost jiné toxikologicky významné látky nebyla v dodaném sekčním materiálu prokázána (alkohol, OPL nebo léky).

Extrakce sekčního materiálu metodou L/L

Vzorky biologického materiálu (moč, žaludeční obsah, vzorek jaterní a ledvinné tkáně) byly zpracovány běžným postupem užívaným pro analýzu metodou TLC (extrakce z kyselého a bazického prostředí do diethyletheru, včetně extrakce močového hydrolyzátu – kyselá hydrolýza).

Extrakce krve a moče metodou SPE

Krev a moč (2 ml) byly extrahovány metodou SPE (Bond Elut Certify) dle návodu výrobce pro extrakci neznámé látky (úprava vzorku 0,1 M fosfátovým pufrem pH 6, proplach kolonky metanolem a fosfátovým pufrem, nadávkování vzorku, proplach kolonky vodou, 0,01 M roztokem kyseliny octové, vysušení kolonky a frakční eluce nejprve kyselých a neutrálních látek směsí aceton:chloroform = 1 : 1 a dále bazických látek směsí octan ethylnatý: koncentrovaný vodný roztok amoniaku = 98 : 2). Získané extrakty byly odpařeny do sucha při pokojové teplotě pod proudem dusíku.

Derivatizace extraktu získaného z kyselého prostředí

K odparku byl přidán tetramethylamonium hydroxid (7 mg) a dimethylsulfoxid (150 ml). Po promíchání byla směs 2 minuty ponechána v klidu a poté k ní byl přidán methyljodid (10 ml). Směs byla opět promíchána a ponechána dvě minuty v klidu. Ke směsi byl přidán 0,1 N roztok kyseliny chlorovodíkové a po promíchání byla reakční směs extrahována směsí hexan: octan ethylnatý = 75 : 25. Organická vrstva byla oddělena a odpařena. Odparek byl rekonstituován 50 μl octanu ethylnatého a 1 μl roztoku byl nadávkován do GC/MS systému.

Derivatizace extraktu získaného z bazického prostředí

K odparku byl přidán pyridin a anhydrid kyseliny octové. Směs byla zahřívána na 80 ^oC po dobu dvaceti minut a odpařena do sucha pod proudem dusíku. Odparek byl rekonstituován 50 μl octanu ethylnatého a 1 μl roztoku byl nadávkován do GC/MS systému.

Kalibrace

Kalibrátory byly extrahovány metodou SPE stejným způsobem jako vzorky. Bylo použito pět kalibračních bodů o koncentraci 0, 100, 250, 500 a 750 ng/ml 3,5-dimethoxyfenolu v séru. Jako vnitřní standard byl použit propofol o koncentraci 500 ng/ml. Kalibrační křivka byla lineární v celém rozsahu použitých koncentrací. Limit detekce LOD = 50 ng/ml.

GC/MS analýza

Přístroj Thermo Trace DSQ, kolona HP-5MS-UI, 15 m/0,25 mm/0,25 mm, splitless 30 s, teplota nástřikového prostoru 220 ^oC, chromatografická pec: počáteční teplota 70 ^oC, konečná 300 ^oC, teplota převodníku 250 ^oC, sledované ionty m/z 40–530.

Výsledky

V extraktu močového hydrolyzátu (kyselá hydrolýza) nebyl 3,5-dimethoxyfenol prokázán. V tabulce 1 jsou uvedeny výsledky získané analýzou extraktů z kyselého a bazického prostředí.

Diskuse

Intoxikace tisem není běžný, ale ani raritní způsob otravy. Pokud z anamnestických nebo pitevních údajů není zřejmé, že se jedná o intoxikaci tisem, toxikolog hledá neznámou látku. Problém u průkazu intoxikace tisem je především v tom, že účinné látky (pseudoalkaloid taxin B a isotaxin B) nejsou běžně dostupné, a proto je toxikologická laboratoř s největší pravděpodobností nemá „na skladě“. Navíc tyto látky nelze analyzovat metodou GC/MS pro jejich polaritu a nemožnost převést je bez rozkladu do plynného skupenství. Z tohoto důvodu nejsou v elektronických knihovnách uvedena jejich CG/MS spektra. Při standardním toxikologickém vyšetření metodou GC/MS je ale možné v extraktu biologického materiálu prokázat přítomnost doprovodných látek, které se spolu s taxiny vyskytují v tisu. V literatuře popsaný 3,5-dimethoxyfenol je možné zachytit, aniž bychom museli použít cílenou nebo jinak speciální metodu analýzy. Jeho přítomnost lze v biologickém materiálu prokázat běžnými analytickými postupy používanými v toxikologické laboratoři (extrakce kapalina/kapalina, extrakce na pevné fázi, analýza metodou GC/MS nebo HPLC/UV). Disociační konstanta pKa 3,5-dimethoxyfenolu je rovna 9.34. Je výhodnější extrahovat tuto látku z kyselého nebo neutrálního prostředí. V případě vysoké koncentrace (žaludeční obsah) přechází i do extraktu bazického.

Při analýze extraktů metodou GC/MS (obr. 1) je přítomnost aktivního vodíku v molekule fenolu mírnou překážkou pro zdárný průběh chromatografického procesu. DMF lze snadno derivatizovat výše popsanými způsoby a tím nepříznivé působení aktivního vodíku odstranit. V případě masivního výskytu DMF (např. žaludeční obsah) nebude problém detekovat tento fenol i bez derivatizace.

Hmotnostní spektrum DMF (obr. 2) je v knihovně NIST vedeno pod názvem Phloroglucinol dimethyl ether. Dále je v této knihovně spektrum methylovaného derivátu DMF vedené pod názvem Phloroglucinol trimethyl ether. V toxikologické knihovně PMW (2. vydání) je uvedeno spektrum methylovaného DMF pod názvem Phloroglucinol 3ME a acetylovaného DMF pod názvem Phloroglucinol 2MEAC.

Nález DMF v sekčním materiálu však nelze považovat za důkaz intoxikace tisem. DMF lze nalézt i v jiných rostlinách, např. v čínské růži Rosa chinensis, routě vonné Ruta graveolens nebo v hroznovém vínu (5). Nález DMF je však silná nápověda, kterým směrem se v dalším pátrání vydat.

Kontakt:
Ing. Jan Stříbrný, Vojenský ústav soudního lékařství ÚVN
U vojenské nemocnice 1200
169 02 Praha 6
tel.: 973 203 518
jan.stribrny@uvn.cz