Glykace proteinů oční čočky u diabetiků a její neinvazivní měření – první zkušenosti v České republice

Súhrn

Konečné produkty pokročilé glykace (AGEs) hrají významnou roli v patogenezi diabetu i diabetických komplikací. Jejich hromadění v oční čočce odráží celkový stav glykace v organizmu. Nedávno byl na trh uveden nový konfokální biomikroskop ClearPath DS-120, který umožňuje rychlé a neinvazivní stanovení AGEs v oční čočce na základě autofluorescence (LAF) některých AGEs. V naší pilotní studii jsme vyšetřili LAF u 69 diabetiků a 49 zdravých kontrol a srovnali se současně měřenou kožní autofluorescencí (SAF) na předloktí pomocí AGE-Readeru. Bylo pozorováno významné zvýšení LAF (DM1T: 0,27 ± 0,09; DM2T: 0,22 ± 0,06; kontroly: 0,17 ± 0,04 AU; p < 0,0001) i SAF (DM1T: 2,0 ± 0,4; DM2T: 2,3 ± 0,6; kontroly: 1,8 ± 0,3 AU; p < 0,0001) u pacientů s diabetem oproti zdravým kontrolám. Ve všech skupinách byl popsán významný vztah mezi LAF a SAF (DM1T: r = 0,53; p < 0,005; DM2T: r = 0,37; p < 0,05; kontroly: r = 0,30; p < 0,05). Naopak závislost LAF ani SAF na HbA_1c nebyla přesvědčivá, což asi souvisí s tím, že hodnota glykovaného hemoglobinu dostatečně neodráží mnohaletý stav glykace v organizmu. Stanovení oční autofluorescence možná přináší robustní marker dlouhodobé kompenzace diabetu predikující riziko budoucích komplikací, avšak definitivní potvrzení takové hypotézy si vyžádá četnější a delší klinické studie.

Klíčová slova:
autofluorescence oční čočky – diabetes mellitus – glykace – hyperglykemie – konečné produkty pokročilé glykace – kožní autofluorescence

Úvod

Již více než 100 let známe spontánní neenzymatický děj mezi redukujícími sacharidy a proteiny nazývaný glykace. Tato reakce byla poprvé popsána Louis Camillem Maillardem, a nese tak dodnes jeho jméno [1]. Jedná se o reakci relativně pomalou, která však u všech živých organizmů dříve či později vede ke vzniku značně heterogenních molekul označovaných jako konečné produkty pokročilé glykace (advanced glycation endproducts – AGEs). Tuto reakci urychlují vyšší koncentrace glukózy či dalších sacharidů, dikarbonyly (metylglyoxal či glyoxal), ale v některých tkáních i vyšší koncentrace kyseliny askorbové [2].

AGEs vznikají a negativně se uplatňují během fyziologického stárnutí, Alzheimerově chorobě, erektilní dys­funkci, ateroskleróze, při zánětlivých onemocněních či renální dysfunkci [3]. Nejvíce se však se zvýšenou akumulací AGEs setkáváme u diabetu, u nějž jsou považovány za jeden z hlavních faktorů rozvoje cévních změn, a to jak změn mikroangiopatických, tak makroangiopatických. Uplatňují se zde 3 základní patofyziologické mechanizmy vlivu AGEs:

• akumulace AGEs v extracelulární matrix vedoucí k „zesíťování“ proteinů a snížené cévní elasticitě
• glykace intracelulárních proteinů měnící jejich funkci, a v neposlední řadě
• vazba AGEs na membránové receptory aktivující intracelulární kaskády modulující mj. genovou expresi [3].

Neméně významná je účast AGEs v samotné patogenezi diabetu. V posledních letech přibývá důkazů o tom, že konečné produkty glykace se podstatnou měrou podílejí na rozvoji inzulinové rezistence. Bylo popsáno několik mechanizmů a o celé řadě dalších se spekuluje. Glykace inzulinu kupříkladu vede k jeho nižší účinnosti v cílových tkáních [4]. Rovněž bylo prokázáno, že vyšší koncentrace metylglyoxalu (prekurzoru AGEs) modifikují AMP kinázu, a tím zvyšují inzulinovou rezistenci v játrech [5].

Je tedy pochopitelné, že vliv AGEs v rozvoji diabetu i diabetických komplikací je komplexní a zasahuje více či méně všechny orgánové soustavy a nevyhýbá se ani oční čočce.

Glykace a autofluorescence oční čočky

Oční čočka je orgán zajišťující lom světelných paprsků na sítnici. K úplné funkci musí být čočka elastická a plně transparentní, což zajišťují komplikovaně organizované proteiny. Největší část proteinů čočky tvoří krystaliny, které jsou pomalu syntetizovány na periferii čočky a se stárnutím se přesouvají do jejího centra, v němž tvoří jádro. Tam se také vyskytují pravděpodobně nejdéle „žijící“ proteiny lidského těla. Na rozdíl od okolních struktur obsahuje čočka mladého jedince nižší koncentraci kyslíku i glukózy [6,7]. V průběhu let však podléhá změnám, při kterých dochází ke kolorizaci a hromadění AGEs. První popsanou molekulou ze skupiny AGEs byl v roce 1986 karboxymetyllysin [8], postupně následovaly fluorescenční pentosidin či pyrralin [9]. Do dnešního dne je známo více než 15 různých molekul AGEs, z nichž většina se vyskytuje právě v oční čočce. Zatímco některé AGEs mají spíše souvislost s rozvojem stařecké katarakty, jiné AGEs se výrazně uplatňují v rozvoji diabetických změn [10]. Do druhé skupiny patří i v posledních letech hojně studovaný glukosepan, významný marker diabetické mikroangiopatie [11].

Již bylo uváděno, mnohé AGEs mají fluorescenční vlastnosti, jež lze využít k jejich neinvazivnímu stanovování. Samotná autofluorescence čočky byla známa již v 1. polovině minulého století [12,13], ale až koncem 20. století bylo doloženo, že autofluorescence čočky (LAF) stoupá s věkem a je výrazně vyšší u diabetiků [14]. Zároveň autofluorescence úzce koreluje s celkovým množstvím všech stanovovaných AGEs v čočce [15]. Na našem pracovišti jsme v minulých letech vyšetřili u mnoha diabetiků 1. i 2. typu kožní autofluorescenci (SAF) [16], ale jednoduché měření autofluorescence oční čočky bylo dlouho nedostupné. Teprve nedávno byl vyvinut přístroj neinvazivně stanovující LAF.

Cílem této pilotní studie bylo porovnat oční a kožní autofluorescenci u diabetiků 1. a 2. typu a výsledky srovnat se zdravými kontrolami.

Soubor vyšetřených a metody

Měření autofluorescence oční čočky (LAF) a kůže (SAF) u diabetiků i zdravých kontrol probíhalo na III. interní klinice 1. LF UK a VFN Praha na podzim roku 2014. Celkem bylo vyšetřeno 69 diabetiků (32 s diabetem 1. typu – DM1T, 37 s diabetem 2. typu – DM2T; průměrný věk 53 ± 12 let) a 49 zdravých kontrol (průměrný věk 43 ± 12 let). Podrobnější charakteristiku souboru uvádí tab. Studie byla v souladu s Helsinskou deklarací a byla schválena Etickou komisí Všeobecné fakultní nemocnice Praha.

K měření LAF byl poprvé v České republice využit biomikroskop ClearPath DS-120 (Freedom Meditech, San Diego, US), který neinvazivně stanovuje autofluorescenci levé oční čočky. Během několika vteřin přístroj osvítí čočku modrým světlem a měří fluorescenční zelené světlo a zároveň rozptýlené modré světlo. Softwarově je pak vypočten poměr autofluorescence čočky k rozptýlenému světlu v centrální části oční čočky, který nás informuje o množství akumulovaných konečných produktů glykace AGEs. Čím vyšší tento poměr je, tím je obsah AGEs v čočce vyšší [17]. Přináší tak novou informaci o dlouhodobé glykační zátěži konkrétního jedince. Kožní autofluorescence (SAF) byla měřena na předloktí pomocí AGE-Readeru (DiagnOptics BV, Groningen, Nizozemí) dle originálních doporučení [18] a je uváděna v arbitrárních jednotkách (AU).

Výsledky LAF a SAF vyšetřených osob byly srovnány s jejich věkem, antropometrickými údaji, glykovaným hemoglobinem (HbA_1c) a albuminurií, vyjádřenou pomocí poměru močového albuminu/kreatininu (ACR). Za pozitivní mikroalbuminurii byl považován ACR > 3 g/mol. Vzhledem k logaritmickému rozložení ACR byla data logaritmována. Stav kompenzace diabetu byl vyjádřen jednak glykovaným hemoglobinem v době měření (HbA_1c), a dále průměrnou hodnotou glykovaného hemoglobinu v posledním roce (HbA_1c prům).

Výsledky biochemických parametrů jsou vyjádřeny jako průměr a směrodatná odchylka (SD), popř. průměr a rozpětí u logaritmických dat. Rozdíly mezi skupinami byly vyhodnoceny jednocestnou variační analýzou (ANOVA) s post hoc testy. Korelace byly stanoveny pomocí Pearsonova koeficientu. Statistická analýza byla provedena v programu Statistica 12 (StatSoft).

Výsledky

Autofluorescence oční čočky (LAF) byla významně vyšší u pacientů s diabetem 1. i 2. typu oproti kontrolám (0,27 ± 0,09; 0,22 ± 0,06; 0,17 ± 0,04; p < 0,0001). Analogické výsledky byly pozorovány u SAF (2,0 ± 0,4; 2,3 ± 0,6; 1,8 ± 0,3 AU; p < 0,0001). V jednotlivých případech jsme identifikovali několik osob bez diabetu se zvýšenou autofluorescencí čočky. Naproti tomu se vyskytlo několik případů recentně zachycených diabetiků 1. typu, u kterých byla autofluorescence nízká. Glykovaný hemoglobin v době měření byl vyšší u DM1T oproti DM2T a kontrolám (69 ± 14; 60 ± 20; 33 ± 3 mmol/mol; p < 0,0001) a velice srovnatelné výsledky byly i u průměrného HbA_1c v posledním roce.

Ve všech skupinách byla pozorována závislost auto­fluorescence na věku (LAF: r = 0,31, p < 0,001; SAF: r = 0,61, p < 0,0001). Naopak souvislost s HbA_1c se projevila jen u DM2T jak v případě LAF (DM1T: r = 0,10, ns; DM2T: r = 0,46, p < 0,01; kontroly: r = 0,28, ns, obr. 1, tak v případě SAF (DM1T: r = 0,32, ns; DM2T: r = 0,62, p < 0,0001; kontroly: r = 0,22, ns). Podobné byly závislosti i s průměrným HbA_1c v posledním roce. Ve všech skupinách byl pozorován významný vztah mezi LAF a SAF (DM1T: r = 0,53, p < 0,005, DM2T: r = 0,37, p < 0,05; kontroly: r = 0,30, p < 0,05) (obr. 2). LAF se významně nelišila u pacientů bez či s pozitivní (mikro)albuminurií.

Diskuse

Autofluorescence oční čočky stanovená biomikroskopem ClearPath DS-120 přináší snadno dostupný parametr reflektující dlouhodobou zátěž organizmu glykačními mechanizmy. Tím hlavním faktorem zvyšujícím LAF je nepochybně chronická porucha glukózového metabolizmu s opakovanou hyperglykemií. Lze tedy předpokládat, že se takové déletrvající latentní onemocnění odrazí v celkové LAF a upozorní na možné riziko diabetu dříve, než dojde ke klinickým projevům hyperglykemie. Na druhou stranu je ale nutné zdůraznit, že rychle rozvinutý diabetes v mladším věku se nemusí vyšší LAF ještě projevit. Definitivní diagnóza diabetu je tak stále založena pouze na laboratorně stanovené hyperglykemii nalačno, během orálního glukózového tolerančního testu či náhodné hyperglykemii s klinickými příznaky.

V naší pilotní studii byla závislost LAF na aktuální hladině HbA_1c i průměrném HbA_1c v posledním roce jen částečná. Je pravděpodobné, že aktuální i průměrný glykovaný hemoglobin v posledním roce dostatečně neodrážejí mnohaletý stav glykace v organizmu, a tudíž s autofluorescencí čočky souvisí jen parciálně. Navíc naměřená LAF podává informaci o množství fluorescenčních molekul, zatímco některé AGEs fluorescenční vlastnosti nemají, a tudíž o jejich hromadění přesnou představu nemáme. V minulosti však bylo prokázáno, že mezi fluorescenčními a nefluorescenčními molekulami je silná pozitivní závislost [19]. V naší relativně malé studii jsme nepozorovali významnější rozdíly v LAF u pacientů bez či s pozitivní albuminurií. Je však možné, že v patogenezi diabetické nefropatie se uplatňují i nefluorescenční AGEs či další mechanizmy.

Námi prezentovaná významná závislost mezi autofluorescencí čočky a kůže u pacientů s diabetem 2. typu doposud nebyla publikována, zatímco u pacientů s diabetem 1. typu již byl podobný vztah doložen [20]. Obě práce dokládají, že glykační proces srovnatelně postihuje různé tkáně organizmu.

Je jistě lákavá představa, že se oční autofluorescence stane robustním ukazatelem dlouhodobé kompenzace diabetu predikujícím riziko dalších komplikací, avšak na definitivní potvrzení takové hypotézy si budeme muset ještě počkat.

MUDr. Jan Škrha jr

jan.skrha@seznam.cz

III. interní klinika 1. LF UK a VFN, Praha

www.int3.lf1.cuni.cz

Doručeno do redakce 15. 2. 2015

Přijato po recenzi 13. 3. 2015