Poškození lymfocytární DNA během anestezie: pilotní studie srovnávající celkovou a subarachnoideální anestezii

Súhrn

Cíl studie: Poškození DNA vlivem celkové anestezie (CA) je popsáno použitím různých metod. Publikace porovnávající vliv rozdílných anesteziologických technik nebyly v dostupné odborné literatuře nalezeny. Primárním cílem práce bylo ověřit proveditelnost metody. Sekundárním cílem bylo vyvrátit hypotézu, že neuraxiální anestezie (SAB) poškozuje DNA stejně jako CA v pilotní studii.

Typ studie: Prospektivní nerandomizovaná monocentrická observační pilotní studie.

Typ pracoviště: Fakultní nemocnice.

Materiál a metoda: Pacienti (n = 34) podstupující ortopedicko-traumatologický výkon na dolní končetině byli rozděleni do dvou skupin: skupina CA a skupina SAB. U všech zařazených pacientů byl po podepsání informovaného souhlasu proveden odběr krve před operací a do 24 hodin po operaci. Poškození lymfocytární DNA bylo vyšetřeno metodou comet assay, která umí kvantitativně detekovat poškození nukleární DNA. Pomocí specifických enzymů lze stanovit poškození DNA způsobené oxidací bází. Výsledky comet assay byly dále hodnoceny semiautomaticky programem Lucia (Laboratory Imaging, CZ) ve fluorescenční mikroskopii, která umožňuje kvantifikaci oxidovaných bází DNA a zlomů jednošroubovicové DNA. Pro porovnání výsledků v obou skupinách byl použit Wilcoxonův test na hladině statistické významnosti pro p = 0,05.

Výsledky: Skupinu CA tvořilo 19 pacientů, skupinu SAB 15 pacientů. Ve skupině CA bylo nalezeno statisticky významně vyšší poškození DNA ve srovnání s předoperačními hodnotami, u pacientů skupiny SAB byly zaznamenány statisticky nevýznamné rozdíly v poškození DNA před a po operaci.

Závěr: Metoda comet assay se ukázala jako použitelná pro kvantifikaci změn DNA u pacientů po chirurgickém výkonu v anestezii. Výsledky poukazují na možný vztah mezi anesteziologickou technikou a změnami DNA asociovanými s operačním traumatem a/nebo anestezií. Zvolená metoda přináší reprodukovatelné výsledky s potenciálem jejího využití ve výzkumu vlivu anestezie na změny DNA a otevírá cestu k testování protektivních konceptů směřujících k minimalizaci poškození DNA v důsledku anestezie a operačního traumatu.

Klíčová slova:

celková anestezie – neuraxiální anestezie – poškození DNA

ÚVOD

Změny ve struktuře molekuly DNA vlivem ane­stetik byly v literatuře opakovaně popsány různými metodami [1–4]. Existují tedy důkazy o tom, že ane­stetika mění naší genetickou informaci. Změny byly popsány jak u pacientů, tak u personálu operačních sálů čili i při výrazně nižší koncentraci anestetik a při absenci operačního traumatu [5, 6]. Anestetika jsou tímto potenciálně kancerogenní agens. Do jaké míry jsou moderní používaná anestetika kancerogenní, nevíme. Spojitost s pooperační poruchou kognitivních funkcí a možným rozvojem Alzheimerovy choroby můžeme spíše tušit než přímo prokázat [7, 8]. Kvantifikace míry změny, potažmo poškození DNA vlivem anestetik, bylo v literatuře popsáno především na in vitro modelech a v animálních studiích [1, 2, 9].

Vhodnou metodou, která dovede kvantifikovat míru poškození DNA v humánní medicíně, je comet assay (single cell gel electrophoresis) [10]. Metoda byla vyvinuta v různých modifikacích, např. kvantifikace zlomů jednošroubovicové DNA, dvoušroubovicové DNA, oxidovaných pyrimidinových a purinových bází a dovede kvantifikovat nízkou hladinu změn DNA v jednotlivých eukaryontních buňkách [11]. Metoda hodnotí změny DNA periferních lymfocytů (obr. 1), které je možné stanovit po zafixování buněk na agarózovém gelu, po odstranění cytoplazmatické membrány pomocí lyzačního roztoku, rozvolnění struktury v alkalickém prostředí a vystavění tohoto nukleoidu („holého jádra“) elektrickému poli. Vlivem napětí a pH prostředí (může se lišit podle typu použité metody) pak dochází k relaxaci smyček (domén) DNA a k jejich pohybu směrem ke kladné elektrodě (anodě). Díky tomu vzniká typický tvar komety [12]. Comet assay se osvědčila především při kvantifikaci poškození DNA u pacientů po chemoterapii a radioterapii [13, 14]. Anestetika, jakožto poškozující agens, byla touto metodou již testována, ale změny vlivem neuroaxiální anestezie popsány dosud nebyly.

Primárním cílem naší pilotní studie bylo zhodnotit použitelnost metody comet assay pro kvantifikaci změn DNA u pacientů po chirurgickém výkonu v anestezii. Sekundárním cílem bylo popsat míru poškození DNA u pacientů v celkové anestezii a v neuroaxiální blokádě podstupujících ortopedický nebo traumatologický výkon na pánvi nebo dolní končetině. Nulová hypotéza byla, že celková anestezie poškozuje DNA stejně jako neuroaxiální anestezie.

SOUBOR A METODA

PACIENTI A TYPY ANESTEZIE

Prospektivní, monocentrická, nerandomizovaná studie byla schválena etickou komisí (Fakultní nemocnice Hradec Králové, jednací číslo 201511 S14P). Všichni pacienti podepsali informovaný souhlas s účastí ve studii. Byla dodržována Helsinská deklarace práv a svobod. Sběr dat probíhal v období od června 2016 do března 2018. Zařazovací kritéria byla souhlas se studií a podepsání informovaného souhlasu, věk nad 18 let, traumatologický operační výkon na dolní končetině nebo pánvi trvající minimálně 90 minut v celkové anestezii nebo ortopedický výkon na dolní končetině nebo velkém kloubu trvající minimálně 90 minut v neuroaxiální anestezii. Vyřazovací kritéria byla akutní povaha výkonu, anamnéza onkologického onemocnění s chemoterapií nebo radioterapií v posledních 12 měsících, imunosupresivní terapie v posledních 12 měsících, aktivní kuřák (více než 1 cigareta/den), vyšetření CT v posledním týdnu před operací a nesouhlas se studií.

Skupina pacientů s celkovou anestezií (CA) podstoupila traumatologický výkon na dolní končetině nebo na pánvi (otevřená repozice, vnitřní fixace, tzv. ORIF) v celkové anestezii s nebo bez peroperační fluoroskopie. Pacientům byla podána premedikace 1,5 mg bromazepamu (Lexaurin, Kabu Pharma, Praha, Česká republika) per os. CA byla indukována propofolem (Propofol, Fresenius Kabi, Bad Homburg, Německo) v dávce 2 mg/kg, analgezie byla vedena sufentanilem (Sufentanil Torrex, Chiesi Pharmaceuticals, Vídeň, Rakousko) v úvodní dávce 10 mg a dále podle monitorace hodnoty SPI (Surgical Plethysmography Index). Pokud byla nutná svalová relaxace, bylo použito atrakurium (Tracrium, Aspen Pharma, Dublin, Irsko) v úvodní dávce 0,5 mg/kg a dále podle monitoringu hloubky svalové relaxace (monitor byl integrální součástí ane­steziologického přístroje Aisys) na hodnotu TOF 2 (train of four). CA byla po úvodu vedena inhalačně isofluranem (Forane, Abott Laboratories Ltd., Maidenhead Berkshire, Velká Británie) v nosné směsi kyslíku (FiO₂ 0,40) s oxidem dusným s minimální alveolární koncentrací 0,8–1,0. Pokud byla nutnost dekurarizace na konci výkonu, byl podán neostigmin (Syntostigmin, BB Pharma, Praha, Česká republika) v dávce 1,5 mg intravenózně a atropin (Atropin Biotika, BB Pharma, Praha, Česká repub-lika) v dávce 0,5 mg intravenózně. Pacientům byla zaznamenána demografická data a každých 5 minut v průběhu operace krevní tlak, pulz, saturace periferní krve kyslíkem, vydechovaná koncentrace oxidu uhličitého a tělesná teplota. Tekutinová terapie byla udržována balancovaným krystaloidním roztokem (Ringerfundin, BBraun, Melsungen, Německo) přes zavedený periferní žilní katétr (18 G, BBraun, Melsungen, Německo) v základním přívodu 100 ml/h a dále podle krevní ztráty a oběhové stability. Tělesná teplota byla udržována ve fyziologickém rozmezí mezi 36 a 37 °C vyhřívací podložkou (Astopad, Stihler electronic, Stuttgart, Německo) a fukarem (Warm Air, Polymed, Hradec Králové, Česká republika). Dýchací cesty byly zajištěny orotracheální intubací (SUMI, Sulejowek, Polsko) nebo laryngeální maskou (Teleflex, Dublin Road, Athlon, Westmeath, Irsko). Umělá plicní ventilace byla objemově řízená nebo tlakově řízená – objemově garantovaná na dechový objem 6 ml/kg s dechovou frekvencí 12–16 dechů/minutu (podle vydechované koncentrace oxidu uhličitého v rozmezí 35–45 mmHg) a s pozitivním tlakem na konci výdechu 4 cm H₂O. Byl použit anesteziologický přístroj Aisys (GE Healthcare, Praha, Česká republika).

Skupina pacientů v neuroaxiální anestezii (SAB) podstoupila ortopedický výkon – náhradu kolenního nebo kyčelního kloubu totální endoprotézou v subarachnoidální anestezii. Subarachnoidální punkce byla provedena asepticky Quinkeho jehlou (25 G, 88 mm, BBraun, Melsungen, Německo) v meziobratlovém prostoru L2/3 nebo L3/4 paramediálním přístupem po předchozí infiltraci místa vpichu 1% mesokainem (Mesocaine, Zentiva, Praha). Intratekálně bylo podáno 2,2 ml 0,5% levobupivakainu (Chirocaine, AbbVie, Praha, Česká republika) a 2,5 mg sufentanilu (podání mimo SPC; Sufentanil Torrex, Chiesi Pharmaceuticals, Vídeň, Rakousko). Oběhová nestabilita po indukci subarachnoidální anestezie byla řešena titračně 10 mg dávkami efedrinu (Ephedrin biotika, BB Pharma, Praha, Česká republika). Během výkonu byla pacientům podávána titračně sedace midazolamem (Midazolam Accord, Accord Healthcare Polska, Varšava, Polsko). Pacientům byl podáván kyslík obličejovou maskou 5 l/min při poklesu saturace pod 93 %. Monitoring a záznam dat byl jinak obdobný jako u pacientů ve skupině s CA.

Všem pacientům byla odebrána nesrážlivá krev (zkumavka s citrátem) před podáním indukční dávky anestetika nebo před provedením subarachnoidální punkce a po skončení operace. Vzorky krve byly umístěny do chladničky se 4 °C do doby analýzy na maximálně 4 hodiny.

DETEKCE MÍRY POŠKOZENÍ DNA

Izolace lymfocytů z periferní krve

Lymfocyty byly z plné periferní krve izolovány již popsanou metodikou [15, 16]. Do zkumavky byly napipetovány 4 ml LSM (Lymphocyte Separated Mediu, Biotech, Austria) a převrstveny 4 ml nesrážlivé krve. Zkumavky byly centrifugovány (30 minut, 1 500 rpm, 20 °C). Vzniklý prstenec lymfocytů byl přenesen do centrifugační zkumavky (Sarstedt, Australia) a doplněn 10 ml PBS (Sigma Aldrich, USA). Zkumavky byly centrifugovány (10 minut, 1 500 rpm, 8 °C), sediment byl resuspendován 10 ml PBS. Ve vzorku byla spočítána koncentrace buněk (Bürkerova komůrka). Vzorky byly opět zcentrifugovány (10 minut, 1500 rpm, 8 °C). Sediment byl zředěný PBS na koncentraci 1 milion buněk/ml.

Alkalická verze comet assay

K měření poškození DNA byla použita alkalická verze kometového testu [12]. Pro sledování jednotlivých typů poškození (SSB zlomy, oxidované pyrimidinové a purinové báze) byly lymfocyty pipetovány po 35 µl do 1,5 ml mikrozkumavek (Eppendorf, Germany). 85 µl 1% roztoku vysokotuhnoucí agarózy (HMP agaróza, Sigma Aldrich, USA) v PBS bylo pipetováno na předpřipravené podložní sklo potažené 1% vodným roztokem agarózy na elektroforézu (Sigma Aldrich, USA), bylo přikryto krycím sklem a tuhlo při 4 °C 5 minut. Po sejmutí krycího skla byla na HMP agarózu pipetována směs 35 µl lymfocytů s 85 µl 1% nízkotuhnoucí agarózy (LMP agaróza, Sigma Aldrich, USA) v PBS o teplotě 37 °C. Gel byl překryt krycím sklem a 5 minut tuhnul při 4 °C.

Lýza buněk

Po sejmutí krycích skel byla na podložní skla vložena do lyzačního roztoku (2,5 M NaCl; 100 mM EDTA – kyselina etylendiamintetraoctová, Sigma Aldrich, USA; 10 mM TRIS – tris(hydroxymethyl)aminomethan, Sigma Aldrich, USA, pH 10) s 1% Tritonem X–100 (Sigma Aldrich, USA). V lyzačním roztoku byla skla ponechána 1 hodinu.

Ovlivnění enzymy

Sklíčka, na která byly pipetovány enzymy (pro detekci modifikovaných pyrimidinových bází enzym Endo III – endonukleáza III a modifikovaných purinových bází enzym FPG – formaminopyrimidin-DNA-glykosyláza), byla vyjmuta z lyzačního roztoku a třikrát promyta ENDO pufrem (0,1 M KCl, 40 mM HEPES – kyselina 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethansulfonová, Sigma Aldrich, USA; 0,5 mM EDTA, 200 µl/ml BSA – hovězí sérový albumin, Sigma Aldrich, USA, pH 8). Na gely na sklíčkách bylo pipetováno 30 µl příslušného enzymu, byly přikryty krycím sklem a sklíčka byla inkubována v termoboxu (30 minut, 37 °C). Sklíčka, na kterých nebyl použitý enzym, zůstávají v lyzačním roztoku.

Rozplétání, elektroforéza a barvení

Po inkubaci a sejmutí krycích skel byla všechna podložní skla (ovlivňovaná enzymy i neovlivněná) vyskládána do elektroforetického tanku (Model A5 – Owl separation systems, Inc. Thermo Scientific, USA) naplněného elektroforetickým pufrem o teplotě 4 °C (300 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 13). Alkalické rozplétání DNA probíhalo po dobu 40 minut, poté byl připojen laboratorní zdroj EPS 300 IIV (C.B.S. scientific comapny, Inc., Taiwan) a následovala 30minutová elektroforéza (25 V, 300 mA, 4 °C) [17]. Po elektroforéze byla sklíčka promyta třikrát po dobu 5 minut neutralizačním pufrem (0,4M Tris-HCl, pH 7,5) a poté jednou redestilovanou vodou. DNA byla nabarvena 20 µl ethidium bromidu.

Hodnocení komet

Míra poškození DNA byla hodnocena pomocí fluorescenčního mikroskopu (Nikon Instruments Inc., USA) s připojenou kamerou a analyzována byla programem Lucia comet assay (Laboratory Imaging, Česká republika). Byl použit objektiv se zvětšením 10× a režim zeleného světla pro ethdium bromid. Hodnoceno bylo 50 buněk pro každý typ poškození. Míra poškození byla hodnocena jako procento DNA, která zůstala v jádře k DNA, která se nachází v ocasu komety (% tail DNA).

Metoda se řadí k poměrně časově nenáročným (kolem 6 hodin) a námi prováděná varianta analýzy se pohybovala v časovém rozpětí 7–8 hodin. Další výhodou metody je její ekonomická nenáročnost a velmi dobrá citlivost a robustnost. V současné době se také rozvíjí možnost využití komerčně vyráběných kitů, které celý proces značně urychlují a dodávají metodě lepší reprodukovatelnost.

STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ

Data byla testována na normalitu D’Agostino--Pearson omnibus testem. Výsledky comet assay byly počítány pro každou kometku zvlášť jako % tail DNA. Demografická data byla hodnocena testem one-way ANOVA a Chi-square testem (pro pohlaví). Porovnání výsledků v obou skupinách bylo pomocí dvouvýběrového nepárového Studentova t-testu, párového t-testu nebo Wilcoxonova a Mann-Whitneyova testu (pro data bez Gaussova rozložení). Data jsou ve tvaru průměr (± směrodatná odchylka) nebo medián (interkvartilové rozpětí) pro data bez Gaussova rozložení. Pro statistickou analýzu byl použit program GraphPad Prism v 6.0c (GraphPad Software, Inc., CA, USA). Hladina statistické významnosti byla p = 0,05.

VÝSLEDKY

Do studie bylo zařazeno 45 pacientů, ale kompletní data byla získána pouze od 34. Důvodem byla nepoužitelnost některých vzorků pro analýzu kvůli instrumentálnímu selhání. Ve skupině s CA bylo 19 pacientů a ve skupině se SAB 15 pacientů. Demografická data a výsledky předoperačního vyšetření shrnuje tabulka 1. Pacienti v SAB skupině byly statisticky významně starší. Pacienti ve skupině CA měli vyšší hmotnost a byli statisticky významně vyšší. Relevantní laboratorní výsledky před anestezií a údaje z peroperačního průběhu výkonu popisuje tabulka 2. Peroperační fluoroskopie byla použita ve skupině s CA u 7 pacientů, údaje o dávce záření jsou v tabulce 2. Pacienti v CA měli statisticky významně vyšší tepovou frekvenci a délku operace. Pacienti v SAB skupině měli statisticky významně vyšší předoperační hodnoty koncentrace hemoglobinu a vyšší hematokrit.

Parametry poškození DNA shrnují tabulky 3 a 4 a znázorňují grafy 1–6. Procento zlomů DNA SSB bylo statisticky významně vyšší po celkové anestezii s peroperační fluoroskopií (grafy 1 a 2). Procenta oxidovaných pyrimidinových bází (ENDO – grafy 3 a 4) a purinových bází (FPG – grafy 5 a 6) byla rovněž statisticky významně vyšší po operaci ve skupině CA. Parametry poškození DNA mezi pacienty s a bez peroperační fluoroskopie ve skupině CA nebyly statisticky významně rozdílné, přestože vykazovaly trend k vyššímu poškození při použití fluoroskopie (tab. 5). Nulová hypotéza, že CA poškozuje DNA stejně jako SAB, byla vyvrácena.

DISKUSE

V naší pilotní studii jsme popsali poškození DNA v průběhu chirurgického výkonu srovnatelného typu u pacientů v CA a v SAB. Celkovou anestezií se již zabývala řada autorů. Sardas et al. popsali poškození DNA u pacientů po abdominální chirurgii v celkové anestezii isofluranem, přičemž zaznamenali statisticky signifikantní rozdíly v porovnání s kontrolní skupinou nebo se stavem DNA před anestezií [4]. Podobné výsledky na podobném souboru pacientů byly publikovány i jinými autory [18]. Kadioglu et al. se zabývali vlivem sevofluranu u pacientek indikovaných k mastektomii na poškození DNA s použitím dvou metod: comet assay a alkaline halo assay [19]. Popsali statisticky významné poškození DNA po dvouhodinovém výkonu oběma metodami. Nogueira et al. popsali statisticky významné poškození DNA druhý den po chirurgickém zákroku v anestezii desfluranem [20]. Braz et al. se zabývali sevofluranem a propofolem v rámci miniinvazivní otorinolaryngologické chirurgie, která trvala dvě hodiny [3]. Ani u jedné skupiny pacientů nezaznamenali statistický významné rozdíly v poškození DNA a jejich studie se tímto vymyká. Stran vlivu lokálních anestetik na integritu DNA jsme našli pouze animální studie, ve kterých byly navíc použity jiné metody.

Naše výsledky a výsledky výše uvedených studií nás staví před zásadní otázku genotoxicity anestetik a chirurgického výkonu jako iatrogenní poškození. Autoři citovaných studií sledovali kondici DNA i v prvních pooperačních dnech a shodují se na tom, že k plné reparaci DNA dojde až mezi 3. a 5. pooperačním dnem [4, 18, 19]. Tyto výsledky se shodují s daty naší výzkumné skupiny (dosud nepublikovaná data na jiném souboru pacientů). Jaký to má klinický dopad, tedy dopad na stonání pacientů a na zotavení z operačního traumatu zatím nevíme, podobně jako dopad statisticky významně vyššího poškození DNA u pacientů v CA v naší studii. Souvislost s neurotoxicitou a rozvojem pooperační kognitivní dysfunkce můžeme zatím pouze předpovídat [21]. Přímý kancerogenní vliv na lidský organismus byl dosud prokázán u halotanu [22], který byl z tohoto důvodu v humánní medicíně zakázán. Nicméně, přestože naše výsledky prokazují změnu DNA na subklinické úrovni, stále je to změna, která může vést k potenciálně vyššímu riziku kancerogeneze. Výsledky citovaných studií u pacientů podstupujících operační výkon i studií zabývajících se personálem operačního sálu (tedy anestetik samotných) [5, 6] otevírají další otázky směrem k zavedení prevence poškození DNA jak u pacientů, tak u personálu operačních sálů [23] a revizi hygienických norem [24]. V otázce izolovaného vlivu operačního traumatu na integritu DNA získáme odpověď pouze nepřímo. V našem souboru pacientů prezentujeme 2 skupiny, které mezi sebou lze jen velmi obtížně porovnávat. Nicméně u pacientů v SAB bylo poškození DNA na konci výkonu minimální. Důvodem může být deaferentace z operačního pole a menší centrálně vedená reakce, ovšem imunitní reakce SAB potlačena není.

Naše studie má několik limitací týkajících se jejího sekundárního cíle. Kohorty pacientů tvořily dvě nesourodé skupiny, i když jsme je vzájemně neporovnávali. Důvod jejich rozdílnosti byl ten, že skupina CA s peroperační fluoroskopií měla mít vyšší inzult vůči DNA a skupina SAB menší pro potřeby testování metodiky. Hlavní rozdíly u pacientů v CA byly delší čas operací, opakované operace (např. pacienti po polytrauma), opakované krevní převody mezi operacemi (nižší hemoglobin a hematokrit, hemodiluce z kumulativně vyšší pozitivní tekutinové bilance), probíhající systémová zánětlivá odpověď (vyšší předoperační tepové frekvence), průměrně mladší věk pacientů. Zásadní limitací, pokud bychom chtěli porovnávat izolovaně vliv typu anestezie, je kombinace noxy vůči DNA: inhalační anestetika a rtg záření. Porovnání výsledků poškození DNA u pacientů s a bez peroperační fluoroskopie sice neprokázalo významné rozdíly, ale pro malý počet pacientů byl použitý statistický test bez dostatečné síly. Nicméně, zjistili jsme trend k vyššímu poškození DNA u pacientů s kombinovanou noxou. Vliv oxidu dusného též nemůžeme přehlížet, a to ani u personálu operačních sálů [25]. Dále, obě skupiny nebyly randomizované. Pacienti byli do skupin zařazováni prospektivně na dvou klinikách.

ZÁVĚR

Prokázali jsme použitelnost metody comet assay pro kvantifikaci změn DNA u pacientů po chirurgickém výkonu v anestezii. Ve skupině pacientů, kteří podstoupili traumatologický operační výkon v CA (isofluran + oxid dusný) s nebo bez peroperační fluoroskopie jsme prokázali statisticky významné poškození DNA metodou comet assay. Ve skupině pacientů, kteří podstoupili ortopedický operační výkon významně kratšího trvání v SAB bylo poškození DNA po operaci minimální. Výsledky negativního působení anestetik na lidský genom zasluhují zavedení preventivních opatření a otevírají cestu k testování protektivních konceptů směřujících k minimalizaci poškození DNA v důsledku podání anestezie a operačního traumatu.

Práce je původní, nebyla publikována ani není zaslána k recenznímu řízení do jiného média.

Předběžné výsledky byly prezentovány formou posteru na konferenci ČSARIM 2018 a formou přednášky na 14^th International Medical Postgraduate Conference 2017 na Lékařské fakultě v Hradci Králové.

Autoři prohlašují, že nemají střet zájmů v souvislosti s tématem práce.

Všichni autoři rukopis četli, souhlasí s jeho zněním a zasláním do redakce časopisu Anesteziologie a intenzivní medicína.

Podíl autorů na vytvoření článku:

AD: napsal převážnou většinu rukopisu, byl zodpovědný za nábor pacientů a dodání vzorků.

KM: podílela se na analýzách.

ZV: podílela se na analýzách, napsala metodickou část analýzy rukopisu.

KM: byla zodpovědná za analýzy.

HR: podílel se na analýzách.

TA: podílela se na analýzách.

CV: podílel se na tvorbě rukopisu.

SR: vypracoval metodu analýzy.

ZZ: navrhl celý projekt, podílel se na jeho průběhu, podílel se na tvorbě rukopisu.

Institucionální podpora Fakultní nemocnice Hradec Králové: MH CZ – DRO (UHHK, 00179906), všechna práva vyhrazena.

Studie nebyla registrována.

Etická komise fakultní nemocnice Hradec Králové, jednací číslo 201511 S14P.

Do redakce došlo dne 8. 8. 2019.

Do tisku přijato dne 6. 11. 2019.

MUDr. David Astapenko, Ph.D.

Astapenko.d@seznam.cz