Pozitivní asociace adiponektinu s adipocytárním proteinem vázajícím mastné kyseliny u pacientů s nepříznivým dyslipidemickým fenotypem

Souhrn

Cíl studie:
Vyšetřili jsme 214 asymptomatických dyslipidemických jedinců rozdělených do dvou skupin, DLP1 (n = 66) a DLP2 (n = 148), podle hladiny triacylglycerolů (TG) a apolipoproteinu B (Apo B). Cílem studie bylo vyhodnotit vztah adiponektinu (ADP) s adipocytárním proteinem vázajícím mastné kyseliny (A-FABP), a dále zjistit jejich možnou asociaci s lipidovými parametry, markery inzulinové rezistence a markery hemostázy ve sledovaných skupinách.

Typ studie:
prospektivní observační

Výsledky:
Ve skupině DLP2 (TG ≥ 1,5 mmol a/nebo Apo B ≥ 1,2 g/l) byla nalezena pozitivní korelace adiponektinu s věkem, HDL cholesterolem, apolipoproteinem A1, N- terminálním prohormonem mozkového natriuretického peptidu, von Willebrandovým faktorem a A-FABP, a negativní korelace s body mass indexem, obvodem pasu, TG, aterogenním indexem plazmy, inzulinem, C-peptidem a proinzulinem. V téže skupině byla zaznamenána významná pozitivní korelace A-FABP s věkem, body mass indexem, obvodem pasu, C-reaktivním proteinem, N- terminálním prohormonem mozkového natriuretického peptidu, von Willebrandovým faktorem, inhibitorem aktivátoru plazminogenu-1, C-peptidem, proinzulinem a ADP. Po provedení vícečetné regresní analýzy byl zjištěn nezávislý vztah ADP s věkem (beta = 0,3764, p<0,0080) a A-FABP (beta = 0,2062, p = 0,0111). Ve skupině DLP2 jsme dále pozorovali nezávislou asociaci A-FABP s body mass indexem (beta = 1,0375, p = 0,0107) a ADP (beta = 0,2322, p = 0,0088). Tyto výsledky nebyly dosaženy ve skupině DLP1.

Závěr:
U pacientů s nepříznivým dyslipidemickým fenotypem byla zjištěna nezávislá reciproční asociace mezi ADP a A-FABP, která může být spojena s vyšším kardiovaskulárním rizikem.

Klíčová slova:
dyslipidémie, adipokiny, adiponektin, A-FABP, von Willebrandův faktor

Úvod

Tukovou tkáň charakterizuje mj. aktivní produkce řady látek, včetně adipokinů. Tyto molekuly zprostředkovávají velmi důležité metabolické procesy [1]. Zánět tukové tkáně je charakterizován infiltrací makrofágů a dalších prozánětlivých buněk. Proinflamační adipokiny vykazují nepříznivé působení na vaskulaturu, zejména podporou inzulinové rezistence (IR) a infiltrace monocytů do buněčné stěny [2].

Adiponektin je hormon tukové tkáně, který působí jako protektivní faktor při iniciaci a progresi aterosklerózy vlivem jeho protizánětlivých a protiaterogenních vlastností. Jeho sérové hladiny jsou sníženy u obézních jedinců, pacientů s diabetem 2. typu, u pacientů s onemocněním koronárních artérií apod. [3]. Hladina adiponektinu pozitivně koreluje s hladinou HDL cholesterolu, naopak negativně s markery zánětu, markery inzulinové rezistence, triacylglyceroly a markery metabolismu na triacylglyceroly bohatých lipoproteinových částic, a dalšími adipokiny [4]. Protizánětlivý efekt může být hlavní složkou jeho kladného působení při potlačování kardiovaskulárních a metabolických onemocnění, včetně aterosklerózy a inzulinové rezistence. Navíc se zdá, že vykazuje přímou biologickou aktivitu, a to mj. indukcí klasické cesty aktivace komplementu [5]. Nízké koncentrace adiponektinu nezávisle korelují s metabolickým syndromem i koronární aterosklerózou [6]. Výsledky soudobých epidemiologických studií však ukazují, že zvýšené hladiny ADP jsou spojeny jak se zlepšenou, tak i zhoršenou kardiovaskulární prognózou.

Adipocytární protein vázající mastné kyseliny je řazen mezi „nepříznivé“ adipokiny a pravděpodobně představuje nový marker a/nebo prediktor metabolického syndromu. Je dominantním cytoplazmatickým proteinem zralých adipocytů a regulátorem lipidového a glukózového metabolismu, přítomným také v makrofázích tukové tkáně. Jeho expresi indukují oxidované nízkodenzitní lipoproteiny (oxLDL) a vyšší hladiny A-FABP jsou asociovány se zvýšenou glykémií nalačno, triacylglyceroly, inzulinem, body mass indexem a obvodem pasu, a se sníženou hladinou HDL cholesterolu, zejména u pacientů s metabolickým syndromem [7].

V soudobé literatuře lze nalézt limitované informace o vzájemném vztahu adiponektinu s A-FABP u pacientů bez klinické manifestace aterosklerózy. V této studii jsme porovnávali, zda existuje asociace mezi sledovanými adipokiny, lipidovými parametry a dalšími rizikovými faktory IR, včetně hemostatických parametrů. Dále jsme zjišťovali, zda se tyto vztahy případně liší u dvou dyslipidemických skupin pacientů s odlišnými hladinami triacylglycerolů a/nebo apolipoproteinu B.

Materiály a metody

Design studie a sledovaní jedinci

Studie byla realizována v souboru asymptomatických dyslipidemických pacientů a jejich rodinných příbuzných. Tito jedinci byli poprvé vyšetřeni v Lipidové poradně III. interní kliniky Fakultní nemocnice Olomouc během období od ledna 2009 do března 2012. Všichni sledovaní byli testováni na přítomnost sekundární dyslipidémie, diabetu mellitu, hypothyroidismu, jaterního a renálního onemocnění a nefrotického syndromu. Další vylučující kriteria byla následující: přítomnost klinicky manifestní aterosklerózy prezentované onemocněním koronárních artérií, cerebrovaskulárním onemocněním a onemocněním periferních artérií, jakákoli hypolipidemická terapie v předchozích 8 týdnech před první návštěvou, hormonální terapie a klinická manifestace akutní infekce. Všem jedincům byla odebrána osobní a rodinná anamnéza a vyplnili dotazník mapující předchozí onemocnění, farmakoterapii a status kouření. Byl změřen krevní tlak, obvod pasu a určen body mass index (BMI). Studie byla schválena Etickou komisí lékařské fakulty a Fakultní nemocnice Olomouc a od všech participantů byl získán informovaný souhlas.

Jedinci, kteří splnili kritéria pro zařazení do studie (n = 214), byli dále rozděleni na skupinu DLP1 (n = 66, z toho 28 žen a 38 mužů) a skupinu DLP2 (n = 148, z toho 78 žen a 70 mužů). Kritériem pro zařazení do skupiny DLP2 byla hladina triacylglycerolů vyšší než 1,5 mmol/l a/nebo hladina apolipoproteinu B vyšší než 1,2 g/l [8].

Laboratorní analýza

Vzorky venózní krve byly odebírány ráno po 12hodinovém lačnění. Pro další analýzy bylo použito krevní sérum získané ze srážlivé krve, mimo stanovení hemostatických parametrů. Pro jejich analýzu byla odebrána nesrážlivá krev do zkumavky s 3,8% citronanem sodným a po centrifugaci byla získána krevní plazma.

Rutinní biochemické parametry byly stanoveny na analyzátoru Modular SWA (Roche, Basilej, Švýcarsko) v den odběru krve. Koncentrace adipokinů a dalších speciálních analytů byly měřeny v alikvotech zamražených na -80 ºC (-20 ºC), ne déle než 6 měsíců.

Celkový cholesterol (TC), triacylglyceroly, glukóza a HDL cholesterol (HDLc) byly stanoveny enzymovými metodami (Roche, Basilej, Švýcarsko). Stanovení HDLc bylo provedeno za pomoci přímého stanovení, bez předchozí precipitace lipoproteinů obsahujících apolipoprotein B. LDL cholesterol (LDLc) byl kalkulován Friedewaldovým vztahem pro TG menší než 4,5 mmol/l. Dalšími počítanými parametry byly: non HDL cholesterol (nonHDLc = TC – HDLc) a aterogenní index plazmy (AI = log TG/ HDLc). Koncentrace apolipoproteinů A1 a B, stejně jako hladiny lipoproteinu (a) [Lp(a)] a C-reaktivního proteinu (CRP), byly stanoveny imunoturbidimetrickými metodami Tina-Quant (Roche, Basilej, Švýcarsko). Stanovení N-terminálního propeptidu mozkového natriuretického peptidu B (NT-proBNP) bylo provedeno metodou ECLIA (Elecsys pro BNP kit, Roche, Basilej, Švýcarsko).

Hladiny inzulinu byly určeny komerčně dostupným kitem za použití IRMA metody (Immunotech, Marseille, Francie). C-peptid a proinzulin (PINS) byly stanoveny následujícími komerčními soupravami: C-peptide Kit (Immunotech, Marseille, Francie) a Proinsulin Kit (DRG Instruments GmbH, Marburg, Německo) radioimunochemickými metodami. Hemostatické markery byly stanoveny ze zvláštního alikvotu plazmy zamraženého na -20 ºC, ne déle než 6 měsíců, za pomoci uvedených souprav: fibrinogen (koagulační metoda podle Clausse, Technoclone, Vídeň, Rakousko), von Willebrandův faktor (vWF, immunoturbidimetrická metoda, Instrumentation Laboratory Spa, Milán, Itálie), inhibitor aktivátoru plazminogenu 1 (PAI-1) a tkáňový aktivátor plazminogenu (tPA, oba ELISA, Technoclone, Vídeň, Rakousko).

Celkový adiponektin a A-FABP byly stanoveny kity Human Adiponectin ELISA Kit a Human A-FABP ELISA Kit (BioVendor, Brno, ČR), podle instrukcí výrobce a po verifikaci obou metod. Byly použity alikvoty vzorků zamražené na –80 ºC (ne déle než 6 měsíců).

Statistická analýza

Všechny hodnoty jsou vyjádřeny jako průměry ± směrodatná odchylka (SD), parametry s nenormálním rozložením také jako mediány. Pro určení normality distribuce dat byl použit Kolmogorovův-Smirnovův test. Proměnné s nenormálním rozložením [CRP, TG, Lp(a), NT-proBNP, fibrinogen, vWF, tPA, PAI-1, inzulin, C-peptid, PINS] byly před statistickou analýzou logaritmicky transformovány. Rozdíly v proměnných mezi skupinami byly stanoveny za pomoci ANOVA, po adjustaci na věk, pohlaví a BMI. Pro statistické vyhodnocení korelační analýzy mezi jednotlivými proměnnými byl použit Pearsonův korelační koeficient (normální distribuce) a univarietní Spearmanova korelační analýza (nenormální distribuce). Lineární regresní analýza byla provedena pro testování případné nezávislé asociace mezi závisle a nezávisle proměnnými. Statistické zpracování dat bylo provedeno za pomoci programu SPSS for Windows, verze 12.0 (Chicago, IL, USA). Hodnota pravděpodobnosti p<0,05 byla považována za statisticky významnou.

Výsledky

Základní klinické a laboratorní charakteristiky všech sledovaných subjektů a jedinců ve skupinách DLP1 a DLP2 jsou shrnuty v Tabulce 1. Pacienti ve skupině DLP2 měli vyšší BMI ve srovnání se skupinou DLP1. Kromě očekávaného nepříznivého lipidového profilu představovaného zvýšenými hladinami TC, TG, AI, nonHDL, LDLc, Apo B (vše s p<0,001), a sníženými hladinami HDLc (p<0,001) a Apo A1 (p<0,05), jsme u nich zaznamenali signifikantně zvýšené hladiny CRP (p<0,05). Z hemostatických parametrů byl významně zvýšen fibrinogen (p<0,01). Sérové koncentrace adiponektinu byly signifikantně nižší (p<0,05) ve skupině DLP2.

V Tabulce 2 jsou uvedeny signifikantní korelace adiponektinu s ostatními měřenými markery. Je zřejmé, že ve skupině DLP2 byla nalezena pozitivní korelace adiponektinu s věkem, HDLc, Apo A1, NT-proBNP, vWF a A-FABP, a negativní korelace s BMI, obvodem pasu, TG, AI, inzulinem, C-peptidem a PINS. U DLP1 pacientů nebyla z uvedených parametrů zjištěna jakákoli významná souvislost s TG, inzulinem, PINS a A-FABP.

Stejnou analýzu, avšak s A-FABP namísto ADP, uvádí Tabulka 3. U jedinců zařazených do skupiny DLP2 jsme zjistili významnou pozitivní korelaci A-FABP s věkem, BMI, obvodem pasu, CRP, NT-proBNP, vWF, PAI-1, C-peptidem, PINS a ADP. U skupiny DLP1 pozitivně korelovaly pouze BMI, PAI-1, inzulin a C-peptid.

Pro vyhodnocení nezávislé asociace korelovaných parametrů s ADP a A-FABP byla následně provedena vícekroková regresní analýza s adipokiny jako závisle proměnnými a korelovanými parametry jako nezávislými prediktory (Tabulka 4). U skupiny DLP2 byl zjištěn nezávislý vztah ADP s věkem (beta = 0,3764, p<0,0080) a A-FABP (beta = 0,2062, p = 0,0111). V téže skupině jsme pozorovali nezávislou asociaci A-FABP s BMI (beta = 1,0375, p = 0,0107) a ADP (beta = 0,2322, p = 0,0088). Tyto výsledky nebyly dosaženy ve skupině DLP1, kde jsme zaznamenali pouze asociaci A-FABP s inzulinem (beta = 0,4033, p = 0,0171).

Diskuse

V naší práci jsme sledovali především pacienty, kteří jsou dispenzarizováni v lipidové poradně Fakultní nemocnice Olomouc bez zjevných známek kardiovaskulárního onemocnění, avšak s dyslipidémií. Současná terapeutická doporučení pro léčbu dyslipidemických pacientů jsou obecně založena především na LDL cholesterolu, který je využíván pro stratifikaci rizika i jako léčebný cíl, na jehož základě jsou vedeny intervenční terapeutické strategie [9]. Jeho stanovení je „vyšetřením první linie“. Naproti tomu je Apo B vesměs zmiňován jako parametr, který může být užitečný pro další charakterizaci pacientů s vysokým kardio-metabolickým rizikem, se zvýšenou hladinou malých denzních LDL a dalších aterogenních lipoprotei-nů, které ne zcela odráží stanovení LDL cholesterolu [10,11]. V předkládané studii byly kriteriální parametry pro zařazení do skupin zvoleny na základě hladin TG a Apo B podle Snidermana (2004) [8], který definuje tzv. dyslipidemické fenotypy. Již dříve bylo zjištěno, že množství malých denzních LDL částic v plazmě se významně zvyšuje od hladiny TG 1,5 mmol/l [12]. Některé studie dále ukazují na skutečnost, že Apo B může být lepším prediktorem koronárního rizika a aterosklerózy než hladiny TC, LDLc nebo nonHDLc [13,14]. Hladina 1,2 g/l u Apo B je zvolena proto, že od této hodnoty rapidně roste kardiovaskulární riziko. Tato hodnota koresponduje se 75. percentilem severoamerické populace [8]. Dělení dle uvedených kritérií však nerozděluje zkoumané subjekty na normolipidemické a hyperlipidemické tak, jak dyslipidémii charakterizují soudobá odborná doporučení.

V souladu s vědeckou literaturou i našim očekáváním jsme zaznamenali u subjektů s vyššími hladinami TG a Apo B vyšší BMI a nepříznivější celkový lipidový a lipoproteinový profil. Z hemostatických markerů byl zvýšen po adjustaci hodnot na věk, pohlaví a BMI pouze fibrinogen. Ani mírně snížené hladiny ADP a statisticky nevýznamně zvýšené koncentrace A-FABP nejsou překvapující. Tyto souvislosti byly dříve zaznamenány např. u pacientů s metabolickým syndromem, jak je uvedeno v soudobé literatuře [6,15]. Zvýšené hladiny CRP, mohou ukazovat na zvýšený prozánětlivý stav u pacientů s nepříznivým dyslipidemickým fenotypem.

Korelační analýza ve skupině DLP2 potvrdila dříve publikované souvislosti obou adipokinů se sledovanými parametry. Mimo to jsme však zaznamenali méně očekávaná zjištění, a to v podobě pozitivní korelace ADP s vWF, NT-pro BNP a A-FABP. Podobně i A-FABP koreloval se jmenovanými parametry. Následná vícekroková regresní analýza však ukázala, že nezávislým prediktorem ADP je ve skupině DLP2 kromě věku jen A-FABP, zatímco hladiny A-FABP asociovaly kromě BMI právě s ADP.

V předchozí práci demonstrovala Vaverková et al. (2013) [16] u dyslipidemických subjektů pozitivní asociaci ADP s trombomodulinem, solubilními vaskulárními adhezivními molekulami (sVCAM-1) a vWF. Plazmatické hladiny vWF jsou u zdravých jedinců považovány za slabý nezávislý prediktor budoucího srdečního onemocnění [17], zatímco u pacientů s vaskulárním onemocněním a vyšším vWF je riziko budoucího infarktu myokardu mnohem větší [17, 18]. Soudobé poznatky ukazují, že vWF je spjat s rizikem aterotrombózy [18] a subklinické aterosklerózy u dyslipidemických pacientů [19]. Podobně i pozitivní korelace A-FABP s vWF podporuje roli obou parametrů při rozvoji endoteliální dysfunkce u dyslipidemických jedinců. V této studii však pozbyl vztah adipokinů k vWF nezávislosti po provedení regresní analýzy.

Adiponektin je jedním z mála adipokinů, který vykazuje příznivé preventivní efekty na kardiovaskulární riziko, a to prostřednictvím jeho pleiotropního působení na cévy a srdce. Kardioprotektivní efekt je považován za jednu z jeho hlavních benefitních funkcí [20]. Antiapoptotická aktivita ADP reprezentuje pravděpodobně klíčový mechanismus, kterým ADP chrání před kardiálním poškozením [21]. V kardiomyocytech podporuje ADP snížení oxidačního stresu, apoptózy, fibrózy a zánětu, a zvyšuje uptake glukózy a mastných kyselin. Navzdory jeho ateroprotektivním vlastnostem však byla zjištěna asociace ADP jak se sníženým [22], tak se zvýšeným [23] rizikem kardiovaskulárního onemocnění a/nebo mortality.

A-FABP je klíčovým mediátorem spojujícím obezitu s kardiovaskulárními onemocněními [20]. Jeho proaterogenní aktivita je zprostředkována přímým působením na makrofágy, nezávisle na lipidovém metabolismu a inzulinové senzitivitě [24]. Závěry studií prováděných na zvířatech podporují etiologickou úlohu A-FABP při rozvoji kardiovaskulárních komplikací [25]. A-FABP byl dříve identifikován jako hlavní kardiodepresant, který zesiluje supresní efekt adipocytů na srdeční kontraktilní funkci [26].

Nezávislá reciproční pozitivní asociace ADP s A-FABP ve skupině subjektů s nepříznivým dyslipidemickým fenotypem tedy může být spojena se vztahem těchto adipokinů zejména ke kardiovaskulárnímu systému a mohla by odrážet kompenzační odpověď ADP na vyšší riziko kardiovaskulárního onemocnění, které mj. představuje i mírně zvýšená hladina A-FABP a vyšší prozánětlivý stav. Oba parametry navíc korelovaly s NT-proBNP, který je považován za významný prognostický a diagnostický marker u pacientů se srdečním selháváním. Von Eynatten et al. (2006) [27] zkoumali ve své práci vztah ADP k zánětlivým markerům, aterogenní dyslipidémii a srdečnímu onemocnění u pacientů s onemocněním koronárních artérií. Po adjustaci dat na věk a pohlaví byla nalezena pozitivní asociace ADP s HDLc, a také s NT-proBNP. Několik studií dále popisuje vztah A-FABP s koronární aterosklerózou [28,29] a jeho možné role v rozvoji kardiální dysfunkce, včetně pozitivní korelace s NT-proBNP [30]. V této studii vzájemný vztah ADP a A-FABP k NT-proBNP pozbyl po provedení regresní analýzy statistické významnosti. Uvedené závěry jsou v souladu s naší předchozí studií, která vyhodnocovala vzájemné souvislosti mezi ADP, A-FABP a fibroblastovým růstovým faktorem 21 (FGF 21) u pacientů s metabolickým syndromem [31]. I zde byla mj. nalezena nezávislá asociace ADP a A-FABP pouze u rizikových jedinců.

Limitace studie

Jak je zmíněno výše, námi uvedená stratifikace subjektů do skupin dle uvedených kritérií nerozděluje zkoumané pacienty na normolipidemické a hyperlipidemické tak, jak dyslipidémii charakterizují soudobá odborná doporučení. Pro větší zobecnění by bylo vhodné potvrdit závěry studie na dalších takto definovaných pacientských souborech.

Závěr

V naší studii jsme vyhodnotili vztah adiponektinu a A-FABP k lipidovým parametrům, markerům inzulinové rezistence a hemostatickým markerům v souboru asymptomatických jedinců rozdělených do skupin podle koncentrací triacylglycerolů a apolipoproteinu B. Zjistili jsme především vzájemnou pozitivní asociaci ADP s A-FABP, a to pouze ve skupině s nepříznivým dyslipidemickým fenotypem s vyšší hladinou TG a Apo B. Tato skutečnost by mohla být odrazem zvýšeného kardiovaskulárního rizika u těchto pacientů, i přes nepřítomnost symptomů kardiovaskulárního onemocnění.

Seznam zkratek

ADP = adiponektin

A-FABP = adipocytární protein vázající mastné kyseliny

AI = atherogenní index plazmy (log TG / HDLc)

ANOVA = analysis of variance, analýza rozptylu

Apo = apolipoprotein

BMI = body mass index

CRP = C-reaktivní protein

DBP = diastolický krevní tlak

HDLc = high density lipoprotein cholesterol

LDLc = low density lipoprotein cholesterol

Lp(a) = lipoprotein (a)

nonHDL = non HDL cholesterol (nonHDL = TC-HDLc)

NT-proBNP = N-terminální prohormon mozkového natriuretického peptidu

PAI-1 = inhibitor aktivátoru plazminogenu-1

PINS = proinzulin

SBP = systolický krevní tlak

TC = celkový cholesterol

TG = triacylglyceroly

tPA = tkáňový aktivátor plazminogenu

vWF = von Willebrandův faktor

Do redakce došlo 5. 5. 2014

Adresa pro korespondenci

Ing. Dalibor Novotný, Ph.D.

Oddělení klinické biochemie

Fakultní nemocnice Olomouc

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

dalibor.novotny@fnol.cz