Abstrakta posterů

P-1

Využití ultra-rychlého SPE-MS/MS systému pro stanovení čtyř tyrosin-kinasových inhibitorů v lidské plazmě

Ultra-fast on-line SPE-MS/MS method for quantification of four tyrosine kinase inhibitors in human plasma

Vrobel I., Mičová K., Široká J., Friedecký D., Faber E., Adam T.

Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University, Olomouc; Laboratory of Inherited Metabolic Disorders, University Hospital, Olomouc; Department of Hemato-Oncology, University Hospital, Olomouc; Department of Clinical Biochemistry, University Hospital, Olomouc

e-mail: ivo.vrobel@gmail.com

The aim of this work was to develop and validate new analytical method based on ultra-fast on-line solid phase extraction coupled to tandem mass spectrometry (SPE-MS/MS) for quantification of four tyrosine-kinase inhibitors (TKIs), Imatinib (IMA), Dasatinib (DAS), Nilotinib (NIL) and Lapatinib (LAP) in human plasma that can be used for high throughput therapeutic drug monitoring.

The new method was validated according to FDA guidelines and compared to the conventional liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method.

All four analytes were measured within wide calibration range (0.05 – 5.0 µg/mL for NIL and IMA, 0.1 – 10.0 µg/mL for LAP and 0.01 – 1.0 µg/mL for DAS) in less than 16 sec. Both intra- and inter-day accuracies were within 15 % and imprecisions were lower than 15 %. Even though the absolute matrix effects were higher in comparison with LC-MS methods, their effect on method performance was eliminated by usage of deuterated internal standards. The sensitivity was worse due to the matrix effects, however it was sufficient for clinical purposes.

SPE-MS/MS system shortens the analysis time significantly and allows throughput of > 180 samples per hour providing comparable results with LC-MS/MS methods.

Grants NT12218, CZ.1.05/2.1.00/01.0030, CZ.1.07/2.3.00/30.0004, CZ.1.07/2.3.00/20.0170, 1910-N26

P-2

Folátem ovlivnitelné hyperhomocysteinemie (HHC) v rutinní praxi metabolické ambulance

Hyperhomocysteinemias effectively treated by folate in the routine metabolic unit

Hyánek J., Matoška V., Dubská L., Miková B., Pejznochová H., Dvořáková J., Táborský L., Martiníková V., Privarová J.

OKBHI Nemocnice na Homolce, Praha

e-mail: josef.hyanek@homolka.cz

Pacienti a metody: ze skupiny 150 molekulárně geneticky vyšetřených pacientů - homozygotů a heterozygotů pro MTHFR 677 C>T a 1289 A>C v metabolické ambulanci za posledních 15 let vybrali autoři 44 pacientů s vysokým kardiovaskulárním rizikem (KVO) a zvýšeným celkovým homocysteinem >30 µmol/l (tHcy); dále byl vyšetřován plasmatický (PF) a erytrocytární folát (EF), holotranskobalamin (HTC), methylmalonová kys. (MMA), pyridoxalfosfát, methionin (Met), cystathionin (Cystat), adenosylhomocystein (adoHcy) a adenosylmethionin (adoMet). Pacienti se zvýšeným kreatininem, epileptici na léčbě barbituráty, diabetici a vegetariáni byli ze studie vyloučeni. Léčba podáním 5-10 mg acidum folicum/t. Skupina 30 náhodně vybraných pacientů z ambulance ZL NNH sloužila jako kontrolní soubor. Stanovení lipidů a tHcy bylo provedeno na analyzátoru Unicel DxC800 a LX 20 Beckman Coulter, Apo B a Lp(a) bylo stanoveno imunochemicky na Immage 800 Beckman Coulter, krevní obraz na přístroji XE 5000 Sysmex, HTC imunoanalyticky MEIA na Architect 2000 Abbot, PF a EF metodou CLIA na Cobas e411 Roche, pyridoxalfosfát na HPLC Agilent, MMA na GC/MS, Met, Cystat, adoMet, adoHcy na analyzátorech v ÚDMP.

Výsledky: TT genotyp MTHFR byl kauzální pro HHC v 69 %, modulační v 88 %. Korelační koeficient zvýšeného tHcy a sníženého PF u homozygotů -0,835; u heterozygotů -0,653; u zdravých +0,259. Typické kazuistiky, rodokmeny a výsledky efektivního léčebného podání acidum folicum jsou doloženy na vyobrazeních.

Závěr: ve slovanské populaci pacientů s vysokým rizikem KVO byly prokázany HHC z deficitu MTHFR jako v populaci severoevropské a americké. Deficit MTHFR je u nás třetí nejčastější příčinou HHC (po ledvinové insuficienci a deficitu HTC) a zasluhuje větší diagnostické a laboratorní pozornosti.

P-3

Enzýmová aktivita ceruloplazmínu v sére pacientov s Wilsonovou chorobou

Enzymatic activity of ceruloplasmin in patients with Wilson´s disease

Turecký L., Kupčová V., Netriová J., Ščigulinský P., Uhlíková E.

Ústav lekárskej chémie, biochémie a klinickej biochémie LFUK; III. interná klinika LFUK, OKB Nemocnice sv. Michala, Bratislava, Slovensko

e-mail: ladislav.turecky@fmed.uniba.sk

Wilsonova choroba je autozómovo-recesívne dedičná porucha metabolizmu medi s klinickými prejavmi postihnutia pečene a CNS. Podstatou tejto poruchy je mutácia génu kódujúceho špecifický transportný proteín pre meď – ATP7B. Hromadenie medi v organizme zvyšuje na jednej strane tvorbu voľných radikálov kyslíka, na druhej strane zníženie tvorby funkčného ceruloplazmínu, zvyšuje toxicitu železa, čím sa oxidačný stres ešte viac zvyšuje. Ceruloplazmín (Cpl) je multifunkčný proteín s enzýmovou aktivitou ferroxidázy a polyfenoloxidázy. Molekula Cpl obsahuje šesť atómov medi, ktoré sa do molekuly bielkoviny zabudovávajú až v neskorej sekrečnej fáze. Aj keď meď nemá priamy efekt na rýchlosť syntézy a sekrécie ceruloplazmínu, defekt inkorporácie iónov medi do molekuly ceruloplazmínu má za následok sekréciu nestabilného apoceruloplazmínu, ktorý nemá ferroxidázovú aktivitu. Cpl zohráva dôležitú úlohu v metabolizme železa a má aj antioxidačné účinky.

Cieľ práce: Úlohou našej práce bolo vyšetriť zmeny metabolizmu Cpl a jeho syntézy u pacientov s Wilsonovou chorobou – posúdiť enzýmové aktivity a tvorbu apoceruloplazmínu u pacientov s touto metabolickou poruchou. Zistiť, či sa menia aj špecifické enzýmové aktivity Cpl.

Pacienti a metódy: Vyšetrovaný súbor tvorilo 17 pa-cientov s diagnostikovanou Wilsonovou chorobou (8 mužov a 9 žien). Hladinu medi sme vyšetrovali pomocou atómovej absorpčnej spektrofotometrie, hladinu apoceruloplazmínu imunochemicky a enzýmové aktivity–ferroxidázu a polyfenoloxidázu–spektrofotometricky.

Výsledky a závery: Výsledky našej štúdie ukázali signifikantné zníženie hladiny medi (5,7 µmol/l vs. 17,4 µmol/l) ako aj apoceruloplazmínu (120 mg/l vs. 362 mg/l). Porovnanie zmien apoceruloplazmínu a špecifických aktivít ferroxidázy a polyfenoloxidázy neukázalo podstatné zmeny medzi pacientmi s Wilsonovou chorobou a kontrolnou skupinou. Na základe týchto výsledkov sa ukazuje, že syntéza Cpl je pri Wilsonovej chorobe signifikantne znížená, ale molekuly syntetizovaného ceruloplazmínu nie sú abnormálne, ale zachovávajú si normálnu enzýmovú aktivitu.

P-4

Cholínesteráza v sére experimentálnych zvierat so steatózou pečene

Cholinesterase in sera of experimental animals with liver steatosis

Turecký L., Kupčová V., Otrubová O., Muchová J., Uhlíková E.

Lekárska fakulta UK, Bratislava, Slovensko

e-mail: ladislav.turecky@fmed.uniba.sk

Pseudocholínesteráza (EC 3.1.1.8., CHE, cholínesteráza) je hydrolytický enzým syntetizovaný v pečeni a secernovaný do krvnej plazmy. Vyšetrovanie sérovej aktivity CHE sa používa ako laboratórny test na posúdenie funkcie pečene a pri diagnostike intoxikácie organofosfátmi. V poslednej dobe sa uvádzajú zvýšené aktivity CHE v sére pacientov s obezitou, hyperlipoproteinémiou ako aj steatózou pečene.

Cieľ práce: V našej štúdii sme chceli porovnať zmeny v obsahu triacylglycerolov (TGL) v pečeni a v sérových hladinách CHE na experimentálnych modeloch spojených s rozvojom steatózy pečene (experimentálny diabetes mellitus, poškodenie pečene tetrachlórmetánom).

Experimentálne podmienky: V práci sme použili model STZ diabetu indukovaného u novorodených potkanov a model toxického poškodenia pečene CCl4, pri ktorom dochádza aj ku steatóze pečene. Aktivitu CHE sme vyšetrovali spektrofotometricky. V pečeni experimentálnych zvierat sme vyšetrili obsah TGL chemicky aj histologicky.

Výsledky: Vyšetrenie zvierat so STZ-diabetom ukázalo štatisticky významný vzostup CHE v sére (o 210 %, P < 0,001). Množstvo TGL v pečeni diabetických zvierat bolo tiež signifikantne zvýšené. V sére zvierat s tetrachlórovým poškodením pečene sa aktivita CHE taktiež významne zvyšovala. Histologické vyšetrenie pečene i chemické stanovenie TGL ukázalo ich signifikantné zvýšenie (P < 0,001). Regresná analýza ukázala významnú pozitívnu koreláciu medzi aktivitou CHE a obsahom TGL v pečeni (P<0,001).

Závery: Výsledky vyšetrenia sérovej aktivity CHE a TGL v pečeni pri oboch experimentálnych modeloch spojených so steatózou pečene potvrdzujú, že steatóza pečene je spojená so zvýšením aktivity CHE v sére.

P-5

Enzýmová aktivita ceruloplazmínu v priebehu gravidity a u žien s intrahepatálnou cholestázou gravidných

Enzymatic activity of ceruloplasmin during pregnancy and in women with intrahepatic cholestasis of pregnancy

Uhlíková E., Kupčová V., Divéky L., Sotáková L., Turecký L.

Lekárska fakulta UK, Bratislava, Slovensko

e-mail: ladislav.turecky@fmed.uniba.sk

Ceruloplazmín (Cpl) je Cu-obsahujúci proteín. Estrogény zvyšujú syntézu Cpl, ktorého koncentrácia v gravidite stúpa na 3-4 násobok oproti fyziologickým hodnotám. Cpl je multifunkčný proteín s viacerými funkciami. V minulosti sa považoval za transportný proteín pre meď, neskôr sa ukázala významnou aj jeho enzýmová aktivita. Ďalšou funkciou Cpl je úloha pri ochrane proti pôsobeniu reaktívnych foriem kyslíka. Intrahepatálna cholestáza gravidných (ICP) je reverzibilná forma cholestázy objavujúca sa v druhej polovine gravidity.

Cieľ práce: Zistiť dynamiku zmien Cpl v priebehu gravidity ako aj prípadné zmeny u pacientiek s ICP.

Materiál a metódy: Vyšetrovaný súbor tvorilo 184 žien s fyziologickým priebehom gravidity v rôznych fázach gravidity. Zároveň sme vyšetrili aj 33 žien s ICP. Cpl sme vyšetrovali ako ferroxidázu a polyfenoloxidázu. Vyšetrovali sme aj hladinu celkových žlčových kyselín a hladinu Cu.

Výsledky: Ako ukázali výsledky našej štúdie, hladina Cpl začala signifikantne stúpať v 9. gestačnom týždni. Hodnoty v 2. a 3. trimestri boli vyššie ako v prvom trimestri, ale 2. a 3. trimester sa navzájom nelíšili. Aktivity polyfenoloxidázy a ferroxidázy sa zvyšovali paralelne. Súbor s ICP sme rozdelili na ľahkú formu (žlčové kyseliny < 40 µmol/l) a ťažkú formu (> 40 µmol/l). U žien s ľahšou formou neboli signifikantné zmeny ani ferroxidázovej ani polyfenoloxidázovej aktivity v porovnaní so zdravými gravidnými ženami. U žien s ťažkou formou ICP boli obe enzýmové aktivity ceruloplazmínu signifikantne zvýšené (polyfenoloxidáza: 825 vs. 616 mg/l, ferroxidáza: 11,42 vs. 9,01 µkat/l).

P-6

Enzýmová aktivita ceruloplazmínu u pacientov po transplantácii pečene - kazuistika

Enzymatic activity of ceruloplasmin in patients after liver transplantation

Uhlíková E., Kupčová V., Turecký L.

Lekárska fakulta UK, Bratislava, Slovensko

e-mail: ladislav.turecky@fmed.uniba.sk

Ceruloplazmín (Cpl) je multifunkčný proteín, ktorý má v organizme katalytickú, antioxidačnú a transportnú funkciu. Ceruloplazmín je glykoproteín syntetizovaný v hepatocytoch, keď sú atómy medi inkorporované do holoproteínu, a takto sa secernuje do cirkulácie. Je aj efektívny antioxidant pretože má schopnosť oxidovať vysokotoxické Fe²⁺ ióny na relatívne netoxické Fe³⁺ iony a takto pomáha zabrániť oxidačnému poškodeniu bielkovín, lipidov a DNA.

Cieľ práce: Zhodnotiť zmeny hladiny Cpl a jeho enzýmových aktivít u pacientov s chronickými hepatopatiami po transplantácii pečene.

Vyšetrovaný súbor a metódy: Vo svojej práci prezentujeme zo skupiny transplantovaných pacientov, dispenzarizovaných na III. internej klinike LFUK, 5 kazuistík. U pacientov bola vyšetrená enzýmová aktivita Cpl (ferrooxidáza a polyfenoloxidáza) pred transplantáciou a potom v období jeden, tri a šesť mesiacov po transplantácii pečene.

Výsledky: Ako ukázali výsledky našich vyšetrení, aktivita ferrooxidázy bola u všetkých prezentovaných pa-cientov pred transplantáciou signifikantne znížená. Tento nález je v súhlase so skutočnosťou, že títo pacienti boli pred transplantáciou pečene na hranici insuficiencie a proteosyntetická kapacita ich pečene bola výrazne znížená. Po transplantácii pečene dochádzalo u všetkých prezentovaných pacientov ku signifikantnému nárastu ferooxidázovej aktivity ceruloplazmínu. V prípade polyfenoloxidázovej aktivity ceruloplazmínu sme zistili odlišnú dynamiku zmien po transplantácii pečene.Toto rozdielne správanie sa oboch enzýmových aktivít Cpl si zatiaľ nedokážeme adekvátne vysvetliť. Môže ísť o rozdielny vplyv posttransplantačnej terapie na enzýmové aktivity ceruloplazmínu, alebo na odlišnosť zabudovania medi do molekuly proteínu.

P-7

Vliv kyseliny ursolové získané z přírodních zdrojů na regenerační schopnost jater

Influence of ursolic acid from nature origin on liver regeneration

Žaloudková L.¹, Tichá A.², Hyšpler R.^1,2, Živný P.¹

¹Ústav klinické biochemie a diagnostiky Fakultní nemocnice Hradec Králové, ²Centrum pro vývoj a výzkum Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: lenka.zaloudkova@fnhk.cz

Cílem studie bylo zhodnocení vlivu kyseliny ursolové (UA) z přírodních zdrojů na regenerační schopnost jater.

Metody: Potkani (n=18) ve věku 6 týdnů byli rozděleni do tří skupin. Dvě skupiny potkanů byly krmeny standardní laboratorní dietou (SLD) a jedna skupina byla krmena dietou vysokotukovou (HF). 7 dní před parciální hepatektomií (PH) byl potkanům (kromě kontrolní skupiny) denně podáván intragastricky extrakt kyseliny ursolové (80 mg/kg hmotnosti). Po dobu experimentu byly pravidelně sledovány hmotnostní změny zvířat a byla jim odebírána krev na stanovení analytů charakterizujících lipidový metabolismus–cholesterol (CHOL), HDL, LDL, triacylglycoly (TAG) a žlučové kyseliny (ŽK). 24 hodin po PH byli potkani utraceni, byla odebrána krev a jaterní tkáň pro molekulárně-biologické parametry (mRNA hepatocytární růstový faktor–HGF a nukleární transkripční faktory PPAR alfa a CYP7a1, CPT1).

Výsledky: Skupina SLD UA měla zvýšené HGF proti kontrolní skupině, zároveň u skupiny s HF dietou v porovnání se skupinou kontrolní bylo HGF sníženo (SLD 1,61±0,06, SLD UA 2,00±030, HF UA 1,34 ± 0,12. Výsledky jsou udány jako relativní vztažené k expresi HPRT genu. Výsledky aktivace PPAR alfa proti kontrolní skupině ukazují redukci exprese SREBP a aktivaci CPT1. U obou skupin potkanů v porovnání s kontrolní skupinou byly nalezeny snížené koncentrace SREB1. Stanovení ŽK prokázalo snížení koncentrace ŽK po PH u obou skupin v porovnání s kontrolní skupinou (SLD 104,4 ± 14,4; SLD UA 84,6 ± 11,0 HF UA 92,7±24,2 µmol/l).

Závěr: Vlivem podání kyseliny ursolové došlo ke stimulaci jaterní regenerace, což ukazuje na možné antihyperlipidemické učinky.

P-8

Pět let novorozeneckého screeningu dědičných metabolických poruch v České republice

Five years of newborn screening of inherited metabolic disorders in the Czech Republic

Chrastina P., Jandová J., Friedecký D., Hlídková E., Přibylová M., Zoulová V., Vlášková H., Pešková K., Pazdírková R., Procházková D., Ješina P., Hrubá Z., Adam T., Kožich V.

Ústav dědičných metabolických poruch, VFN a 1. LF UK v Praze; Laboratoř dědičných metabolických poruch, Fakultní nemocnice Olomouc; Klinika dětí a dorostu, FN Královské Vinohrady a 3. LF UK v Praze; Pediatrická klinika LF MU a FN Brno; Centrum molekulární biologie a genové terapie, FN Brno

e-mail: petr.chrastina@vfn.cz

Cíl: Pouze včasná diagnostika dědičných metabolických poruch (DMP) umožňuje včasnou léčbu, která zlepšuje prognózu nemocných dětí. Po pěti letech vyhodnocujeme výsledky rozšířeného novorozeneckého screeningu (NS) na 10 DMP.

Metoda: Aminokyseliny a acylkarnitiny byly analyzovány ze suché krevní kapky metodou tandemové hmotnostní spektrometrie.

Výsledky: V období od 1. října 2009 do 31. prosince 2014 jsme vyšetřili 577 756 novorozenců a zachytili 166 novorozenců s DMP. Jeden pacient s intermitentní formou leucinózy nebyl zachycen. Pozitivní prediktivní hodnota byla 26,5 %. Celková frekvence falešně pozitivních nálezů byla 0,08 %. U nejčastějších onemocnění (PKU/HPA 1:5 200, deficit MCAD 1:19 900 a deficit LCHAD 1:57 800) jsme analyzovali i zastoupení patogenních alel a jejich regionální rozložení. Celková frekvence skutečně zachycených pacientů byla 1: 3 460.

Závěr: Výsledky NS DMP v České republice jsou ve shodě s doporučením Region4Screening. Nastavení laboratorních kritérií neustále optimalizujeme s cílem snížit frekvenci falešně pozitivních nálezů. V současné době je připraveno rozšíření screeningového panelu o 5 DMP: citrulinémii typu I, argininémii, deficit CBS, MTHFR a deficit biotinidázy.

Podpořeno MZ ČR – RVO VFN64165 a projektem OPPK CZ.2.16/3.1.00/24012.

P-9

Nástrahy testování POCT systémů stanovení glukózy

Pitfalls of testing glucose POCT systems

Springer D. Omastová K. Zima T.

Referenční laboratoř pro klinickou biochemii při Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky, Všeobecná fakultní nemocnice v Praze

e-mail: springer@vfn.cz

Požadavek na testování glukometrů, které jsou nabízeny pro selfmonitoring diabetiků i pro ambulance diabetologů, vzešel ze společného jednání České diabetologické společnosti a České společnosti klinické biochemie. Navrhované hodnocení osobních glukometrů je vypracováno s ohledem na normu EN ISO 15197, doporučení NACB a české doporučení „Diabetes mellitus - laboratorní diagnostika a sledování stavu pacientů."

Pro testování máme akreditovanou metodu „Stanovení glukózy systémem glukometr – měřící proužek pro ověření funkce glukometru“, kdy jsou srovnávány výsledky měření získané glukometrem s hexokinázovou metodou ve venózní krvi. Metoda testování je akreditovaná dle normy ISO 17 025 Českým institutem pro akreditaci. Výsledné hodnocení je zaměřeno na uživatele systému a jeho metodika zahrnuje systém hodnocení dle normy ISO 15197 proveditelný v podmínkách testovací laboratoře.

Hodnotí se opakovatelnost naměřených výsledků, mezilehlá preciznost, ale hlavně přesnost ve srovnání s výsledky s referenční hexokinázovou metodou, provádí se i vyhodnocení kvality příbalového letáku a návodu k použití.

V rámci testování glukometru dovezly výrobní firmy do laboratoře dvakrát i vlastní analyzátor YSI 2300 a bylo provedeno srovnání výsledků stanovení glukózy pomocí hexokinázové metody a tohoto elektrochemického systému. Grafy dokazují naprostou shodu obou metod.

Častým problémem bývá různá verze testovacích proužků dodávaných do východní a západní Evropy, takže je není možné použít v dodaných glukometrech. Některé šarže testovaných proužků poskytují signifikantně odlišné výsledky měření. Proto je nezbytné vždy vydávat výsledek hodnocení nejen pro daný glukometr, ale také pro šarži testovacích proužků.

P-10

Testování volné cirkulující nukleové kyseliny v krevní plazmě

Testing free circulating nucleic acids in blood plasma

Beránek M., Totzauerová K., Vaňková R., Palička V.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové, Lékařská fakulta UK v Hradci Králové a Farmaceutická fakulta UK v Hradci Králové

e-mail: beranek@lfhk.cuni.cz

Cíl práce: Cílem této práce bylo porovnat různé komerčně dostupné soupravy pro izolaci volné cirkulující DNA ze vzorků krevní plazmy a vyhodnotit získané extrakty na základě optických charakteristik, výsledků real-time PCR a detekce krátkých a dlouhých fragmentů DNA na elektroforetickém gelu.

Metody: Pro porovnání extrakčních metod byly zvoleny celkem čtyři komerčně dostupné soupravy pro manuální extrakci: QIAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen), NucleoSpin Plasma XS (Macherey-Nagel), QIAmp DSP Virus Spin Kit (Qiagen) a Agencourt Genfind v2 (Beckman Coulter). DNA byla izolována z alikvotů směsné plazmy o objemu 700 µl. Následně proběhla spektrofotometrie (Nanodrop ND 1000), fluorimetrie (Qubit dsDNA HS Assay), real-time PCR (souprava gb Genetic Human DNA, Generi Biotech, přístroj Rotorgene 6000) a fragmentační analýza (ABI 3130) vzorků obohacených o GeneScan 500 LIZ Dye Size Standard (Life Technology).

Výsledky: Nejlepší výtěžnost a čistotu poskytla souprava QIAmp DSP Virus Spin Kit s průměrnou hodnotou koncentrace DNA stanovené při PCR 49,9 ng/ml, nicméně fragmentační analýza prokázala významné ztráty fragmentu DNA o délce 75 bp. Souprava NucleoSpin Plasma XS Kit s koncentrací 39,8 ng/ml dokázala vyextrahovat všechny fragmenty přítomné v referenčním materiálu v náležitém poměru. Souprava DNA Blood Mini Kit měla výtěžky výrazně nižší (15,9 ng/ml), souprava Agencourt vykazovala při extrakci výrazné ztráty krátkých fragmentů (75-200 bp) při výtěžku 31,4 ng/ml.

Závěr: Souprava NucleoSpin Plasma XS Kit jako jediná byla schopna extrahovat všechny fragmenty DNA, včetně fragmentů krátkých (75-200 bp). Z tohoto důvodu se jeví jako nejvhodnější pro další experimentální práci. Umožňuje extrakci DNA z 200-800 µl plazmy, aniž muselo dojít k zásadním úpravám pracovního protokolu.

Práce byla podpořena grantem SVV 260057/2014 a projektem PRVOUK P37 UK Praha.

P-11

Vliv transportu potrubní poštou na cytobiochemické a spektrofotometrické vyšetření mozkomíšního moku

Influence of pneumatic tube system transport on cytochemical and spectrophotometric parameters of cerebrospinal fluid

Brož P., Rajdl D., Ženková J., Petříková V.

Ústav klinické biochemie a hematologie FN Plzeň

e-mail: brozp@fnplzen.cz

Je známa nutnost včasného zpracování mozkomíšního moku zaslaného na cytobiochemické a spektrofotometrické (SPFM) vyšetření. Cílem bylo porovnat vliv transportu mozkomíšního moku pomocí potrubní pošty (PP) a zdravotnického personálu (ZP), zejména čas nutný k doručení do laboratoře, základní cytobiochemické parametry a SPFM vyšetření.

Zařazeno bylo 38 vzorků mozkomíšního moku. Sledována byla doba od odběru nutná k doručení vzorků do laboratoře, stanoven počet erytrocytů a leukocytů včetně diferenciace, stanovena proteinorachie, glykorachie a laktát, zhodnocen trvalý cytologický preparát. Bylo provedeno SPFM vyšetření se stanovením net oxyhemoglobin absorbance (NOA) a net bilirubin absorbance (NBA).

Vzorky zaslané pomocí PP dorazily do laboratoře rychleji než vzorky transportované pomocí ZP–v průměru 28 min (4-110) v případě PP, 38 min (10-153) v případě ZP.

Nedošlo k poklesu počtu leukocytů: PP–163/µl (1-2900), ZP–135/µl (1-2899), ani ery: PP–7364/µl (0-148480), ZP–7193/µl (0-148840), obdobně při základním biochemickém vyšetření, CB: PP–0,84 g/l (0,18-4,3), ZP–0,89 g/l (0,19-4,44), glykorachie: PP–3,97 mmol/l (2,42-5,94), ZP–3,7 mmol/l (2,4-7,1), laktát: PP–2,5 mmol/l (1,1-5,5), ZP–2,5 mmol/l (1,1-5,7) ani při SPFM vyšetření–NOA: PP–0,1 (0,001-0,95), ZP–0,098 (0,001-0,95), NBA: PP–0,033 (0,001-0,28), ZP–0,031 (0,001-0,23). Při hodnocení trvalého cytologického preparátu nebyly zaznamenány žádné rozdíly.

Transport mozkomíšního moku PP nevedl ke klinicky významné změně rutinně hodnocených cytobiochemických parametrů ani parametrů hodnocených při SPFM vyšetření.

Podpořeno projektem MZ ČR-RVO (FNPl,00669806).

P-12

Výsledky sledování indikátorů kvality preanalytické fáze v České republice versus Evropa

Monitoring the indicators of preanalytical phase

Bunešová M., Moravcová L.

ÚLCHKB 2. LF UK a FN Motol, Praha

e-mail: Martina.bunesova@fnmotol.cz

V ČR je 330 biochemických laboratoří a 10.000.000 obyvatel; denně se průměrně provede 20 výkonů na jednoho obyvatele. Z toho plyne, že kvalita preanalytické fáze se dotýká každého z nás. Jedna z prvních prací v ČR o preanalytické fázi byla vydána formou encyklopedie laboratorní medicíny v r. 2005. Tato kniha se podrobně zabývá biochemickými analyty a u každého jsou vyjmenovány podmínky preanalytiky, za kterých je možno analyt zpracovat. Tato kvalita byla sledována, ale důsledně je dokumentována až po zavedení ČSN ISO 15 189 do praxe. Byla vytvořena pracovní skupina složená z lékaře, analytika a laboranta, která vytvořila dokument Doporučení k převzetí biologického materiálu klinickou laboratoří. Východiskem byla ČSN ISO 15 189, aktuální informace z literatury pojednávající o preanalytické fázi a informace www.specimencare.com. Pilotní studie analýz počtu a druhu neshod, v oblasti přijetí (odmítnutí) biologického vzorku, byla provedena v laboratořích tří českých fakultních nemocnic.

Typická frekvence odmítnutých vzorků se pohybovala kolem 0,5 %. Nejčastěji se vyskytovaly případy nedodaných vzorků nebo žádanek (téměř 60 % všech chyb). Počet identifikačních chyb se pohyboval kolem 5 %. Práce uvádí porovnání výsledků sledování indikátorů kvality v ČR a v ostatních evropských zemí.

Na kongresu EFLM v Portu v březnu 2015 byly součástí programu referáty národních zástupců o stavu sledování preanalytické fáze v evropských zemích. Jednalo se o 14 referátů z 18 zemí (Skandinávie referovala souhrnně). Jednou ze zemí, které seznámily ostatní Evropu s aktuálním stavem preanalytiky, byla i Česká republika. Ze všech referátů shodně vyplynula potřeba používání indikátorů kvality preanalytiky a jejich harmonizace v Evropě a vytvoření programů EHK preanalytické fáze.

P-13

Deficit galaktokinázy a stanovenie galaktitolu na Slovensku

Galactokinase deficiency and galactitol determination in Slovakia

Ferenczy V., Behúlová D., Šebová C., Zahorcová M., Gerinec A., Tomčíková D., Bzdúch V.

Centrum dedičných metabolických porúch OLM;

Klinika detskej oftalmológie; 1.detská klinika, Detská fakultná nemocnica s poliklinikou Bratislava

e-mail: viktoria.ferenczy@gmail.com

Galaktitol je alkohol, ktorý vzniká redukciou galaktózy. Pri geneticky podmienenom deficite galaktokinázy (GALK) sa hromadí v organizme a jeho účinkom dochádza v očných šošovkách k rýchlemu vývoju katarakty. Začiatkom roku 2015 sa na Slovensku podarilo zaviesť stanovenie galaktitolu metódou plynovej chromatografie s hmotnostnou spektrometriou (GC-MS). Cieľom práce bolo prezentovať pacienta, u ktorého GC-MS analýza galaktitolu v moči umožnila promptnú diagnostiku deficitu GALK.

Vo veku 2 mesiacov matka spozorovala u chlapca „zášklby očí“ a v 5. mesiaci „biele zreničky“. Ako 8mesačný (február 2015) bol prijatý s horizontálnym nystagmom a kataraktou obojstranne na operáciu. V rámci diferenciálnej diagnostiky katarakty sa urobili metabolické vyšetrenia. V suchej kvapke krvi dominovala extrémna hypergalaktozémia >5,0 mmol/l (RH<0,2) a zachytila sa aj výrazná hypergalaktozúria 5,38 mmol/mol krea (RH<0,38). Následné stanovenie galaktitolu v moči odhalilo masívne zvýšenú exkréciu 18 672 mmol/mol krea (RH<90). Klinický priebeh a biochemický nález boli typické pre deficit GALK. Na cielenú DNA analýzu sa odoslala vzorka krvi.

Pacient je prvým zachyteným prípadom deficitu GALK na Slovensku. K detekcii veľmi zriedkavého ochorenia významne prispela dostupnosť rýchlej a jednoduchej GC-MS analýzy galaktitolu v moči. Metóda bude slúžiť pacientom z celej krajiny na diagnostiku a monitorovanie dedičných porúch metabolizmu galaktózy.

Práca vznikla vďaka podpore v rámci OP Výskum a vývoj pre dopytovo-orientovaný projekt: UVP UK v Bratislave, ITMS 26240220086 spolufinancovaný zo zdrojov EFRG.

P-14

iFABP jako potenciální marker poškození tenkého střeva v průběhu resekce tlustého střeva

iFABP as a potential markers of small bowel damage after large intestine resection

Hyšpler R., Tichá A., Svobodová I., Kaška M., Drahošová M., Zadák Z.

Centrum pro výzkum a vývoj, Chirurgická klinika, Ústav klinické imunologie a alergologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: radomir.hyspler@fnhk.cz

Intestinální cytosolický protein vázající mastné kyseliny (iFABP) umožňuje vazbu a transport mastných kyselin v cytosolu k různým buněčným organelám. Lze předpokládat, že iFABP by mohl sloužit jako marker nekrózy významné části enterocytů. Dysfunkce gastrointestinálního traktu u kriticky nemocných nebo pacientů po operaci je spojena s horší prognózou a vhodný marker střevního poškození stále není k dispozici. Cílem této studie bylo vyhodnotit plazmatický iFABP v kohortě pacientů po resekci tlustého střeva pro maligní onemocnění jako modelu poškození tenkého střeva.

Metody: Hodnocenou skupinu tvořilo 117 pacientů (věk 66 ± 9,4 let; BMI 26,9 ± 4,7 kg/m2) podstupujících resekci tlustého střeva pro kolorektální karcinom. Plazmatický iFABP byl stanovován metodou ELISA. Vzorky byly odebírány před operací (den -1) a denně po dobu 5 dní po operaci (den 0 až den 4). Data byla statisticky vyhodnocena pomocí softwaru SigmaStat, test ANOVA. Data jsou prezentována jako medián a interkvartilové rozpětí.

Výsledky: Byly nalezeny následující hodnoty plazmatické koncentrace iFABP (ng/l): den -1: 417,9 (232,3; 748,3), den 0: 583,15 (318,7; 956,1), den 1: 462,8 (292,3; 762,3), den 2: 367,8 (192,3; 563,4), den 3: 269,8 (163,2; 432,6), den 4: 284,6 (143,2; 519,9). Signifikantní rozdíly byly v koncentracích pooperačně (den 0) v porovnání s předoperačním odběrem (den -1) a pooperačními hodnotami (den 1-4).

Závěr: Plazmatická koncentrace iFABP se zdá být citlivým markerem poškození enterocytů zvláště pokud je vyhodnocena jako změna proti bazální hodnotě.

Podpořeno projektem IGA MZ ČR NT13536-4/2012.

P-15

Analýza galaktitolu a sacharidů v moči pomocí GC/MS

Analysis of urinary galactitol and saccharides by GC/MS

Jáčová J., Bekárek V., Friedecký D., Hlídková E., Petrželová S., Adam T.

OKB, FN Olomouc a UMTM, LF UP Olomouc

e-mail: Jaroslava.jacova@gmail.com

Cíl studie: Cílem studie bylo vyvinout metodu pro stanovení galaktitolu a sacharidů v moči pomocí GC/MS. V rutinní LC/MS metodě dochází často při stanovení galaktitolu k interferencím manitolem a sorbitolem, které vykazují identické separační a MS vlastnosti. Zatímco TLC je kvalitativní metoda často poskytující při analýze sacharidů nejednoznačný, obtížně interpretovatelný profil.

Metody: Vzorky byly dvojstupňově derivatizovány pomocí TMSI a BSTFA. Pro kvantifikaci byly použity interní standardy 13C6-galaktitol a 13C6-galaktóza. Vzorky byly analyzovány na GC Trace Ultra / MS DSQII (Thermo Scientific). Separace byla provedena na koloně ZB-5 (30 m; 0,25 mm; 0,25 µm) při průtoku helia 0,5 ml/min. Počáteční teplota teplotního programu byla 180 °C, teplotní rampa 1 °C/min. Byl použit split/splitless inlet (250°C), splitovací poměr 1:10, objem nástřiku 2 µl. Kvadrupól pracoval v režimu full scan (m/z 50-480) při frekvenci 1,35 Hz.

Výsledky: Byly stanoveny analytické znaky metody stanovení galaktitolu. Metoda je lineární v rozsahu 0-1000 µmol/l (r²=0,9988) při opakovatelnosti v sérii (CV < 2,03 %) a mezi sériemi (CV < 2,84 %) a LOQ = 0,48 µmol/l. Metoda byla ověřena na vzorcích pacientů s galaktosemií. Dále byly stanoveny retenční a fragmentační charakteristiky jednotlivých sacharidů pro identifikaci sacharidů u pacientů s nejasnými TLC profily. Metoda při použití 13C6-galaktózy umožňuje také kvantifikaci sacharidů.

Závěr: Byla vyvinuta přesná a robustní GC/MS metoda pro stanovení galaktitolu v moči, která zároveň slouží k identifikaci a kvantifikaci sacharidů v moči.

Poděkování: „Podpora vytváření excelentních výzkumných týmů a intersektorální mobility na Univerzitě Palackého v Olomouci“ č. CZ.1.07/2.3.00/30.0004

P-16

Stanovení manganu a selenu v mozkomíšním moku u dětských a dospělých pacientů

Investigation of manganese and selenium in cerebrospinal fluid of children and adults

Kotaška K., Jiráková L., Pospíšilová R., Franěk T., Průša, R.

Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN v Motole, Praha

e-mail: kotaska@email.cz

Cíl studie: Selen a mangan patří mezi stopové prvky účastnící se řady významných biochemických dějů. Cílem práce bylo stanovit koncentrace Se a Mn v mozkomíšním moku pacientů s onkologickými a neurologickými onemocněními.

Metody: Ke stanovení byla využita elektrotermická atomová absorpční spektrometrie se Zeemanovou korekcí. Selen byl stanovován při vlnové délce 196 nm, vlnová délka pro stanovení manganu byla 279,5 nm. Pro selen byla stanovena mez detekce 2,9 µg/l a pro mangan 0,26 µg/l. Celkem bylo vyšetřeno 73 pacientů (31 žen, 42 mužů, průměrný věk 14,1 let). Pacienti byli rozděleni do skupin podle věku (56 dětí a 17 dospělých) a podle typu onemocnění (onkologická onemocnění a neurologická onemocnění). Kontrolní skupina byla tvořena 18 jedinci (5 žen, 13 mužů, průměrný věk 21,7 let) s ostatními onemocněními (traumatická poranění, ileus, pneumonie).

Výsledky: Byly nalezeny vyšší koncentrace selenu v likvoru v kontrolní skupině oproti pacientům s neurologickými onemocněními (medián = 14,4 µg/l vs. 12,4 µg/l, p < 0,05). Vyšší hladiny manganu v likvoru byly zaznamenány u dětí s onkologickými onemocněními v porovnání s kontrolní skupinou pacientů (1,2 µg/l vs. 0,5 µg/l, p < 0,05).

Závěr: Koncentrace manganu a selenu v mozkomíšním moku jsou zvýšené u dětských i dospělých pacientů se závažným onkologickým nebo neurologickým onemocněním.

P-17

Role proteinu ACBD3 v mitochondriálním energetickém metabolismu

Role of ACBD3 protein in mitochondrial energy metabolism

Kratochvílová H., Rodinová M., Stránecký V., Marková M., Vondráčková A., Sládková J., Honzík T., Hansíková H., Zeman J.,Tesařová M.

Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze; Ústav dědičných metabolických poruch, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, Česká republika.

e-mail: hana.kratochvilova@lf1.cuni.cz

Pomocí sekvenování nové generace byla nalezena homozygotní mutace c.460A>G v genu ACBD3 u pacientky s kombinovaným defektem komplexů systému oxidativní fosforylace. Gen ACBD3 kóduje acyl-coenzyme A binding domain containing 3 protein (60 kDa), který je lokalizovaný v Golgiho aparátu, endoplazmatickém retikulu a v mitochondrii. Protein ACBD3 hraje důležitou roli v mnoha buněčných procesech (lipidový metabolismus, membránový transport, embryogeneze, steroidogeneze, apoptóza, atd.). V mitochondriích je ACBD3 protein přítomný v komplexu (140-200 kDa) zajišťující transport cholesterolu do organely. Další součástí tohoto komplexu je protein VDAC, který ve vnější mitochondriální membraně tvoří prostupné póry, asociuje s proteinem ANT (adenine nukleotidový transporter) lokalizovaným ve vnitřní mitochondriální membráně. ANT neboli ADP/ATP přenašeč kontroluje dostupnost adeninových nukleotidů potřebných pro udržení správné struktury mtDNA.

Cílem této studie bylo charakterizovat dopad stabilně utišené exprese proteinu ACBD3 v HEK293 buňkách na biogenezi a funkci komplexů systému oxidativní fosforylace se záměrem objasnit roli tohoto proteinu v patogenezi defektního fenotypu.

První výsledky naznačují, že deficit proteinu ACBD3 vede ke snížení nativního množství a aktivity komplexu IV a snížení množství vybraných podjednotek komplexu IV.

Studie byla podpořena výzkumnými granty GAUK 1308214, IGA NT /13114-4, RVO-VFN64165/2012 a SVV UK 260148/2015.

P-18

Hodnocení možného přínosu vyšetření Hevylite u mnohočetného myelomu s lehkými řetězci (LCMM)

Analysis of potential contribution of Hevylite assessment in light-chain only multiple myeloma

Lochman P., Ščudla V., Pika T., Minařík J.

OKB FN Olomouc; Hematoonkologická klinika FN Olomouc

e-mail: pavel.lochman@fnol.cz

Úvod: Stanovení imunoglobulinů podle typu lehkého řetězce (HLC) je slibnou metodou v diagnostice mnohočetného myelomu (MM) a v hodnocení hloubky léčebné odpovědi u MM.

Cíl: Účelem této studie je zhodnocení vztahu mezi délkou přežití a hladinami izotypů HLC u mnohočetného myelomu s lehkými řetězci (LCMM).

Materiál a metody: Anylýza sér byla provedena soupravami Hevylite™ pro třídy IgG, IgA a IgM u 31 pacientů s LCMM.

Výsledky: V celé kohortě byly nalezeny tyto vztahy: pro sérové IgG-kappa (cut-off 2,62 g/l) jsme nalezli významný vztah mezi celkovým přežitím (OS) (23,6 vs 58,4 měsíců, p=0,046) i přežitím bez progrese (PFS) (12,7 vs. NR; NR=nedosaženo). Pro IgA-lambda (0,18 g/l) byly nalezeny významné rozdíly v křivkách přežití pro PFS i OS a pro IgM-kappa (0,99 g/l) byly nalezeny rozdíly v křivkách přežití pro OS.

Ve skupině kappa jsme nalezli rozdíly mediánů a křivek přežití v případě IgA-kappa (0,22 g/l) pro PFS a OS, IgA-lambda (0,16 g/l) pro PFS (10,4 vs. NR, p=0,04) a OS a u IgM-kappa (cut-off 0,1 g/l) pro OS. Ve skupině lambda jsme nalezli rozdíly v případě IgG-lambda (1,76 g/l) pro OS a u poměru IgG-kappa/IgG-lambda (1,81) pro PFS, v případě IgA-kappa (0,13 g/l) pro PFS i OS, v případě IgA-lambda (0,20 g/l) pro PFS i OS, v případě poměru IgA-kappa/IgA-lambda (1,1) pro PFS i OS a u poměru IgM-kappa/IgM-lambda (1,5) pro PFS i OS (23,3 vs. 58,4; p=0,029).

Závěry: Naše předběžná analýza ukazuje potenciální přínos analýzy sérových HLC včetně jejich poměrů pro hodnocení PFS a OS i u onemocnění jako je LCMM.

Podpořeno z grantu IGA NT 12451/5.

P-19

Vyšetření DNA v mateřské plasmě u těhotenství dosažených metodami asistované reprodukce

Maternal plasma DNA testing for aneuploidy in pregnancies achieved by assisted reproductive technologies

Loucký J., Lambert-Messerlian G., Kloza M. E., Williams J., O’Brien B., Wilkins-Haug L., Mahoney J. M., De Biasio P., Borrell A., Ehrich M., Van den Boom D., Bombard T. A., Deciu C., Palomaki E. G.

IMALAB s.r.o. Medical Laboratories, Zlin, Czech Republic; Department of Pathology and Laboratory Medicine, Women and Infants Hospital and the Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI; Department of Obstetrics and Gynecology, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles; Prenatal Diagnostic Center, Department of Obstetrics and Gynecology, Women and Infants Hospital and the Alpert Medical School of Brown University, Providence, RI; Department of Obstetrics and Gynecology, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA; Department of Genetics, Yale University, New Haven, CT; Istituto G. Gaslini, Genova, Italy; Hospital Clinic Barcelona, Barcelona, Catalonia, Spain; Sequenom, Inc., San Diego, CA; Sequenom Center for Molecular Medicine, San Diego, CA.; Ústav klinické biochemie a patobiochemie UK 2. LF a FN Motol, Praha

e-mail: loucky@imalab.cz

Neinvazivní prenatální testování (NIPT) využívá masivní paralelní sekvenování volné fetální DNA (cfDNA) z krve matky pro přesnou detekci chromozomálních vad.

Cílem naší práce bylo srovnání obsahu mimobuněčné fetální DNA (cffDNA) u těhotenství vzniklých přirozeným způsobem a u těhotenství dosažených metodami asistované reprodukce. V obou skupinách byly porovnávány jak výsledky získané u nepostižených plodů, tak u plodů s prokázaným Downovým syndromem.

Při vyhodnocení výsledků nebyly zjištěny rozdílné hodnoty obsahu cffDNA, celkové cfDNA, nebo fetální frakce v závislosti na metodě početí. Bylo zjištěno systematické snížení z-skóre u chromozomů 21, 18 a 13 u těhotenství vzniklých metodami asistované reprodukce, ve srovnání s těhotenstvími vzniklými spontánně.

P-20

Stanovení iohexolu jako ukazatele glomerulární filtrace

Determination of iohexol as a marker of glomerular filtration

Malínská H., Kazdová L., Štollová M., Teplan V.

Centrum experimentální medicíny, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha

e-mail: haml@ikem.cz

Úvod: Měření rychlosti glomerulární filtrace GFR (glomerular filtration rate) je nejvhodnějším ukazatelem funkce ledvin. Znalost této hodnoty je zásadní pro diagnostiku, klasifikaci, vedení léčby i sledování vývoje onemocnění. Rovnice založené na endogenních markerech filtrace (cystatin-C, kreatinin) jsou zatížené omezenou přesností a reprodukovatelností. Naproti tomu přímé měření využívá měření plazmatické nebo močové clearance „ideálního“ markeru filtrace, který by měl být volně filtrován v glomerulu a neměl by být resorbován, metabolizován, syntetizován ani vylučován ledvinami. Vedle stanovení inulinu, jehož močová clearance je stále považována za zlatý standard pro měření GFR, jsou hledány další metody pro stanovení plazmatické clearance. Jednou z látek, které se zdají být vhodné pro měření GFR, je iohexol.

Cíl: Cílem studie bylo zavést a ověřit přesnost metody stanovení iohexolu v séru/plazmě a moči pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie.

Metodika a výsledky: Pro stanovení iohexolu byla použita kolona s obrácenou fází C18 (3,9 x 250 mm, Phenomenex) a mobilní fází, která obsahovala A-0,1 % trifluorooctovou kyselinu a B-metanol v poměru 95:5, pH=2,2; průtok 1,2 ml/min. Iohexol byl detekován při 254 nm a jako vnitřní standard byla použita para-amino-hippurová kyselina. Kalibrační křivka byla stanovena v rozsahu 20-300 µg/ml. Výhodou metody měření GFR pomocí iohexolu je větší stabilita vzorků, nevýhodou pak větší finanční náročnost stanovení.

Závěr: Metoda umožňuje stanovení iohexolu dostatečně selektivně a s dobrou přesností a správností metody. V dalším kroku bude nutné tuto metodu porovnat s clearancí inulinu i vypočítanými rovnicemi při vyšetření glomerulární filtrace.

Podpořeno grantem P305/13-04420S a MZ ČR-RVO 0023001.

P-21

Kolorimetrický a voltametrický průkaz peroxidázové aktivity magnetických částic: základní platforma pro konstrukci peroxidázových biosenzorů

Colorimetric and voltammetric demonstration of peroxidase-like activity of magnetic particles: basic platforms for peroxidase biosensors

Martinková P., Pohanka M.

Fakulta vojenského zdravotnictví v Hradci Králové, Univerzita obrany v Brně

e-mail: PavlaMartinkova@seznam.cz

Biosenzory, v nichž je užívána křenová peroxidáza (KP) jako rekogniční nebo podpůrný prvek, jsou hojně využívány při stanoveních H₂O₂, alkoholu, dopaminu, aminofenolů a glukózy. Bohužel má KP řadu nevýhod jako je ztráta enzymatické aktivity v průběhu imobilizace enzymu. Z toho důvodu bylo cílem našeho výzkumu prokázat pseudo-peroxidázovou aktivitu magnetických částic (MČ), které by mohly nahradit KP v konstrukci biosenzorů.

Peroxidázová aktivita MČ byla měřena pomocí spektrofotometrie, square wave voltametrie a cyklické voltametrie. Opticky byla měřena koncentrační řada H₂O₂, který byl v jamce mikrotitrační destičky přidán ke směsi chromogenu a MČ a z průměrné absorbance za minutu byla sestrojena koncentrační křivka. Voltametricky byla měřena koncentrační řada H₂O₂, který byl spolu se sodno-acetátovým pufrem aplikován na uhlíkovo-platinovou elektrodu. Stejnými postupy byla změřena i koncentrační řada H₂O₂ za použití KP. Z koncentračních řad byly spočítány hodnoty Michaelisovy konstanty (Km) jak pro MČ tak pro KP. Hodnoty Km se při použití MČ jako katalyzátoru pohybovaly v rozmezí 157 až 199 mmol/l v závislosti na použité metodě. Hodnota Km pro KP se u spektrofotometrie výrazně snížila na 25 mmol/l, u voltametrických metod došlo též k nepatrnému snížení na 167 a 163 mmol/l. Vzhledem k faktu, že koncentrační řady reakcí, které byly katalyzovány MČ, korelovaly s Michaelisovou křivkou nejméně z 99,7 %, můžeme zhodnotit MČ za katalyzátor s pseudo-peroxidázovou aktivitou.

P-22

Vybrané parametry oxidačního poškození DNA u pacientů s těžkými popáleninami

Selected parameters of oxidative DNA damage in patients with severe burns

Matejovičová M., Hlaváčová M., Lipový B., Novotná L., Paulová H.

Biochemický ústav LF MU Brno; Klinika popálenin a rekonstrukční chirurgie FN Brno

e-mail: hlavacova@med.muni.cz

Cílem práce bylo sledovat změny úrovně poškození DNA v průběhu rozvoje popáleninové nemoci pacientů se závažnými a kritickými popáleninami.

Mimo jiných efektů má na celkový stav organismu negativní vliv i zvýšený oxidační stres, provázející popáleninové trauma. Poškození buněk imunitního systému v důsledku oxidačního stresu, hodnocené kometovou analýzou, může přispívat k rozvoji imunosuprese a SIRS u těchto pacientů, což jsou hlavní příčiny infekčních komplikací u popáleninových traumat. A dále, stanovení 8-hydroxy-2-deoxyguanozinu (8OHdG) v moči jakožto produktu degradace odráží celkovou míru oxidačního poškození DNA v organismu pacienta.

Do pilotní studie bylo zahrnuto 10 pacientů se závažnými popáleninami (podle Abbreviated Burn Severity Index). Vzorky krve a moči byly odebrány ihned po přijetí, následně pak 2.-5. a 6.-8. den. Pro stanovení hladiny 8OHdG v moči slouží metoda HPLC s elektrochemickou detekcí. Míra poškození DNA lymfocytů byla stanovena pomocí kometové analýzy a je předmětem této pilotní studie. Je to metoda založená na elektroforéze jaderné DNA jednotlivých buněk v agarózovém gelu. K anodě putují fragmenty poškozené DNA tvořící „ohon“ komety. Po vizualizaci bylo k posouzení poškození DNA v jednotlivých buňkách hodnoceno procentuální zastoupení obarvené DNA v ohonu a poté bylo provedeno rozdělení buněk do kategorií dle procenta poškození DNA.

Lze shrnout, že s rozvojem popáleninové nemoci stoupala střední hodnota poškození DNA, přičemž časový profil a počet buněk v kategoriích podle intenzity poškození je ovlivněn biologickou variabilitou v závislosti na klinickém stavu jednotlivých pacientů.

Práce byla podpořená grantem MUNI/A/1195/2014.

P-23

Zvýšená exprese mRNA biliverdinreduktázy A v játrech a periferních leukocytech u pacientů s hepatocelulárním karcinomem podmíněným HCV infekcí

Upregulated biliverdin reductase A mRNA expression in HCV-associated hepatocellular carcinoma in the liver and peripheral blood leukocytes

Matoušová L.¹, Kubíčková K.², Urbánek P.², Vítek L.^1,3, Zima T.¹, Subhanová I.¹

¹Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK Praha, ² Interní klinika ÚVN a 1. LF UK Praha, 3 4. Interní klinika VFN a 1. LF UK Praha

e-mail: matousovalinda@seznam.cz, iva.subhanova@seznam.cz

Cíl studie: Spolehlivé markery časné diagnostiky hepa-tocelulárního karcinomu (HCC) nejsou dosud známy. Byla popsána zvýšená exprese biliverdinreduktázy A (BLVRA) v jaterní tkáni pacientů s infekcí virem hepatitidy C (HCV) (De Giorgi 2013). Cílem naší studie bylo stanovit expresi mRNA BLVRA v jaterní tkáni a periferních leukocytech (PBL) pacientů s HCC u chronické HCV infekce a korelovat expresi mRNA BLVRA mezi jaterní tkání a PBL.

Metodika: Analyzovali jsme expresi mRNA BLVRA v jaterní tkáni a PBL u 36 pacientů s chronickou HCV infekcí (30 bez HCC, 6 s HCC podmíněným HCV) a v PBL 30 zdravých kontrol. Exprese mRNA BLVRA byla stanovena metodou Real Time RT-PCR (ViiA 7, Life Technologies).

Výsledky: Prokázali jsme významně zvýšenou expresi mRNA BLVRA v jaterní tkáni pacientů s HCV infekcí s/bez HCC (1,41 ± 0,19 vs. 0,56 ± 0,36; p<0,001). Rozdílná exprese mRNA BLVRA byla rovněž v PBL stejného souboru pacientů (1,11 ± 0,15 vs. 0,88 ± 0,31, p=0,03) a mezi HCV infikovanými pacienty s HCC a skupinou HCV negativních kontrol (1,11 ± 0,15 vs. 0,80 ± 0,21; p<0,01).

Závěr: Naše data prokazují, že ke zvýšené expresi mRNA BLVRA dochází v jaterní tkáni i v krvi pacientů s HCC a naznačují, že BLVRA by mohla hrát významnou roli v procesu karcenogeneze u HCV pozitivních pacientů.

Studie byla podpořená grantem IGA MZ CR NT/13092-4

P-24

Významné změny O-glykosylace sérového apolipoproteinu C-III u pacientů s dědičnými poruchami metabolizmu glykogenu

Changes in O-glycosylation of serum apolipoprotein C-III in patients with glycogen storage diseases

Ondrušková N., Honzík T., Kolářová H., Poupětová H., Zeman J., Hansíková H.

Klinika dětského a dorostového lékařství, Ústav dědičných metabolických poruch, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze

e-mail: ondruskova.nina@gmail.com

Glykogenózy (GSD) jsou vzácnou skupinou dědičných metabolických poruch s odhadovanou incidencí 1:40 000, které charakterizuje patologický nález abnormální struktury glykogenu, jeho nadměrné ukládaní nebo naopak deficit. Mezi typické biochemické nálezy patří hypoglykemie, hyperlaktacidemie, hyperlipidemie, hyperurikemie a metabolická acidóza. Nedávné studie ukázaly, že hladina a míra glykosylace apolipoproteinu C-III (ApoC-III), který je významnou součástí lipoproteinových částic, se může měnit u některých chorob spojených se změněným profilem lipidů jako např. metabolický syndrom nebo diabetes.

Cíl studie: analyzovat spektrum sialovaných forem ApoC-III v souboru pacientů s GSD, který obsahoval 24 jedinců s potvrzenou diagnózou glykogenózy (2x typ 0, 3x Ia, 2x Ib, 6x II, 6x III, 1x VI, 4x IX) a 4 jedince s klinickým podezřením na GSD.

Metody: Sérum bylo separováno pomocí isoelektrické fokusace (pH 3.5-5) na přístroji PhastSystem (GE Health-care), poté byly proteiny přeneseny na nitrocelulózovou membránu při 60 °C a značeny protilátkou proti ApoC-III. Chemiluminiscenční signál byl kvantifikován denzitometricky pomocí programu Quantity-One (Bio-Rad).

Výsledky: U všech analyzovaných typů GSD, kromě typu II a VI, byla detekována hypoglykosylace ApoC-III definovaná relativně sníženou disialo- [2], zvýšenou monosialo- [1] a/nebo zvýšenou asialo- [0] formou ApoC-III. Nejvýznamnější změny byly nalezeny v skupině GSD typu III (průměrné hodnoty: 20,7 % [2], 66,9 % [1], 12,5 % [0] vs. ref. rozmezí 43,4 % [2], 53,3 % [1] a 3,3 % [0]).

Závěr: U pacientů s GSD typem 0, Ia, Ib, III a IX byla nalezena mírná až výrazná hyposializace sérového ApoC-III, která s největší pravděpodobností může souviset s aktuální hladinou triacylglycerolů v plasmě a/nebo se změnami v hladinách metabolitů v důsledku primárního onemocnění GSD.

Podporováno: IGA MZ CR NT-12166, RVO-VFN64165 a SVV UK 260148/2015.

P-25

Analýza močových konkrementů rastrovací elektronovou mikroskopií

Scanning electron microscopy in analysis of urinary stones

Racek J., Racek M., Hupáková I.

Ústav klinické biochemie a hematologie LF UK a FN Plzeň; Ústav petrologie a strukturní geologie, PřF UK Praha

e-mail: racek@fnplzen.cz

Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) je užívaná pro studium pevných vzorků materiálů a hornin. V poslední době se objevila i její aplikace na vyšetření močových kamenů. Cílem studie bylo zhodnotit vyšetření močových kamenů metodou SEM ve srovnání s tradičními metodami analýzy.

SEM umožňuje určit složení vzorku několika způsoby. Pozorováním vzorků při velkém zvětšení s detekcí sekundárních a zpět odražených elektronů je možné rozpoznat krystalické fáze podle charakteristického tvaru krystalů a rozdílu v jejich střední atomové hmotnosti. V kombinaci s energeticky disperzní spektroskopií (EDS) rtg spekter vyzařovaných vzorkem podává semikvantitativní informaci o chemickém složení vzorku. U leštěných tenkých řezů je možné získat informaci o vnitřní struktuře a zonalitě vzorku. Vyšetřili jsme 20 močových kamenů, reprezentujících nejčastější typy. Výsledky byly srovnány s analýzou tradičními metodami (chemickou analýzou, mikroskopií v polarizovaném světle a IR spektroskopií).

Srovnávací studie ukazuje, že SEM/EDS poskytuje spolehlivé výsledky při rozlišení jednotlivých složek močových kamenů. Výhodou metody je pozorování při velkém zvětšení a velmi dobré prostorové rozlišení s ohledem na objem vzorku s možností získání informace o jeho chemickém složení. Poster ukazuje příklady typických nálezů při užití SEM/EDS, tj. tvary krystalů a semikvantitativní informaci o chemickém složení u nejběžnějších močových kamenů včetně vícesložkových.

SEM je vhodná jako doplňková metoda analýzy močových kamenů. Její předností je potřeba minimálního množství vzorku a rozpoznání i minoritní fáze. Informuje o vztahu jednotlivých fází, vnitřní struktuře a zonalitě.

Podpořeno MZ ČR-RVO (FN Plzeň-FNPl, 00669806)

P-26

Změny energetického metabolismu a ultrastruktury mitochondrií v kultivovaných kožních fibroblastech od 15 pacientů s Huntingtonovou chorobou

Disturbances in mitochondrial ultrastructure and energetic metabolism in cultivated skin fibroblasts from 15 patients wiht Huntington´s disease

Rodinová M., Spáčilová J., Kratochvílová H., Marková M., Daňhelovská T., Tesařová M., Lišková I., Klempíř J., Zeman J., Hansíková H.

Klinika dětského a dorostového lékařství, Laboratoř pro stadium mitochondriálních poruch; Neurologická klinika 1.Lf a VFN v Praze

e-mail: marie.rodinova@gmail.com

Huntingtonova choroba (Huntington´s disease, HD) je autosomálně dominantní neurodegenerativní onemocnění, způsobené zmnožením CAG tripletů (>36) v genu pro protein huntingtin (Htt). Zmnožení CAG tripletů vede ke změnám sekundární struktury a poškození funkcí Htt. V posledních letech se stále více ukazuje, že poškození Htt významně ovlivňuje mitochondriální metabolismus buněk, což zhoršuje patologický průběh onemocnění.

Cílem naší studie bylo studovat, jak HD ovlivňuje strukturu mitochondrií a mitochondriálního energetického metabolismu ve fibroblastech 15 symptomatických pacientů ve věku 22-74 let.

Mitochondriální ultrastruktura a síť byla vizualizována pomocí fluorescenční a elektronové mikroskopie. Množství komplexů dýchacího řetězce bylo stanoveno mikroimunoanalyticky (Mitosciences) a imunoelektroforeticky. Respirace byla měřena polarograficky a kapacita mitochondriálního energetického metabolismu byla stanovena s využitím radioaktivně značených substrátů.

U všech 15 pacientů byly detekovány patologické změny v ultrastruktuře mitochondrií (malé množství krist, změna tvaru) a uspořádání mitochondriální sítě v porovnání s kontrolními vzorky. Proteinová analýza ukázala snížené množství vybraných mitochondriálních proteinů (mitofilin, SDH70). Polarografie u 7 pacientů ukázala sníženou respiraci po přidání substrátu pro komplex IV dýchacího řetězce v porovnání s kontrolami.

Získané výsledky potvrzují jednak možnost využití kultivovaných kožních fibroblastů pro studium patologie HD a jednak spojení této choroby s mitochondriálním poškozením.

Podpořeno: Česko – Norským programem 7F14308, SVV UK 260148/2015, RVO-VFN 64165

P-27

Srovnání dvou ELISA kitů pro vyšetření celkového tau proteinu and beta-amyloidu

Comparation study of two ELISA kits for total tau protein and beta-amyloid

Roubalová L., Prošková J.

Oddělení klinické biochemie, FN Olomouc

e-mail: jitka.proskova@fnol.cz

Background: Currently, laboratory diagnosis of early stages of Alzheimer Disease is based on the mea-surement of triplet CSF biomarkers Total tau protein, phosporylated tau protein and beta-amyloid. The most commonly used is CE IVD INNOTEST ELISA kit (INNOGENETICS Belgie). Other analytical kits are available only for research. Now, new CE IVD Total –Tau resp. ß Amyloid (1-42) ELISA kits (EUROIMMUN, Germany) are available. The aim of the study was to compare these ELISA kits.

Methods: We compared tau protein and β-amyloid concentration in CSF between 56 resp. 65 pacients with neurogical disease with or without signs of neuronical degeneration. All analytes were measured by CE IVD kits: INNOTEST hTAU Ag resp. β-AMYOID(1-42) (INNOGENETICS N.V. Belgie) and Total–Tau ELISA resp. b-Amyloid (1-42) ELISA (EUROIMMUN, Germany). Data was processed in the MedCalc SW.

Results: Basic analytical characterictics for both ELISA kits were similar. Distribution of values for Total tau protein: median 187 ng/l (min 82, max 1329) Innogenetics resp. median 223 ng/l (min 109, max 1237) Euroimmune. Linear regression showed a good relationship, r=0.939 (P<0,0001, 95% CI 0.897– 0.964). Distribution of values for β amyloid: median 911 ng/l (min 343, max 1350) Innogenetics resp. median 705 ng/l (min 199, max 1339) Euroimmune. Linear regression showed a good relationship, r= 0.908(P<0.0001, 95% CI 0.853 – 0.943).

Conclusion: We found a good correlation between ELISA kits, which was confirmed by linear, Passing-Bablock regression and also Bland-Altman plot. The most important difference between kits is in determined reference values, however each of vendors has recommended to laboratory to obtain their own reference interval.

P-28

Výběr vhodných testů pro diagnostiku hypokortizolismu

Selection of suitable hypothalamic-pituitary-adrenal axis tests for diagnostic of hypocortisolism

Simunkova K., Duskova M., Kosak M., Krsek M., Hana V., Zanova M., Springer D.

III. Interní klinika VFN a 1. LF UK Praha, ÚLBLD VFN a 1. LF UK Praha, Endokrinologický ústav Praha

e-mail: springer@vfn.cz

Práce je součástí řešení grantu zabývajícího se výběrem nejvhodnějšího testu funkce osy hypotalamus-hypofýza-nadledviny (HPA), který by umožnil navrhnout nové diagnostické algoritmy hypokortizolismu, ale také odhalení poruchy funkce nadledvin u pacientů na estrogenové terapii nebo se změněnými hladinami kortizol vazebného proteinu (CBG).

Ke stanovení kortizolu byla využita chemiluminiscenční imunoanalytická metoda na analyzátoru ADVIA Centaur firmy Siemens. Analyzovaným materiálem byly sérum a sliny. Dále byly radioimunoanalyticky stanoveny hladiny CBG, aldosteronu a ACTH.

Součástí grantového projektu bylo i vyšetření kontrolní skupiny 66 zdravých osob ve věkovém rozmezí 19 až 68 let. Byli podrobeni inzulínovému testu (ITT) a také zatíženi vysokou (250 mg HDST), střední (10 mg MDST) a nízkou dávkou (1 mg LDST) Synacthenu.

Všichni zdraví dobrovolníci dosáhli normální odpověď kortizolu (> 500 nmol/l) nebo zvýšení o minimálně 200 nmo/l oproti bazální hodnotě kortizolu ve všech testech. Hladiny kortizolu byly významně nižší u LDST oproti zbývajícím testům a nejvyšší hladina byla pozorována v průběhu 60 minut po stimulaci. Hladiny slinného kortizolu během inzulinového testu vykazovaly u části kontrolní skupiny maximum v 90. minutě, zatímco u sérového kortizolu bylo maxima obvykle dosaženo v 60. minutě. Použití slin u tohoto zátěžového testu je jen velmi omezené. Zátěžový test s inzulinem zůstává zlatým standardem pro vyšetřování osy HPA.

Stanovení hladin CBG v kontrolní skupině umožnilo stanovit referenční intervaly pro ženy 44,5 až 123,3 nmol/l a pro muže 38,2 až 166,0 nmol/l.

Tato studie přispívá k lepšímu porozumění patofyziologie změn u poruch HPA osy.

Studie byla podpořena grantem NT11 277-6 IGA MZ ČR.

P-29

Citrulin jako marker komplikací u perioperativního poškození střeva

Citrulline as a marker of perioperative damage of intestine

Tichá A., Hyšpler R., Žaloudková L., Vašatová M., Kaška M., Zadák Z.

Centrum pro výzkum a vývoj, Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Chirurgická klinika - Fakultní nemocnice Hradec Králové

e-mail: alena.ticha@fnhk.cz

Gastrointestinální dysfunkce u pacientů v pooperační péči je sdružena s horší prognózou. Intestinální ischémie je potenciálním spouštěčem syndromu systémové zánětlivé odpovědi. Fyziologická koncentrace citrulinu je udržována rovnováhou mezi syntézou citrulinu v enterocytech a degradací na arginin v ledvinách. Cílem studie bylo vyhodnotit plazmatické koncentrace citrulinu jako markeru syntetických schopností enterocytů a vzniku pooperačních komplikací střeva.

Metody: Soubor pacientů zahrnoval 117 pacientů podstupujících resekci tlustého střeva z důvodu kolorektálního karcinomu. Bez střevních komplikací bylo 105 pacientů (66,2± 9 let, BMI: 27±9 kg/m², ASA: II 69,5 %, III 29,5 %, IV 1 %), se střevními komplikacemi bylo 12 pacientů (65±10,8 let, BMI: 26,3±3,5 kg/m², ASA: II 66,6 %, III 33,4 %). Citrulin byl stanoven metodou HPLC. Vzorky krve byly odebírány před operací (den -1) a dalších 5 dní po operaci (den 0-4). Data jsou prezentována jako medián (25 %; 75 %).

Výsledky: Stanovené hodnoty citrulinu (µmol/l) byly u pacientů bez komplikací: den -1: 34,1 (28,1; 43,7), den 0: 27,6 (22,1;35,5), den 1: 20,6 (15,5; 25,7), den 2: 21,1 (16,4; 25,1), den 3: 24,1 (19,3; 29,5), den 4: 25,4 (20,3; 32,0). U pacientů s komplikacemi: den -1: 30,45 (27,8; 47,2), den 0: 28,4 (23,0; 33,6), den 1: 18,5 (14,9; 21,8), den 2: 19 (15,5; 23,8), den 3: 18,6 (14,9; 24,5), den 4: 18,6 (14,8; 27,7). Signifikance mezi oběma skupinami byly nalezeny v pooperační den 3 a 4.

Závěr: Pooperačně byly pozorovány snížené hodnoty citrulinu a nalezeny signifikance u pacientů se střevními komplikacemi.

Podpořeno IGA MZ ČR NT13536-4/12.

P-30

Srovnání dvou přístrojů na stanovení glykovaného hemoglobinu metodou iontoměničové chromatografie

The comparision of two devices for an evaluation of a glycated haemoglobin by the method of ion exchange chromatography

Kubíčková V., Bednaříková J., Pospíšilová I.

Oddělení klinické biochemie Fakultní nemocnice Olomouc

e-mail: Veronika.Kubickova@fnol.cz

Cíl studie: Cílem studie bylo porovnat dva různé přístroje pro stanovení glykovaného hemoglobinu, které pracují na principu iontoměničové chromatografie ve vzorcích plné krve nebo hemolyzátu.

Metody: Porovnány byly přístroje Arkray Adams HA-8180V (Arkray Corporation) a D-10 (Bio-Rad). Pro srovnání bylo použito 140 vzorků plné krve (K3EDTA) v rozmezí 28 až 115 mmol/mol. Výsledky srovnání jsou prezentovány formou grafů. Bylo použito párové porovnání dvou výběrů regresní analýzou a pomocí Bland-Altmanových grafů. Dále byla pomocí firemních kontrolních materiálů stanovena mezilehlá preciznost měření obou analyzátorů a pomocí nezávislého kontrolního materiálu z EHK stanoveny bias měření.

Výsledky: Výsledky korelační analýzy prokázaly vysokou těsnost shody měření sledovaných přístrojů (korelační koeficient R2= 0,9848). Z rozdílového Bland-Altmanova grafu byly patrné vyšší hodnoty glykovaného hemoglobinu přístroje D-10 oproti přístroji Arkray Adams, a to přibližně o 10 %. Toto zjištění koresponduje i s výsledkem pozitivního bias naměřeném na nezávislém kontrolním materiálu z cyklu EHK na přístroji D-10. Průměrný bias vzorků nezávislého kontrolního materiálu EHK změřeného na přístroji Arkray Adams byl -2 %. Variační koeficient mezilehlé preciznosti měřené na přístroji Arkray Adams byl 1,3 %, a na přístroji D-10 1,1 %.

Závěr: Vzájemné porovnání výsledků glykovaného hemoglobinu přístrojů Arkray Adams HA-8180V a D-10 prokázalo dobrou srovnatelnost. Oba použité přístroje splňují požadavky pro přesné měření dle doporučení ČSKB 2015. Přístroj D-10 poskytuje oproti analyzátoru Arkray Adams HA-8180V vyšší výsledky.

P-31

Vyšetření synoviální tekutiny na oddělení klinické biochemie Thomayerovy nemocnice

Synovial Fluid Examination in Clinical Biochemistry Department of Thomayer‘s Hospital

Vítovcová M., Pavlová Z., Bořecká K.

Oddělení klinické biochemie, Thomayerova nemocnice v Praze

e-mail: miloslava.vitovcova@ftn.cz

Cíl: Souhrnný přehled výsledků mikroskopického vyšetření velkého souboru vzorků synoviální tekutiny v období od r. 2010 do současnosti.

Metodika: Zhodnocení vzhledu, stanovení počtu erytrocytů a leukocytů v Bürkerově komůrce (el/µl), zhodnocení přítomnosti krystalů pomocí polarizační mikroskopie, zhotovení cytologického preparátu (barvení May-Grünwald, Giemsa-Romanowski) u vzorků s nálezem více než 500 leukocytů/µl s následným diferenciálním rozpočtem (%) přítomných lymfocytů, monocytů a neutrofilních granulocytů při zvětšení 400x.

Cut-off hodnota pro rozlišení zánětlivého a nezánětlivého kloubního onemocnění je 2000 leukocytů/µl.

Výsledky: Ve sledovaném období bylo vyšetřeno 917 vzorků synoviální tekutiny, z toho 90 % odeslaných z Revmatologického a rehabilitačního oddělení TN. Nejčastěji se jednalo o pacienty se vstupní diagnózou gonartróza a revmatoidní artritida.

Kvantitativním hodnocením buněk bylo určeno 40 % nálezů jako nezánětlivý punktát, přičemž z tohoto souboru bylo 19 % normálních nálezů (méně než 200 leukocytů/µl), 45 % zánětlivých punktátů a 2,6 % nálezů odpovídalo parametrům pro septický punktát. 5 % punktátů bylo hemoragických.

Z krystalů se nejčastěji vyskytoval kalciumpyrofosfátdihydrát (16 %). Krystaly kyseliny močové se vyskytovaly pouze u 3 % vyšetřených punktátů, z čehož 2,6 % byly v kombinaci s kalciumpyrofosfátdihydrátem. Velmi vzácným nálezem byly krystaly cholesterolu jen v 0,6 % vyšetřených punktátů.

Je prezentována kazuistika pacientky s opakovaným nálezem krystalů cholesterolu.

Závěr: Mikroskopické vyšetření synoviální tekutiny je nedílnou součástí diagnosticko-terapeutického algoritmu artropatií. Význam má především zjištění infekční povahy kloubního onemocnění (resp. odlišení zánětlivého a degenerativního původu kloubních obtíží), diagnostika dny a chondrokalcinózy (pseudodny). Nález krystalů u krystalových artropatií umožňuje přímou diagnózu choroby.

P-32

Analytické a postanalytické parametry interference Dicynonu u metod s Trinderovou reakcí

Analytical and postanalytical parameters of Dicynone interference in methods with Trinder reaction

Wiewiorka O., Plešková V., Čermáková Z., Dastych M.

Oddělení klinické biochemie FN Brno; Biochemický ústav a Katedra laboratorních metod LF Masarykovy University, PřF Masarykovy university, Ústav Biochemie PřF Masarykovy university,

e-mail: ondrej.wiewiorka@fnbrno.cz

Cíl studie: Významná interference léku Dicynone u stanovení celé řady parametrů nás přiměla k zavedení metody pro stanovení jeho aktivní složky Etamsylátu (ETS), což nám umožní přímou korelaci mezi koncentrací léku a mírou interferencí.

Metody: Krev pacientů byla odebrána před a 15 minut po podání 500 mg intravenózní dávky Dicynonu. Vzorky byly ihned odeslány na oddělení klinické biochemie, kde byly centrifugovány. Sérum bylo alikvotováno po 400 µl. Tyto alikvoty byly uchovávány při laboratorní teplotě a zamraženy v 0, 1, 2, 4 a 8 hodinách po zpracování. Následující den byly u všech alikvotů v sérii změřeny kreatinin a triglyceridy na analyzátoru Cobas 8000 c702 (Roche) a ETS na analyzátoru DU^®-65 Spectrophotometer (Beckman Coulter).

Výsledky: Hodnoty ukazují na vzájemnou závislost koncentrace ETS a míru interference u stanovení dalších parametrů. Korelace odpovídá průměrnému snížení hodnot kreatininu o 38,1 % a triglyceridů o 14,3 %. Koncentrace ETS poklesla o 59,2 % za 8 hodin a zároveň došlo ke zvýšení hodnot kreatininu o 21,3 % a triglyceridů o 10,6 %. Závěr: Tyto výsledky ukazují přímou souvislost koncentrace ETS v krvi pacienta a interferencí vybraných parametrů stanovených metodou založené na Trinderově reakci a také popisují snížení interference v závislosti na skladování vzorku.

Studie byla podpořena projektem MUNI/A/1195/2014.

P-33

Normativní studie S100B a NSE v likvoru

Biomarkers of Brain Damage: S100B and NSE Concentrations in Cerebrospinal Fluid- A Normative Study

Hajduková L., Sobek O., Prchalová D., Bílková Z., Koudelková M., Lukášková J., Matuchová I.

Topelex s.r.o. Praha; Neurologické oddělení, Ústřední vojenská nemocnice v Praze; Ústav biologie a lékařské genetiky 2.LF UK a FN Motol v Praze; Ústav biochemie a mikrobiologie, VŠCHT v Praze; Klinická laboratoř Oblastní nemocnice Kladno, a.s.

e-mail: jirina.lukaskova@likvor.cz

S100 a NSE patří mezi tzv. strukturální proteiny CNS. Obecně jsou proteiny z této skupiny poměrně široce užívány jako specifické laboratorní markery tkáňového poškození CNS. Většina doposud publikovaných prací na toto téma se však zabývá stanovením koncentrací těchto proteinů v krvi, v souvislosti s poškozením CNS různé etiologie (vaskulární- ischemické, traumatické atd.). Vzhledem k těsnému anatomickému a funkčnímu vztahu mezi mozkem, míchou a likvorem, je přítomna vysoká koncentrace a výrazná dynamika strukturálních proteinů CNS právě v mozkomíšním moku. Tato studie se zabývá stanovením fyziologických koncentrací NSE a S100 v likvoru na dostatečně velkém souboru 601 pacientů.

Fyziologické hodnoty S100 a NSE v likvoru zjištěné v této studii jsou 0,304- 1,600 µg/l pro S100 a 3,50- 22,98 µg/l pro NSE.

Tyto upřesněné likvorové normální hodnoty mohou být následně uplatněny v klinické laboratorní diagnostice tkáňového poškození CNS.

P-34

Metabolické profilování vzorků plasem a leukocytů u pacientů s chronickou myeloidní leukémií

Metabolite profiling of plasma and leukocytes of chronic myeloid leukemia patients

Široká J., Karlíková R., Hrdá M., Friedecký D., Faber E., Mičová K., Gardlo A., Janečková H., Adam T.

Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University, Olomouc; Laboratory of Inherited Metabolic Disorders, University Hospital, Olomouc; Department of Clinical Biochemistry, University Hospital, Olomouc; Department of Hemato-Oncology, University Hospital, Olomouc; Department of Mathematical analysis, Palacky University, Olomouc

e-mail: radana.karlikova@gmail.com

Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disorder caused by constitutively active BCR-ABL tyrosine kinase. The objective of this work was to evaluate the influence of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) approved in the CML treatment to the overall plasma and leukocyte metabolite profiles in the patients.

Plasma and leukocyte samples were analysed by li-quid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. The statistical treatment of the data involved both unsupervised and supervised methods using R programme language.

152 metabolites in leukocytes and 124 metabolites in plasma were detected in 6 groups of samples: controls, newly diagnosed patients, patients treated with Imatinib, Dasatinib, Nilotinib and Hydroxyurea. The unsupervised method shows overlap of hydroxyurea treated with newly diagnosed in both plasma and leukocytes samples suggesting similar metabolomic composition. Leukocyte samples of patients using TKI (except Dasatinib) overlap controls and cluster far from newly diagnosed that indicates metabolome regulation towards the normal profile. Also plasma samples of patients treated with TKI overlap controls, but the separation from newly diagnosed is not as clear as in leukocytes.

We were able to demonstrate significant differences in metabolome between the patients and controls.

Grants: NT12218, CZ.1.05/2.1.00/01.0030, CZ.1.07/2.3.00/30.0004, CZ.1.07/2.3.00/20.0170, 1910-N26.

P-35

Lehké řetězce neurofilament a protilátky proti lehkým řetězcům u pacientů s roztroušenou sklerózou

Relationship between neurofilament light chains and antibodies against them in cerebrospinal fluid in patients with multiple sclerosis

Švarcová J., Fialová L., Bartoš A., Zimová D., Malbohan I., Illner J.

Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN Motol, Praha; Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN, Praha; Neurologická klinika 3. LF UK a FN Královské Vinohrady, Praha; Psychiatrické centrum 3. LF UK, Praha

e-mail: j.svarcova@centrum.cz

Při roztroušené skleróze (RS) dochází k demyelinizaci nervových vláken a jejich rozpadu. Hlavní složkou axonálního cytoskeletu jsou neurofilamenta (NF), která se skládají ze tří podjednotek: lehké (NF-L), středně těžké (NF-M) a těžké (NF-H). Detekce hladin NF v mozkomíšním moku (MMM) může sloužit jako marker axonálního poškození.

Cílem studie bylo porovnání hladin lehkých řetězců NF s hladinami neuron-specifických protilátek proti NF-L v MMM pacientů s RS metodou ELISA.

Vyšetřili jsme 94 vzorků MMM [39 pacientů s tzv. klinicky izolovaným syndromem (CIS), 23 pacientů mělo klinicky definitivní RS (RS) a 32 kontrol]. Koncentraci anti-NF-L protilátek jsme stanovili pomocí vlastní ELISA metody. Koncentrace NF-L byla stanovena komerčně dostupnou soupravou (NF-Light Neurofilament, Umea, Sweden).

Koncentrace NF-L v MMM byly statisticky významně zvýšené u všech skupin pacientů v porovnání s kontrolami (CIS-CIS: p < 0,0001; CIS-RS: p < 0,0005; RS: p < 0,0005). Hladiny anti-NF-L protilátek v MMM byly signifikantně zvýšené pouze u skupiny pacientů, kteří konvertovali z CIS do RS, v porovnání s kontrolami (p < 0,0001). Obdobně, stejná skupina pacientů vykazovala vyšší hladiny anti-NF-L v porovnání s RS (p < 0,005).

Oba měřené parametry (NF-L, anti-NF-L) mohou naznačovat následný přechod do klinicky definitivní formy RS.

Tato práce vznikla za podpory IGA MZ NS 10369-3, IGA MZ NT 13183, PRVOUK P34/LF3 a P25/LF1/2.

P-36

Diagnostický algoritmus karcinomu prostaty pomocí výpočtu Indexu zdravé prostaty (PHI)

The Diagnostic Algorithm for Prostate Cancer using Prostate Health Index (PHI)

Fuchsová R., Topolčan O., Dolejšová O., Hora M., Kučera R., Eret V., Ferda J.

Laboratoř imunodiagnostiky, Urologická klinika, Klinika zobrazovacích metod, FN a LF Plzeň

e-mail: fuchsovar@fnplzen.cz

Cíl: Optimalizovat algoritmus časné diagnostiky karcinomu prostaty

Metody: Vyšetřili jsme hladiny PSA a PHI u souboru cca 1000 osob. Výsledky byly korelovány s nálezy bioptického vyšetření a zobrazovacích metod.

Výsledky: Byl navržen vícestupňový algoritmus časné diagnostiky karcinomu prostaty, kde základem je stanovení PSA a výpočet PHI. Různým hladinám těchto vyšetření odpovídá využití nejnovějších dostupných zobrazovacích metod fúzní 3T magnetické rezonance (MRI) a transrektální sonografií (TRUS) a PET/MRI. V současné době probíhá validace tohoto algoritmu v praxi.

Závěr: Navržený algoritmus by měl mít zdravotnicko-ekonomický dopad. Povede především snížení počtu nadbytečných biopsií a rebiopsií u pacientů s benigní hyperplasií a na druhé straně zrychlí a zkvalitní péči o pacienty vhodné ke kurabilní léčbě diagnostikovaného karcinomu prostaty.

Tato studie byla podpořena z projektu Ministerstva zdravotnictví České republiky Institucionální podpora na dlouhodobý koncepční rozvoj výzkumné organizace 00669806 – FN Plzeň a SVV 260 176.