Charakteristika molekuly PCSK9 a její klinický význam

Súhrn

Cíl studie: Představit molekulu proprotein konvertázy subtilisin/kexin typu 9 (PCSK9/NARC1), která se významně podílí na lipidovém metabolismu, popsat její chemickou strukturu a vlastnosti, její úlohu v metabolismu a v neposlední řadě i klinický význam.

Typ studie: literární rešerše.

Název a sídlo pracoviště: Institut klinické a experimentální medicíny, Vídeňská 1958/9, 140 21 Praha 4

Závěr: Molekula PCSK9 se díky své významné úloze v lipidovém metabolismu stává velice zajímavým a důležitým stanovovaným analytem napříč klinickými obory.

Klíčová slova:

PCSK9 – LDLR – lipidový metabolismus – doména – degradace – mutace

Úvod

PCSK9 patří do skupiny serinových proteáz (konvertáz), které aktivují neaktivní proproteiny na proteiny biologicky aktivní odštěpením části řetězce, čímž odkryjí aktivní místo molekuly. Druhá část názvu subtilisin/kexin je odvozena od názvů enzymů bakteriální (subtilisin) a kvasinkové (kexin) stěny, s nimiž mají proteázy společné aktivní místo obsahující aminokyseliny (AA) aspartát (Asp), Histidin (His) a Serin (Ser) [1].

Lze klasifikovat celkem devět proproteinových konvertáz (PC). Sedm z nich jsou enzymy, jejichž funkcí je aktivace/inaktivace polypeptidů, hormonů, růstových faktorů a jejich receptorů. Aktivace probíhá štěpením vazby na jednoduchých nebo párových bazických aminokyselinách [2]. Do této skupiny patří PC1 (PCSK1), PC2 (PCSK2), furin (PCSK3), PC4 (PCSK4), PC5 (PCSK5), PACE4 (PCSK6) a PC7 (PCSK7) [3]. Názvy jednotlivých konvertáz jsou odvozeny podle genů, které je kódují, například gen kódující furin je FURIN [2]. Dalším členem je subtilisin kexin izoenzym (SKI-1/S1P, PCSK8), který aktivuje membránové transkripční faktory a ovládá, jako jeden z hlavních enzymů, syntézu mastných kyselin a cholesterolu. Kromě uvedených funkcí se spolupodílí na udržení lipidové homeostázy organismu. Posledním enzymem v této skupině je již zmíněná PCSK9, která negativně reguluje hladinu LDL cholesterolu (LDLC). PCSK9 a SKI-1 ovlivňují lipidový metabolismus štěpením receptorů na nebazických zbytcích nebo prostřednictvím indukované degradace [2, 4].

Struktura PCSK9

Gen pro lidskou PCSK9 je lokalizován na prvním chromozomu (1p32.3) [2, 5, 6]. Tento gen je 22-kb dlouhý a obsahuje 12 exonů kódujících 692 aminokyselin (AA) [2, 7]. Jde o glykoprotein o velikosti 74 kDa, který je syntetizován v hrubém endoplazmatickém retikulu (ER) hepatocytu. PCSK9 je produkována v několika tkáních, a to nejvíce v játrech, v tenkém střevu a ledvinách. Byla také detekována v cerebrospinální tekutině a aterosklerotických plátech [7].

Celý enzym PCSK9 se dá rozdělit celkem do čtyř domén o různém počtu aminokyselin. Autoři uvádějí rozdílná zastoupení AA v jednotlivých doménách dle krystalové struktury. Podle Seidah et al. [8] je zastoupení AA v jednotlivých doménách následující:

•  signální peptid (1-30 AA, kódovaný exonem 1),
• prodoména (31-152 AA, kódovaná exony 1-3),
•  katalytická doména (153-421 AA, kódována exony 3-8) a krátký úsek, tzv. hinge region o 18 AA (HR, 422-439 AA, kódovaný exony 8-10),
•  C-terminální doména, která je bohatá na cysteinové (Cys) a histidinové (His) zbytky (CHRD, 440-692 AA, kódována exony 10-12) [8, 18] (obr 1).

V katalytické doméně jsou obsažena tzv. aktivní místa, která jsou typická pro proteinázy typu K. Jsou to AA Asp₁₈₆, His₂₂₆ a Ser₃₈₆ [2, 9]. V poslední uvedené doméně CHRD můžeme rozlišit tři úseky o různém množství a zastoupení jednotlivých AA: M1, M2 (obsahuje 9 His z celkových 14 v celé CHRD doméně) a M3 [9, 10]. Úseky M1 a M3 jsou zodpovědné za dozrání a sekreci PCSK9 a úsek M2 za degradaci LDL-receptoru (LDLR) [11]. Každý z těchto úseků obsahuje tři disulfidické vazby mezi 1. a 6. Cys, 2. a 5. Cys a 3. a 4. Cys [9, 10, 12]. C-terminální doména obsahuje tři šestivláknové domény, které jsou uspořádané do struktury β-listů a utváří trojrozměrnou symetrii. U této domény se spekuluje o tom, že zprostředkovává protein-protein interakce [9, 10, 12, 13].

Jak už bylo uvedeno, primární struktura PCSK9 v nativní formě je syntetizována v hrubém ER hepatocytu. Zde je odstraněna signální sekvence (1-30 AA) pomocí signální peptidázy a vzniká zymogen proPCSK-9 (31-692 AA) o velikosti 74 kDa. V tomto uspořádání podstupuje proPCSK9 autokatalytické štěpení, při kterém dojde ke štěpení vazby v místech mezi 152. a 153. AA (mezi glutaminem Gln a serinem Ser) a vznikají tak dva segmenty, prosegment (31-152 AA) o velikosti 14 kDa a PCSK9 (153-692 AA) o velikosti 60 kDa, které jsou mezi sebou spojeny nekovalentní vazbou. Místo štěpení je označeno VFAQ↓₁₅₂SIP, kde VFAQ SIP znamená označení aminokyselin: Val-Phe-Ala-Gln₁₅₂↓Ser-Ile-Pro [4, 7-9, 14].

Prosegment se váže na aktivní místo katalytické domény molekuly PCSK9, a tím zabrání PCSK9 navázat se na jiné substráty; je enzymaticky inaktivní [8, 11, 14]. Tento komplex je transportován z ER do Golgiho aparátu (GA), odkud je uvolňován na buněčný povrch hepatocytu, kde se váže na cílové proteiny, například na LDL-receptor (LDLR) nebo je dále uvolňován do krevního řečiště [2, 8, 9, 11]. Funkcí vzniklého komplexu prosegment≡PCSK9 je vazba na specifické cílové proteiny a jejich buněčná degradace [8, 11]. Autokatalýza PCSK9 je nutná nejen k aktivaci molekuly, ale také k jejímu uvolnění z ER [14, 15].

Funkcí prodomény (prosegmentu) je alosterická blokace aktivních míst obou zbývajících domén. Jejím odstraněním dojde k odkrytí aktivních míst a až k 10x vyšší afinitě PCSK9 na LDLR, což vede až ke 4x rychlejší degradaci tohoto receptoru. V tomto úseku dochází k častým mutacím, které mohou ovlivnit správnou funkci prodomény, a tím i celé molekuly PCSK9. Prosegment je tedy faktor, který reguluje účinek PCSK9 uvolněním katalytické domény [13, 16].

PCSK9 může být dále štěpena některými dalšími enzymy, např. furinem a PC5/6A, na pozici ²¹⁸Arg a vznikne tak úsek o velikosti 53 kDa. Tato zkrácená PCSK9 má nižší afinitu vůči LDLR. Obě formy PCSK9 mohou být detekovány jak v lidské plazmě, tak u myší [17].

Struktura LDLR

LDLR je transmembránový glykoprotein, který byl poprvé identifikován v roce 1974 [18]. Jeho hlavní funkcí je odstranění lipoproteinů obsahujících cholesterol a apolipoprotein B (apoB) z cirkulace. Gen pro tento receptor je lokalizovaný na chromozomu 19p13.1 – 13.3 a je přibližně 45 kb dlouhý [6]. Celkově je gen pro LDLR kódován 18 exony a tvoří ho přibližně 839 AA, které jsou uspořádány celkem do pěti domén [19]:

•  první je ligand-vázající doména na N-terminálním konci proteinu (obsahuje 322 AA), která se dále dělí na sedm částí R1-R7, které jsou bohaté na cysteiny. Každá z R částí obsahuje 40 AA a tři atomy vápníku, které jsou nezbytné pro protein-proteinové interakce [13, 19, 24, 29],
•  druhou doménou je epidermální růstový faktor (EGF, je složen přibližně z 350 AA) [19]. Jde o prekurzor homologní domény, který obsahuje dvojici opakujících se domén EGF-A (40 AA) a EGF-B (40 AA), které jsou od domény EGF-C (40 AA) odděleny β-šroubovicovou doménou [20]. Tento úsek obsahuje 280 AA a spolupodílí se na uvolnění lipoproteinů z vazby v kyselém pH [20],
•  následuje doména vázající sacharid přes hydroxylovou skupinu (OH) serinu (Ser) nebo threoninu (Thr), obsahující 48 AA [19]. Tento úsek není zahrnut do navazování ligandů, internalizace a recyklace receptoru [19],
•  předposlední doménou je transmembránová (cytosolová) doména (TM) obsahující 22 AA,
•  poslední je cytosolový zbytek (cytoplazmatický ocas), který obsahuje 50 AA a je nezbytný pro správnou internalizaci receptoru [19] (obr. 2). LDLR se syntetizuje v ER a jeho molekulová hmotnost je 120 kDa. Z ER se LDLR transportuje do GA, kde postupně dochází ke glykosylacím a na povrchu buňky se formuje zralý glykoprotein o molekulové hmotnosti 160 kDa, který je schopen na sebe navázat LDLC a další lipoproteiny obsahující apolipoprotein B (apoB) a podstoupit proces endocytózy [18, 21].

Úloha PCSK9 a LDLR v metabolismu

Existují dvě metabolické dráhy PCSK9, a to intracelulární a extracelulární. Při vnitrobuněčné cestě uvolněná PCSK9 z GA interaguje přímo s LDLR a vzniklý komplex je transportován přímo do lysozomu, kde dochází k jeho degradaci. Při extracelulární dráze je PCSK9 uvolněna na povrch hepatocytu, kde se naváže na LDLR. Odtud je tento komplex internalizován do endozomu a následně do lysozomu, kde dojde k degradaci [11, 22, 23].

Cyklus LDLR

Na buněčné stěně dojde k otevření konformace ligand-vázající domény, a tím je umožněno navázání lipoproteinů na LDLR [24]. Cytosolová doména LDLR obsahuje sekvenci aminokyselin FDNPVY (F-Fenylalanin, D-Aspartát, N-Asparagin, P-Prolin, V-Valin, Y-Tyroxin), která je nutná pro rychlou endocytózu zprostředkovanou přes váčky pokryté klatrinem (clathrin-coated pits) [25, 26]. Internalizace vzniklého komplexu LDLR≡LDLC do hepatocytu je kontrolována pomocí LDL receptorového adaptorového proteinu (LDLRAP1/ARH) [6], který je můstkem mezi LDLR a klatrinem [27]. Po endocytóze je komplex transportován do endozomu. Kyselé pH endozomu způsobí změnu konformace LDLR, a to tím, že β-šroubovicová doména uzavírá „otevřenou“ ligand-vázající doménu, což má za následek odštěpení lipoproteinové částice z komplexu [24, 26, 28].

Tato částice následně putuje do lysozomu, kde je pomocí cholesterol esterázy hydrolyzována na cholesterol a volné mastné kyseliny a proteinová část lipoproteinu je dále degradována na aminokyseliny [26].

LDLR se recykluje a vrací se zpět na povrch membrány, pokud není zachycen PCSK9 v intracelulární metabolické dráze, viz výše. Takto se může recyklovat až 150x [24, 26].

Komplex PCSK9≡LDLR

Mechanismus vazby PCSK9 na LDLR probíhá přes EGF-A doménu tohoto receptoru na buněčné stěně hepatocytu při neutrálním pH [29]. Při snížení pH ze 7,0 na 5,2 vzroste afinita PCSK9 k LDLR až 50x, proto je vazba komplexu LDLR≡PCSK9 po internalizaci do buňky mnohem silnější [29]. V kyselém prostředí prodoména stabilizuje solné můstky s β-šroubovicovou doménou LDLR a pozitivně nabitá CHRD doména se váže na záporně nabitou ligand-vázající doménu LDLR. Tím dojde k blokaci receptoru a tato otevřená konformace LDLR brání zpětné recyklaci LDLR na povrch membrány a receptor směřuje do lysozomu, kde je degradován [28, 29].

Ve studii in vitro bylo zjištěno, že jedním ze spouštěčů degradace LDLR v lysozomu je vznik dimeru PCSK9, který vzniká mnohem snadněji v kyselém prostředí lysozomu než v neutrálním prostředí a zvyšuje degradaci LDLR oproti monomeru PCSK9. Zdá se, že katalytická doména PCSK9 sehrává významnou roli při vzniku polymeru, při aktivaci molekuly, správném složení a sekreci, ale neovlivňuje degradaci LDLR [30].

Reakce PCSK9 s apolipoproteinem B (apoB)

H. Sun a kol. [31] ve své studii ukázali, že dlouhodobá exprese proteinu PCSK9 u myší vede ke zvýšené koncentraci plazmatického cholesterolu, triacylglycerolů (TAG) a apoB bez ohledu na přítomnost LDLR. H. Sun a kol. [31] popsali přímou interakci mezi PCSK9 a apoB za fyziologických podmínek nezávisle na LDLR [31]. Při této interakci je zabráněno degradaci apoB, který může být odbouráván dvěma hlavními metabolickými cestami, a to buď přes proteazom nebo přes autofagozomy/lysozomy a roste tak jeho koncentrace v krvi [32].

ApoB100 je primárně exprimován v játrech. Skládá se celkem ze 4536 AA, z toho je 25 Cys (16 z nich je součástí disulfidické vazby) a 20 tvoří glykosidickou vazbu přes N konec AA [33]. Kromě apoB100 existuje i zkrácená forma apoB48, která je exprimována kromě jater také ve střevě [33]. Tato zkrácená forma vzniká při post-transkripční modifikaci apoB mRNA na kodonu 2153, který přenáší glutaminový kodon jako stop kodon ve 48 % délky apoB100. Oba apoB obsahují amfipatické NH2 domény a hydrofobní domény složené z β-listů [33]. ApoB100 navíc obsahuje α-helikální úsek, další doménu složenou z β-listů a další α-helikální doménu [33].

Mutace PCSK9

Můžeme rozlišit dva základní typy mutací v molekule PCSK9. Jedním z nich je tzv. gain-of-function mutace (GOF), při které dochází ke snížení koncentrace LDLR a následně navýšení koncentrace LDLC v krvi [8]. Tento typ mutace se fenotypově projeví jako familiární hypercholesterolémie (FH) [9, 34]. Druhý typ, tzv. loss-of-function mutace (LOF), vede k navýšení koncentrace LDLR, a tím se urychlí vychytávání LDLC z krve a sníží se jeho koncentrace. Tato mutace má charakter ochrany před koronárními chorobami [8, 9, 34].

GOF mutace může být způsobena zařazením jiné AA v nukleotidu, jedná se o tzv. missense mutaci. V tomto případě dojde k záměně buď na 374. AA (D374Y) nebo na 127. AA (S127R) [34].

Mutace D374A zvyšuje afinitu vazby PCSK9 na LDLR. Aminokyseliny, které mohou být zařazeny v nukleotidu na místo ³⁷⁴Asp jsou Tyr, Ala, Glu, Phe, Lys nebo Leu. Mutace na ¹²⁷Ser (S127R) nemá přímý vliv na sílu vazby PCSK9 na LDLR, ale urychluje vychytávání LDLR, a tím způsobuje navyšování koncentrace LDLC [34]. Aminokyseliny, které mohou nahradit Ser na pozici 127 v nukleotidu, jsou Arg, Ala, Asp, Lys, Leu a Thr [9,34]. Kombinace obou mutací má aditivní účinek na funkci PCSK9 [34].

LOF mutace může být způsobena buď missense mutací (R46L, L253F, A433T) nebo nonsense mutací (Y142x a C679x), které jsou asociovány s nízkými koncentracemi LDLC a se sníženým rizikem aterosklerózy [9,34].

Objev obou typů mutací a jejich působení na metabolismus lipidů vedly k vývoji protilátek blokujících PCSK9. Tyto protilátky jsou dnes v klinickém použití, zatím jsou k dispozici dvě blokující molekuly – alirocumab a evolocumab. Měření koncentrace PCSK9 může pomoci stratifikovat riziko rozvoje aterosklerózy u pa-cientů a přispět k objasnění efektu terapie.

Závěr

Molekula PCSK9 byla objevena teprve nedávno, ale její významná úloha v lipidovém metabolismu je zřejmá. Z tohoto důvodu je testována a zkoumána napříč klinickými obory včetně farmaceutického odvětví. Stanovení této molekuly má velký potenciál a do budoucna bude jistě součástí běžného vyšetření.

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů

Do redakce došlo 22. 8. 2019

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Tereza Vacková

Oddělení klinické biochemie

Pracoviště laboratorních metod

Institut klinické a experimentální medicíny

Vídeňská 1958/9

140 21 Praha 4

E-mail: vact@ikem.cz